鈦合金抗菌界面的構(gòu)建本科畢業(yè)設(shè)計.doc

重慶大學(xué)本科學(xué)生畢業(yè)設(shè)計（論文） 鈦合金抗菌界面的構(gòu)建 學(xué) 生：何浩學(xué) 號：20116925指導(dǎo)教師：劉鵬 專 業(yè)：生物工程重慶大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程聯(lián)合學(xué)院二O一五年六月Graduation Design(Thesis) of Chongqing Universityconstruction of Titanium alloy antibacterial interface矚慫潤厲釤瘞睞櫪廡賴。Undergraduate: HeHaoSupervisor: Prof.LiuPeng Major: BioengineeringBioengineering College ofChongqing UniversityJune 2015重慶大學(xué)本科學(xué)生畢業(yè)設(shè)計（論文） 摘要 摘 要鈦及其合金材料由于其良好的生物相容性和力學(xué)特性廣泛用作骨科植入物。然而，鈦基植入材料的術(shù)后感染已經(jīng)成為其臨床手術(shù)失敗的一個重要原因。嚴重的細菌感染染甚至導(dǎo)致重復(fù)手術(shù)。因此，開發(fā)具有長期抗菌功能的鈦基植入材料對于其臨床成功植入具有重要意義。本文旨在利用層層自組裝技術(shù)在鈦材表面構(gòu)建含鋅離子的涂層，以期改善鈦基植入材料的抗菌性能。本文具體包含如下研究內(nèi)容：聞創(chuàng)溝燴鐺險愛氌譴凈。 1）在鈦合金表面通過層層自組裝技術(shù)對鈦材進行表面改性，以陽離子的聚乙烯亞胺作為第一層，然后按明膠/殼聚糖/Zn離子溶液的順序鋪膜，構(gòu)建含鋅離子的抗菌涂層?？咕繉拥谋砻嫘蚊埠驮亟M成通過掃描電鏡和EDS能譜進行了表征。測定結(jié)果表明：本次實驗通過層層自組裝技術(shù)在鈦合金表面成功的構(gòu)建了含鋅離子的抗菌涂層。殘騖樓諍錈瀨濟溆塹籟。 2）在本論文中，金黃色葡萄球菌被用于未處理的鈦材和層層自組裝技術(shù)處理后的鈦材的抗菌性能評價。通過抑菌圈實驗，抑菌率和耐受性實驗考察了材料的抗菌性。實驗結(jié)果顯示：層層自組裝技術(shù)處理后的鈦材表面有效降低了細菌的粘附和生長。釅錒極額閉鎮(zhèn)檜豬訣錐。本論文研究成果初步表明：層層自組裝技術(shù)在鈦材表面構(gòu)建含鋅離子的抗菌涂層，改善了鈦基植入材料的抗菌性能，研究成果為鈦及其合金在骨組織修復(fù)方面的應(yīng)用提供了堅實的基礎(chǔ)。彈貿(mào)攝爾霽斃攬磚鹵廡。關(guān)鍵詞：鈦基材料，層層自組裝技術(shù)，鋅離子，抗菌涂層，金黃色葡萄球菌I重慶大學(xué)本科學(xué)生畢業(yè)設(shè)計（論文） abstractABSTRACTTitanium and its alloy material due to its good biocompatibility and mechanical properties are widely used as orthopaedic implants. However, postoperative infection of titanium implant material has become the one of the important reasons for the clinical surgery failure. Serious bacterial infection of dye even lead to repeat the operation. Therefore, development with long-term antibacterial function of titanium implant material implant is of great significance to the clinical success. The purpose of this paper is to use layers of self-assembly technology in titanium coating on the surface building zinc ions in order to improve the antibacterial properties of titanium implant material. The present work contains the following aspects:謀蕎摶篋飆鐸懟類蔣薔。 1. Through layer upon layer on titanium alloy surface self-assembly technology for surface modification of titanium, with cationic polyethyleneimine as the first layer, and then press gelatin/chitosan/zinc ions is the order of the membrane, build antibacterial coating containing zinc ions.Antimicrobial coating surface morphology and elemental composition by scanning electron microscopy (sem) and EDS spectrum characterization. Determination results show that this experiment through layer upon layer self-assembly technology in titanium alloy surface and the success of the building containing zinc ions antibacterial coating.廈礴懇蹣駢時盡繼價騷。 2. In this thesis, staphylococcus aureus was used for untreated titanium and layers of self-assembly technology after processing of titanium antibacterial performance evaluation. Through the bacteriostatic circle experiment, antibacterial rate and tolerance experiment investigates the antimicrobial properties of the material. Experimental results show that after processing of titanium surface layers of self-assembly technology effectively reduces the adhesion and growth of bacteria.煢楨廣鰳鯡選塊網(wǎng)羈淚。 This paper preliminary research results show that the layers of self-assembly technique in titanium surface antibacterial coating containing zinc ions, improved the antibacterial properties of titanium implant material, the research for the application of titanium and its alloys in bone tissue repair provides a solid foundation. 鵝婭盡損鵪慘歷蘢鴛賴。Key words：titanium based materials, layer-by-layer self-assembly, Zinc Ion,籟叢媽羥為贍僨蟶練淨(jìng)。IIAntimicrobial coating, Staphylococcus aureus I重慶大學(xué)本科學(xué)生畢業(yè)設(shè)計（論文） 目錄 目錄摘 要I預(yù)頌圣鉉儐歲齦訝驊糴。ABSTRACTII滲釤嗆儼勻諤鱉調(diào)硯錦。1.1生物醫(yī)用鈦材的發(fā)展現(xiàn)狀11.2課題引入22 鈦合金抗菌涂層的構(gòu)建4 2.1簡介42.2材料與方法52.2.1材料與設(shè)備52.2.2層層自組裝構(gòu)建涂層52.2.3表面特征62.2.4涂層耐腐蝕性能測試62.3結(jié)果與討論62.3.1涂層分析72.3.2結(jié)論83 改性后鈦材的抗菌能力評估83.1簡介103.2材料與方法11鐃誅臥瀉噦圣騁貺頂廡。3.1.1材料與設(shè)備11擁締鳳襪備訊顎輪爛薔。3.1.2細菌的培養(yǎng)12贓熱俁閫歲匱閶鄴鎵騷。3.1.3細菌電鏡樣品的制備13壇摶鄉(xiāng)囂懺蔞鍥鈴氈淚。3.2抗菌性能測試13蠟變黲癟報倀鉉錨鈰贅。3.2.1抑菌圈實驗13買鯛鴯譖曇膚遙閆擷凄。3.2.2抑菌率實驗14綾鏑鯛駕櫬鶘蹤韋轔糴。3.2.3材料耐受性測試14驅(qū)躓髏彥浹綏譎飴憂錦。3.3 結(jié)果與討論15貓蠆驢繪燈鮒誅髏貺廡。3.3.1電鏡分析15鍬籟饗逕瑣筆襖鷗婭薔。3.3.2抑菌圈實驗分析15構(gòu)氽頑黌碩飩薺齦話騖。3.4 結(jié)論17輒嶧陽檉籪癤網(wǎng)儂號澩。4 總結(jié)18堯側(cè)閆繭絳闕絢勵蜆贅。4.1 全文綜述18識饒鎂錕縊灩筧嚌儼淒。4.2致謝19凍鈹鋨勞臘鍇癇婦脛糴。 重慶大學(xué)本科學(xué)生畢業(yè)設(shè)計（論文） 緒論 1 緒論1.1生物醫(yī)用鈦材的發(fā)展現(xiàn)狀中國是一個擁有13 億人口的大國，也是一個骨組織修復(fù)材料的需求大國。僅以人工關(guān)節(jié)為例，據(jù)統(tǒng)計我國大約有1500萬人患有關(guān)節(jié)疾病，每年人工關(guān)節(jié)的需求量約為3040萬支，按平均20000元/裝置計算，總產(chǎn)值為6080億1。然而我國臨床使用的骨修復(fù)植入體/裝置大部分依賴于國外進口，因此開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型骨修復(fù)植入體（含人工關(guān)節(jié)）產(chǎn)品，具有很大的市場潛力，將產(chǎn)生良好的經(jīng)濟效益，同時將會造福于人類健康，帶來巨大的社會效益。近年來，隨著醫(yī)療水平的不斷提高，越來越多的病患接受了內(nèi)固定和人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)，各類內(nèi)外植入材料的使用率日益上升。恥諤銪滅縈歡煬鞏鶩錦。生物醫(yī)用材料是用于取代或修復(fù)人體原活組織的材料，它可以是天然的或者人造的。近年來，隨著人們生活水平的提高，對于生活質(zhì)量的要求越來越高；越來越多受意外創(chuàng)傷、運動創(chuàng)傷、疑難病癥以及需要替換組織的患者接受了內(nèi)固定和人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)，各種生物醫(yī)用材料的使用率增長迅速。因此生物材料領(lǐng)域在當今社會是備受關(guān)注的，它的發(fā)展對于人們生活質(zhì)量的提高具有顯著的影響2。而隨著材料學(xué)和生物學(xué)的研究深入，讓我們對生物醫(yī)用材料有了新的認識。目前,生物醫(yī)用材料分為金屬、高分子、無機非金屬或陶瓷、復(fù)合材料等。在生物醫(yī)用金屬材料中，主要有不銹鋼、鈦及鈦合金、鈷基合金等幾大類型。其中鈦及鈦合金與傳統(tǒng)不銹鋼材料相比，它具有良好的耐腐蝕性能和組織相容性。鯊腎鑰詘褳鉀溈懼統(tǒng)庫。 伴隨著物理、生物、化學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展，尤其在臨床生物醫(yī)用材料不斷研發(fā)和使用的當下，金屬材料已成為醫(yī)用外植物不可或缺的基本材料。良好的耐腐蝕性能以及優(yōu)異的綜合理化性能，使得多種金屬材料運用于臨床醫(yī)學(xué)，在眾多材料中，鈦合金因其優(yōu)異的理化特性而成為研究的熱點。 碩癘鄴頏謅攆檸攜驤蘞。 人類生物醫(yī)學(xué)發(fā)展史上最早是運用金屬材料來實現(xiàn)機體的創(chuàng)傷修復(fù)和矯形治療。但由于醫(yī)用不銹鋼、鈷鉻合金在二戰(zhàn)初期已開始盛行，鈦材料運用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展比較滯后。最早將鈦作為外植體的案例是將純鈦作為口腔外植體，之后純鈦作為外植體材料得到了廣泛發(fā)展3。隨后鈦合金也開始在臨床上被運用作股骨和脛骨替換材料3。進入21世紀后，由于鈦合金材料良好的綜合理化性能用鈦材做成的醫(yī)療植入物，被廣泛的用于牙科，骨科和心血管領(lǐng)域。伴隨著自然科學(xué)與生命科學(xué)的快速發(fā)展，材料科學(xué)也得到了蓬勃的發(fā)展，尤其是在臨床生物醫(yī)用材料的研發(fā)和使用方面。其中對金屬材料作為醫(yī)用外植體的研究已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)治療中不可或缺的重要分支4。 閿擻輳嬪諫遷擇楨秘騖。 通常在鈦合金材料植入體后, 鈦合金與人體內(nèi)環(huán)境中的無機鹽、蛋白質(zhì)、有機酸和堿金屬等長時間接觸，機體內(nèi)某些物質(zhì)可能會誘導(dǎo)金屬腐蝕, 使材料中所含的金屬離子溶解出來, 游離的金屬離子進入人體組織細胞，影響其中的正常生化反應(yīng), 同時, 鈦合金腐蝕所產(chǎn)生的物質(zhì)和電流可能會激活組織, 使人體的物質(zhì)代謝發(fā)生改變67。另外,雖然正常情況下人體體液呈中性, 但在受傷或組織感染之后, 病變組織周圍的pH會低至5 左右, 在鈦合金材料植入時，植入材料部位處于酸性環(huán)境之中, 鈦合金材料會加快腐蝕8。所以, 當鈦合金材料用于心血管系統(tǒng)和血液接觸時,應(yīng)該慎重考慮材料與血液中各成分的相互作用, 以此來提高材料與血液的相容性。這就要求對鈦合金材料進行功能需求的表面工程改性技術(shù)。氬嚕躑竄貿(mào)懇彈瀘頷澩。1隨著表面工程技術(shù)不斷完善和發(fā)展，已經(jīng)產(chǎn)生了各種不同的表面改性技術(shù),如：電化學(xué)處理、化學(xué)蝕刻、熱處理、離子注入、激光、電子束輻射及各種涂層。這些技術(shù)旨在外植物材料表面創(chuàng)造一個均一的,具有一定厚度的涂層,其不僅能作為一個屏障,而且還可以提高材料的生物學(xué)性能9。對鈦合金材料進行表面修飾后，涂層與基底結(jié)合的牢固性是材料表面改性成功與否的重要指標。通過傳統(tǒng)表面工程技術(shù)制備的涂層，往往較厚，與基材的結(jié)合力差，在鈦合金形變過程中，容易脫落，難以達到預(yù)期效果。在金屬表面改性過程中，往往要包括使用各種160 和600 之間的各種溫度進行(熱處理、激光和電子束熔煉、離子注入)處理，通常熱處理合金會影響其形狀記憶性能和超彈性9。由于上述處理會使材料表面組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致鈦合金植入物中金屬離子釋放量亦隨之顯著變化。因此，在對鈦合金進行表面進行處理時，應(yīng)該盡量減少影響，以減少材料的毒性。釷鵒資贏車贖孫滅獅贅。 1.2課題引入陽極氧化技術(shù)是一種新興的表面改性技術(shù)，實現(xiàn)對材料的表面改性相對簡單。陽極氧化技術(shù)對設(shè)備的要求僅僅為簡單的電源及冷卻系統(tǒng)，不需要真空或者高溫、低溫控制設(shè)備，其處理步驟簡單、效率高、處理能力強，此技術(shù)作為一種非線性的表面處理技術(shù)，可以加工復(fù)雜形狀的工件10。陽極氧化技術(shù)與其它鈦合金表面處理方法相比優(yōu)點明顯：1.加工時間短，不會改變基材本身的相結(jié)構(gòu)，保持了基材本身的優(yōu)異性能；2.可以根據(jù)不同的實際需要，選擇不同組成的電解液，改變實際工藝參數(shù)，調(diào)節(jié)涂層的表面形狀和微觀結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，化學(xué)或電化學(xué)方法處理的表面改性技術(shù)能提供各種厚度1 m的涂層，并且涂層在形變過程不易脫落。然而陽極氧化技術(shù)作為一種表面改性技術(shù)對于材料本身的細胞響應(yīng)性和骨整合性能的提高，作用十分有限。慫闡譜鯪逕導(dǎo)嘯畫長涼。 上世紀90年代，Decher11等人提出了基于帶正負電荷的聚電解質(zhì)逐層組裝技術(shù)制備涂層。層層自組裝技術(shù)作為一種先進的表面工程技術(shù)為生物材料的表面修飾提供了一條新途徑。是一種多功能，高效率，容易實現(xiàn)，可處理多種表面的功能化的表面處理技術(shù)。層層組裝技術(shù)操作簡單，不受基材尺寸、形狀及性質(zhì)的限制，對于基質(zhì)表面的化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能基團沒有特殊要求，適合于具有復(fù)雜表面形貌的基材；在涂層構(gòu)建中無需提供外加能量，可以使用各種活性生物大分子（核酸、蛋白質(zhì)、多肽等）、天然高分子和納米粒子制作為組裝的基本單元，能夠?qū)ν繉拥男蚊?、厚度、化學(xué)性質(zhì)和模量等進行自由調(diào)節(jié)；在操作過程中不需要特殊的裝置，只要依照特定順序?qū)⒒脑趦煞N聚電解質(zhì)溶液中交替浸泡后，水洗，干燥，即可完成多種功能單元的組裝，實現(xiàn)多種物質(zhì)的層層自組裝；層層自組裝涂層制備技術(shù)簡單方便，有望實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；與傳統(tǒng)的涂層制備技術(shù)相比，層層自組裝技術(shù)所具有的上述優(yōu)點使其更加適合于材料表面生物活性涂層的構(gòu)建12。 諺辭調(diào)擔(dān)鈧諂動禪瀉類。 本試驗欲在鈦合金材料表面通過陽極氧化與層層自組裝技術(shù)對鈦合金材料進行表面改性，使鈦合金材料具備優(yōu)異的抗菌性能。那么抗菌離子的選取成為了本次試驗的關(guān)鍵。嘰覲詿縲鐋囁偽純鉿錈。 目前金屬離子抗菌的應(yīng)用前景最廣泛的是銀系，銅系，鋅系，其中銀離子的綜合殺菌能力最優(yōu)，但由于銀離子的價格高昂，對比具有較強抗菌性能的銅離子、鋅離子就失去了優(yōu)勢。研究表明同種抗菌劑處理的不同菌體，抗菌效果是不同的，因為不同細菌細胞壁的厚度和化學(xué)成分有差異13。細胞的基本結(jié)構(gòu)中細胞壁在最外層，如果細胞壁受到損傷，細胞便難以生長，甚至?xí)劳?。本試驗綜合試驗要求與自身試驗條件選取了鋅離子作為抗菌劑，其原因如下：熒紿譏鉦鏌觶鷹緇機庫。鋅元素是機體生命活動必需微量元素之一。鋅元素對全身骨骼的生長和發(fā)育起到重要作用。同時鋅元素在維持骨骼生理結(jié)構(gòu)功能方面也扮演著重要的角色。其主要生理功能: 鶼漬螻偉閱劍鯫腎邏蘞。 1.鋅元素是細胞的重要組成，其對維持細胞結(jié)構(gòu)與生理功能有著重要作用，鋅元素能催化體內(nèi)活性因子參與機體的化學(xué)反應(yīng)。紂憂蔣氳頑薟驅(qū)藥憫騖。 2.鋅參與了多種酶的合成，而酶在細胞內(nèi)代謝及信息傳遞中起到了關(guān)鍵作用人體的許多生命物質(zhì)中都含有鋅，如DNA聚合酶,、RNA聚合酶、淡膚酶、胸腺嗯陡普激酶、堿性磷酸酶、碳酸醉酶等200多種酶的組成或激活因子都含有鋅元素14。鋅元素也可以直接參與核酸、蛋白質(zhì)等的合與組織代謝。如果含鋅元素的酶活性降低，會導(dǎo)致半肌氨酸、賴氨酸等的代謝發(fā)生紊亂，谷氨酸的合成也會減少，腸粘液蛋白和締結(jié)組織蛋白合成過程受阻。穎芻莖蛺餑億頓裊賠瀧。 3.鋅是各種器官組成的重要成分:鋅元素是構(gòu)成多種蛋白質(zhì)所必需的，而蛋白質(zhì)又是人體中各組織器官的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此鋅是各種器官組成的重要成分。同時，鋅離子是一種優(yōu)秀的無機殺菌劑，鋅離子相比于同樣具有良好殺菌性的銀離子有明顯的價格優(yōu)勢。濫驂膽閉驟羥闈詔寢賻。綜上所訴，最終確定了以層層自組裝技術(shù)為手段，將鋅離子作為抗菌劑來構(gòu)建鈦合金抗菌涂層并對改性后的鈦合金材料的抗菌性進行評估。銚銻縵嚌鰻鴻鋟謎諏涼。4重慶大學(xué)本科學(xué)生畢業(yè)設(shè)計（論文） 鈦合金抗菌界面的構(gòu)建 2 鈦合金抗菌涂層的構(gòu)建2.1簡介 最近60年以來,研究手段主要是以LB(Langmuir-Blodgett)膜技術(shù)16來制備基底片上的納米結(jié)構(gòu)薄膜。其主要原理為：首先由構(gòu)成薄膜的物質(zhì)于液相與氣相界面處形成薄層，然后利用相關(guān)的儀器使所形成的薄層平鋪在目標基質(zhì)表面形成多層膜。LB(Langmuir-Blodgett)膜技術(shù)有許多的缺點，比如完成操作所需要的設(shè)備太過昂貴,基質(zhì)中的種類和尺寸嚴重影響了材料表面薄膜的穩(wěn)定性與質(zhì)量16。為了改進此技術(shù),研究者提出了層層自組裝技術(shù),十九世紀八十年代Sagiv在固體基底上構(gòu)建成了有序的硅氧烷薄膜。接著Decher17以Sagiv的技術(shù)為基礎(chǔ),結(jié)合正負電荷相互吸引的原理提出了靜電層層自組裝技術(shù),同時，探究了用靜電層層自組裝技術(shù)在基質(zhì)表面構(gòu)建多層多分子薄膜的過程。研究發(fā)現(xiàn)層層自組裝形成薄膜的原理是以分子界面組裝為基礎(chǔ)的,首先,處于界面上的分子受時間與空間的限制,很容易產(chǎn)生特定的形態(tài)。不僅如此，對許多先進的界面和表面表征技術(shù)的順利運用也非常有利。研究表明通過層層自組裝構(gòu)建的多層膜體系中，可以根據(jù)需求調(diào)整膜的厚度，接連某些特定功能基團，從而讓其具備目標功能和結(jié)構(gòu)39。 層層自組裝技術(shù)構(gòu)建多層膜的一般步驟: 擠貼綬電麥結(jié)鈺贖嘵類。 首先要對基質(zhì)進行預(yù)處理，然后將膜材料A吸附到基質(zhì)上完成后清洗基質(zhì)，接著將膜材料B吸附到基質(zhì)上，再清洗，最后重復(fù)上述步驟。層層自組裝技術(shù)不僅膜基質(zhì)沒有特殊的要求,同時也不用配備專用的設(shè)備,既經(jīng)濟實惠，而且效果較好。層層自組裝技術(shù)根據(jù)驅(qū)動力不同,可以分為靜電層-層自組裝、共價鍵層-層自組裝、氫鍵層-層自組裝等不同類型18。賠荊紳諮侖驟遼輩襪錈。 隨著生物醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域研究的飛速發(fā)展,人們對復(fù)雜生物體中各種生物分子間的弱相互作用從而實現(xiàn)其復(fù)雜功能的機制的理解也越發(fā)深刻。如某些生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸等復(fù)雜的生物功能的形成，是以它們特定復(fù)雜三級結(jié)構(gòu)作為基礎(chǔ),這種三級結(jié)構(gòu)是通過了各分子片斷之間不同的弱相互作用,來使分子的各個部分自發(fā)組裝、堆積形成相應(yīng)空間結(jié)構(gòu)。在各個分子組裝相關(guān)的研究中,由于自組裝體系結(jié)構(gòu)簡單，制備起來經(jīng)濟又方便，從而吸引了非常多研究者的目光。如Decher等人在1991年，以LB膜為基礎(chǔ),結(jié)合了陰陽離子之間靜電相互作用，發(fā)展形成的靜電層層自組裝技術(shù)19。從此,靜電層層自組裝技術(shù)成為國際眾多研究者的研究熱點,隨著靜電層層自組裝技術(shù)的日趨成熟，該技術(shù)也開始在各個領(lǐng)域中被廣泛的運用。層層自組裝技術(shù)其主要的特點是在其表面帶有荷電的基質(zhì)上通過陰陽離子間的靜電相互作用來使陰陽離子聚電解質(zhì)交替吸附，以此來完成多分子薄膜的構(gòu)建40。塤礙籟饈決穩(wěn)賽釙冊庫。 層層自組裝技術(shù)有以下優(yōu)點：1.具備廣泛實用的組裝分子選擇范圍,比如蛋白質(zhì)、DNA、多糖 等生物大分子活性物質(zhì)，同時也能組裝一些聚電解質(zhì)；2此技術(shù)制備工藝簡單沒有特殊要求的設(shè)備，只需簡單的交替組裝實際需要的膜材料即可；3.層層自組裝技術(shù)對操作條件要求相對簡單,可在常溫下進行,能夠確保生物分子不失去其活性；4.此技術(shù)對基底材料的要求簡單,適用材料范圍廣泛，并且可以運用于具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的器件上。因為該技術(shù)具備以上優(yōu)點，在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域中層層自組裝技術(shù)得到了廣泛地運用19。 裊樣祕廬廂顫諺鍘羋藺。2.2材料與方法2.2.1材料與設(shè)備1、 直徑為1.5cm，厚度為2mm的鈦片（西北有色金屬研究所訂制及加工）。2、 P400、P1000、P2000的砂紙3、 試驗中用到的儀器超聲清洗機SB32000 （寧波新芝生物科技股份有限公司）HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 （江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠）4、 試驗中用到的試劑如表1表1 主要試劑試劑簡介殼聚糖Sigma Chemical Co. (MO, USA)明膠5mg/mL無水乙醇分析純重慶川東化工（集團）有限公司丙酮 天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠醋酸鋅溶液10/20/40 mg/mL聚乙烯亞胺Sigma Chemical Co. (MO, USA)2.2.2層層自組裝構(gòu)建涂層 0.5 g殼聚糖(CHI)溶解于100 mL2%的醋酸溶液中，明膠(Gel)和聚乙烯亞胺(PEI)分別溶解于去離子水中形成5mg/mL的溶液。首先將陽極氧化處理后的基材，置于勻膠機上。采用旋涂法構(gòu)建自組裝多層膜，2000 rpm旋涂速度，20s的旋涂時間。首先滴加一定量的PEI溶液，旋涂，然后滴加去離子水，清洗兩次。然后開始層層自組裝沉積滴加Gel溶液，旋涂之后，用去離子水清洗兩次，然后滴加CHI溶液，繼續(xù)旋涂，去離子水清洗兩次，然后滴加醋酸鋅溶液，繼續(xù)清洗，再加CHI溶液，旋涂，清洗后，完成一個自組裝循環(huán)，記為PEI/(Gel/CHI)1。不斷重復(fù)層層制備過程，直到得到PEI/(Gel/CHI)5，即最終需要的涂層3536。倉嫗盤紲囑瓏詁鍬齊驁。2.2.3表面特征 樣品覆蓋層的表面形態(tài)通過掃描電子顯微鏡觀察（Quanta 200, Philips-FEI Corporation, Netherlands）。其表面元素組成通過配備掃描電子顯微鏡的能譜儀（EDAX Corporation, U.S.）來研究20。處理過的樣品在400-4000nm范圍內(nèi)的納米組成由紅外光譜儀（model 6300, Bio-Rad Co. Ltd., USA）來測定。獲得所有這些光譜數(shù)據(jù)時分辨率為每4cm-1掃描64次3738。綻萬璉轆娛閬蟶鬮綰瀧。2.2.4涂層耐腐蝕性能測試樣品的耐腐蝕性采用AutoLab電化學(xué)工作站(瑞士萬通公司)進行測定21。測試是在人工模擬體液中進行，采用三電極體系進行電化學(xué)測試，以飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，Pt電極為輔助電極，樣品作為工作電極。驍顧燁鶚巰瀆蕪領(lǐng)鱺賻。模擬體液的配置：1) 將所需容量瓶、燒杯等器材均用酸泡洗之后用去離子沖洗干凈；2) 稱量以下所需試劑：5.403 g NaCl，0.504 g NaHCO3，0.426 g Na2CO3，0.225 g瑣釙濺曖惲錕縞馭篩涼。KCl，0.230 g K2HPO43H2O，0.311 g MgCl26H2O，17.892 g HPEPS （在100 ml 0.2 M NaOH中溶解），0.293 g CaCl2，0.072 g Na2SO4。配制1.0 M NaOH調(diào)pH；（注：以上試劑除HPEPS由Sigma Chemical Co.（MO, USA）提供外，其他試劑均由重慶川東化工（集團）有限公司提供）鎦詩涇艷損樓紲鯗餳類。3) 將700 ml去離子水倒入燒杯中，加入磁子，于36.5 下在磁力攪拌器上攪拌；4) 將上述所稱試劑依次加入；（注：等上一試劑完全溶解后再加下一試劑）5) 用1.0 M的NaOH溶液調(diào)pH至7.40； 6) 將溶液轉(zhuǎn)移至1000 ml的容量瓶中，待溶液冷卻至20 后，加去離子水定容至1000 ml；7) 放置幾日后再次測定其pH，并過濾溶液。測試過程： 打開電腦和AutoLab電化學(xué)工作站，預(yù)熱5分鐘； 接好電極； 在Gpes軟件中選擇Method，Linear sweep voltametry，Normal； 設(shè)定參數(shù)如起始電位、靜止時間及靈敏度等； 開始測試； 保存數(shù)據(jù)，格式為.ocw； 對數(shù)據(jù)進行分析，AnalysisTafel Slope AnalysisTafel Slope，得到腐蝕電位和腐蝕電流密度；櫛緶歐鋤棗鈕種鵑瑤錟。 在Origin 8.0中作圖。2.3結(jié)果與討論2.3.1涂層分析圖1 掃描電鏡圖 (a)是未處理的鈦材；(b)、(c)和(d)分別是以10、20和40 mg/mL的醋酸鋅溶液進行層層組裝處理后鈦材。轡燁棟剛殮攬瑤麗鬮應(yīng)。首先利用掃描電鏡對鈦材的表面進行了表征，如圖1所示，從圖中可以看出未經(jīng)處理的鈦材和在10、20和40 mg/mL的醋酸鋅溶液進行層層組裝處理后的鈦材表面的表征結(jié)構(gòu)。圖1中(a)是未處理的鈦材，其表面粗糙不平整，造成鈦材表面不平整的原因可能是鈦材在打磨的時候沒能使鈦材表面處理光滑；也有可能是在對鈦材清洗時不徹底，導(dǎo)致鈦材表面殘留有雜質(zhì)，在掃描電鏡下表面粗糙不平整。觀察圖(b)、(c)和(d)（分別是以10、20和40 mg/mL的醋酸鋅溶液進行層層組裝處理后鈦材）發(fā)現(xiàn)鈦材表面逐漸趨于平整此結(jié)果說明醋酸鋅溶液在鈦材表面成功的進行了層層組裝。由于(b)、(c)和(d)的平整度變化說明了隨著醋酸鋅溶液濃度的增加層層自組裝的效果更佳。峴揚斕滾澗輻灄興渙藺。觀察40 mg/mL的醋酸鋅溶液進行層層組裝處理后鈦材的能譜圖，如圖2，從圖中可知涂層中主要含有鈦、鋅、氮、金這幾種元素。鋅元素的出現(xiàn)說明了實驗成功的將鋅離子通過層層組裝處理構(gòu)建于鈦材表面。而金元素的出現(xiàn)是因為在對鈦材進行檢測時，對其表面進行了噴金的操作。詩叁撻訥燼憂毀厲鋨驁。圖2以40 mg/mL的醋酸鋅溶液進行層層組裝處理后鈦材的能譜圖表3展示了以40 mg/mL的醋酸鋅溶液進行層層組裝處理后鈦材的表面化學(xué)組成與元素的具體含量;其中鈦元素（Ti）含量為82.84%，金（Au）元素的含量為6.51%，鋅（Zn）的含量為3.29%，氮(N)的含量為7.36%。則鯤愜韋瘓賈暉園棟瀧。表3 以40 mg/mL的醋酸鋅溶液進行層層組裝處理后鈦材的表面化學(xué)組成基材Ti(wt %)Au(wt %)Zn(wt %)N(wt %)Ti-LBL(Zn)82.846.513.297.362.3.2結(jié)論本實驗利用層層自組裝技術(shù)成功地將鋅離子構(gòu)建到鈦材表面，使得心離子粘附在鈦基植入材料表面形成一層含鋅離子的薄膜，改變了鈦基植入材料的表面特性；并嘗試將其應(yīng)用于外植體表面抗菌涂層的研究，因為鋅離子具有殺菌能力當其通過層層自組裝技術(shù)黏附在鈦基植入材料表面，所以鈦材料獲得了抗菌能力。利用掃描電鏡、EDS能譜等對鈦材表面涂層的結(jié)構(gòu)和表面形貌進行表征并測定了改性后鈦材表面化學(xué)組成及其元素含量，證實了在材料表面形成了含鋅離子薄膜。實驗研究表明，層層自組裝技術(shù)在鈦材表面建立含鋅離子的抗菌涂層時，鋅離子的濃度是可控的，我們可以根據(jù)實際需求來實現(xiàn)對鈦材表面的改性。脹鏝彈奧秘孫戶孿釔賻。 11 3 改性后鈦材的抗菌能力評估 3.1簡介鈦合金由于其優(yōu)良的力學(xué)性能與耐腐蝕性，同時兼具有良好的生物相容性，使鈦合金成為了當下臨床骨組織修復(fù)和替代使用的重要材料。然而，術(shù)后感染成為臨床應(yīng)用中醫(yī)療設(shè)備植入失敗的常見原因之一。外植物表面的細菌粘附是引起外植物感染的主要原因。材料表面引起的感染往往會導(dǎo)致外植物過早松動和脫落，并可能誘發(fā)鄰近組織和器官的感染嚴重時甚至?xí)菇M織和器官壞死，給患者帶設(shè)備反復(fù)植入的痛苦和嚴重的經(jīng)濟負擔(dān)。鈦材料也面臨同樣的難題，近年來，隨著鈦合金材的植入物表面改性方法的廣泛研究，在鈦合金表面引入相關(guān)的有機或無機物質(zhì)實現(xiàn)對鈦合金材表面進行針對性的改性，從而改善鈦合金植入物的缺陷，使鈦合金材料更加符合人們需要的需要22。研究發(fā)現(xiàn),剛進行植入手術(shù)后最容易引發(fā)感染。金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞桿菌在醫(yī)院內(nèi)分布最為廣泛，也是引發(fā)術(shù)后感染的主要病原菌。銅綠假單胞桿菌和金黃色葡萄球菌都具備較強的化學(xué)藥物抵抗能力。近年來由于濫用抗生素，這兩種菌的耐藥性越來越高23。隨著感染菌的耐藥菌株的不斷產(chǎn)生，藥物的效果逐漸減弱，導(dǎo)致了患者術(shù)后費用越來越高，但患者的病痛卻并沒有得到有效的治療。鰓躋峽禱紉誦幫廢掃減。本實驗通過納米鋅抗菌涂層的鈦材在金黃色葡萄球菌上進行的一系列抗菌測試，來驗證通過涂覆納米鋅的鈦材是否具有了目標改性功能，對表面改性后的鈦材的抗菌性進行評估，檢測材料是否具有優(yōu)良的抗菌性能34。稟虛嬪賑維嚌妝擴踴糶。3.2材料與方法3.1.1材料與設(shè)備材料：金黃色葡萄球菌菌株（重慶大學(xué)生物工程學(xué)院），肉湯培養(yǎng)基（青島日水生物技術(shù)有限公司，MH肉湯，配制比例21g/L H2O），cck-8試劑（購于碧云天生物技術(shù)研究所，產(chǎn)品編號C0038）陽簍埡鮭罷規(guī)嗚舊巋錟。實驗儀器：1) CO2培養(yǎng)箱 （SHELLAB）2) 培養(yǎng)瓶 （Greiner）3) TL-16R臺式高速冷凍離心機 （上海偉業(yè)儀器廠）4) 超凈工作臺 （上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療儀器設(shè)備廠）5) 數(shù)碼相機 （C5050 型，OLYMPUS）6) 倒置相差顯微鏡 （IX71 型，OLYMPUS）7）酶標儀：Model 550，美國BIO-RAD 公司3.1.2細菌的培養(yǎng)在本次研究中，我們使用金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽性菌，是人類的一種重要病原菌，在與其斗爭的歷史中，因為抗生素的濫用，使的這種菌的耐藥性越來越強，一般的小劑量抗生素對其起到的效果非常微小，而術(shù)后的患者本身的抵抗力降低，無法大量的使用高劑量的藥品，不然會給患者帶來巨大的痛苦甚至生命危險25。因此如何使植入物本身帶有一定的抗菌能力，并降低術(shù)后的感染，成為了當今研究的熱點。溈氣嘮戇萇鑿鑿櫧諤應(yīng)。因本次實驗中，我們所使用的金黃色葡萄球菌菌株是放入冰箱中進行了凍存的菌株，在進行下面一系列的抗菌性能測試實驗前，我們先要先對菌株進行活化操作，然后培養(yǎng)成復(fù)壯后的菌株，才能進行研究。而菌株活化操作的是否成功也將影響到我們后面的結(jié)果的準確性，因此這一步操作是非常重要的。菌種的保藏和復(fù)蘇是我們進行菌株實驗中經(jīng)常接觸到的東西，因為菌種是我們生物類專業(yè)這種從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究中最為基本的科學(xué)研究材料，特別是相關(guān)的使用微生物進行有關(guān)的研究實驗或生產(chǎn)離開菌株是不能進行下去的，因此菌種也是國家的一種重要資源26。菌種保藏的主要原理是根據(jù)所需要保藏的微生物的生理生化特點，并對其保存的環(huán)境進行針對化的改造，創(chuàng)造一種使微生物代謝處于不活潑、生長繁殖受抑制的保存環(huán)境，對于環(huán)境的改造我們可以采用的方法有低溫、干燥、缺氧這3種27。通過這些手段的使用，我們可以使菌種暫時處于休眠狀態(tài)，降低它的生物活性。鋇嵐縣緱虜榮產(chǎn)濤團藺。本次實驗中，我們的菌株是存放在低溫干燥的冰箱中進行保藏的，所以我們在對菌株復(fù)蘇時，首先我們將冷凍的菌種解凍，即將所需的菌種從保藏狀態(tài)的溫度恢復(fù)到室溫狀態(tài)，這一步我們可以將菌株放入30-40的水浴鍋中1-2分鐘，或者將裝有菌株的保存管放在手中進行反復(fù)搓動，利用體溫同樣可以達到水浴鍋的效果39。在恢復(fù)室溫后，將菌株接種在合適的培養(yǎng)基上進行2-3代的培養(yǎng)即可將菌株恢復(fù)到保藏前的活性。而本次實驗中，我們所使用的菌株是保存在低溫干燥的冰箱中，溫度并不是特別低，所以在傳代復(fù)蘇時，我們只需要進行1-2次的傳代即可將菌株的活性恢復(fù)。恢復(fù)后制備菌液我們就可以進行下面一系列的實驗了。懨俠劑鈍觸樂鷴燼觶騮。金黃色葡萄球菌菌液的制備：在接種菌株之前，首先要按一定的比例(MH肉湯，21g/L H2O)配制好實驗所需的肉湯培養(yǎng)基，配制完成后，為確保實驗這個過程的沒有其他的雜菌污染，所以要將培養(yǎng)基放入高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌30min，滅菌后可以放入4的冰箱中進行凍存?zhèn)溆?。接種前，將超清工作臺提前打開用紫外滅菌15min，將菌株從冷藏箱中取出后，我們把裝有菌株的凍存管放入手心進行搓動，在肉眼下看到冰凍的菌液化開形成液體即可停止，在超清工作臺內(nèi)將金黃色葡萄球菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，接種完成后，放入37的搖床內(nèi)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為100rpm，培養(yǎng)24小時，即可得到抗菌測試所需的金黃色葡萄球菌懸液。接種后的凍存管用新的封口膜封口，重新放入冰箱內(nèi)，以便下次使用28。謾飽兗爭詣繚鮐癩別瀘。3.1.3細菌電鏡樣品的制備1） 將經(jīng)過待測鈦片放入24孔板中，每孔加入0.9ml細菌密度為1106cells/cm2的肉湯培養(yǎng)液。2） 將24孔板放入37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，除去培養(yǎng)液并加入PBS緩沖液放置于水平轉(zhuǎn)搖床上清洗3次，每次5分鐘。咼鉉們歟謙鴣餃競蕩賺。3） 吸出PBS緩沖液并向每孔加入質(zhì)量體積比為4的多聚甲醛溶液在4下固定30分鐘。4） 去除多聚甲醛溶液，每孔加入0.5mlPBS緩沖液放置于水平轉(zhuǎn)搖床上清洗2次，每次4分鐘。5） 隨后進行梯度脫水，依次加入20、50、80、100的乙醇/PBS混合液每次脫水10分鐘。6） 每孔加入0.3ml叔丁醇置換殘留在細胞內(nèi)的乙醇，放入37培養(yǎng)箱中孵育10分鐘。7） 10分鐘后吸出叔丁醇將樣品放入冷凍干燥機中干燥12小時。8） 對樣品進行噴金處理，而后再電子顯微鏡下觀察。3.2抗菌性能測試3.2.1抑菌圈實驗抑菌圈實驗法是對殺菌劑、防霉劑的作用效果進行測量的一種方式，主要用于測定所需的殺菌劑或防霉劑對細菌、霉菌、酵母菌的殺菌抑制作用，它是一種簡單有效的定性或半定量的方法。這種實驗方法主要是通過殺菌防霉劑在適當?shù)沫傊桨迳系臄U散能力來初步的對試劑的殺菌抑制作用進行簡單的測量，進而得知這種殺菌劑的殺菌能力，并對以后的實驗提供改進的數(shù)理依據(jù)。這種實驗方法的基本原理和步驟是，根據(jù)我們需要研究的對象菌種，提前將試驗菌鋪好平板，在已接種供試菌的瓊脂培養(yǎng)基上，均勻的鋪上實驗用的少量殺菌劑，使殺菌劑和培養(yǎng)基表面接觸，在培養(yǎng)基的表面殺菌劑和試菌相互接觸作用。在一定溫度下培養(yǎng)一定時間后，由于殺菌劑在培養(yǎng)基表面上的滲透擴散作用，涂抹了殺菌劑的部位會因為殺死了病菌而抑制了其在培養(yǎng)基上的生長，在其周圍出現(xiàn)一圈規(guī)律的空白圈，這就是抑菌圈。通過以前的研究，我們可以得知在一定范圍內(nèi)，抑菌圈的直徑與藥劑濃度的對數(shù)呈直線函數(shù)關(guān)系，因此我們可以從抑菌圈的直徑上進行數(shù)據(jù)分析，就能得到對供試樣品殺菌活性大小的評估28、29?，撝C齷蘄賞組靄縐嚴減。由于金黃色葡萄球菌在環(huán)境中的廣泛存在，而且它是人類的一種重要病原菌，人們對它的生長特性和形態(tài)已有過大量研究，因此利用其檢測上面經(jīng)過改性的鈦材料樣本的抗菌性能。抑制圈實驗參照相關(guān)文獻進行(Zhiyong, Fanet al. 2006)。麩肅鵬鏇轎騍鐐縛縟糶。實驗過程：首先將上面制備好的改性鈦片經(jīng)過紫外照射，把鈦片的兩面都進行滅菌，滅菌時間為120分鐘。對制備好的金黃色葡萄球菌懸液在紫外分光光度計下進行測量OD值（本次實驗中測得的OD值為0.0105、0.0095、0.0102，平均菌液濃度為1107c/ml，所以我們對原菌液稀釋了10倍），測的OD值后，對懸液進行稀釋，讓細菌懸液的數(shù)量級變成106細胞/ml，然后取20ul的細胞懸液置于培養(yǎng)皿上，將懸液涂勻，把樣品輕輕放置于瓊脂板上（輕輕按壓鈦片即可，否則瓊脂板會破裂），將培養(yǎng)基放在37下培養(yǎng)24小時后即可觀察。而我們的對照組則為和樣品一樣但沒有經(jīng)過層層自組裝技術(shù)處理的純鈦片，對照組的實驗方案和樣品一樣3033。納疇鰻吶鄖禎銣膩鰲錟。3.2.2抑菌率實驗首先，我們同樣要對樣品進行紫外滅菌處理，正反兩面滅菌120分鐘。然后將實驗組的樣品和對照組的純鈦片放進24孔板里面，然后在每個孔中加入20ul的細菌懸液，然后在加入2ml的新培養(yǎng)基，放在37的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。經(jīng)過過夜培養(yǎng)后，因為細菌會在樣品上粘附貼壁，所以在這里我們利用了超聲震蕩儀對孔板進行了震蕩，這樣可以讓細菌從鈦片上脫落下來，而且能過是菌液混合均勻,超聲時間為20s，否則細菌容易被破壞。在將細菌洗脫下來后，我們對每個孔板內(nèi)的菌液都取20ul，將其置于各個平板內(nèi)放與37的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，最后對平板內(nèi)的菌落數(shù)進行計數(shù)，并計算抗菌率即可。抑菌率的公式如下：風(fēng)攆鮪貓鐵頻鈣薊糾廟。C：代表抑菌率A：為對照組的菌落數(shù)B：為實驗組的菌落數(shù)3.2.3材料耐受性測試將經(jīng)過不同修飾的鈦片放入24孔板中，每孔加入1ml的含有培養(yǎng)液的細菌密度為1106cells/ml的菌液。然后將孔板放在37的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時。12小時后，每孔再加入200ul的無菌培養(yǎng)基和10ul的cck-8溶液，并在37的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時。1小時后，取一新的96孔板，將24孔板中的菌液每孔吸取50ul置入96孔板中，在450nm波段測量吸光值3132。滅噯駭諗鋅獵輛覯餿藹。3.3 結(jié)果與討論3.3.1電鏡分析圖1 掃描電鏡圖 (a)是未處理的鈦材；(b)是以40 mg/mL的醋酸鋅溶液進行層層組裝處理后鈦材。 將培養(yǎng)好的金黃色葡萄球菌制備成電鏡樣品在掃描電鏡下觀察得到如圖1，結(jié)果顯示未處理的鈦材表面有明顯的細菌存活，而以40 mg/mL的醋酸鋅溶液進行層層組裝處理后鈦材表面沒有細菌存活。鐒鸝餉飾鐔閌貲諢癱騮。3.3.2抑菌圈實驗分析 抑菌圈實驗結(jié)果如圖2所示，圖2中（a）為未處理的鈦材，（b）為以40 mg/mL的醋酸鋅溶液進行層層組裝處理后鈦材，從圖中可以明顯看出，經(jīng)過改性的鈦材出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，證實了以40 mg/mL的醋酸鋅溶液進行層層組裝處理后鈦材在抗菌能力上得到了顯著的增強。攙閿頻嶸陣澇諗譴隴瀘。圖2 抑菌圈（a）未處理鈦材；（b）(b)是以40 mg/mL的醋酸鋅溶液進行層層組裝處理后鈦材。通過上面抑菌圈的實驗，我們可以得知經(jīng)過層層組裝處理后鈦材的抗菌能力大大的提高了。但具體的抗菌能力我們還仍然需要通過抗菌率和CCK-8的實驗來測試。通過對平板上菌落的計數(shù)，我們得到了表1的數(shù)據(jù)，通過表格中數(shù)據(jù)可以得知，未處理的鈦材（對照組）的平均菌落數(shù)為4101，而我們經(jīng)過層層組裝處理的鈦材（實驗組）的平均菌落數(shù)為440，計算后可知抑菌率為89.27%。所以在抑菌效果上，構(gòu)建了鋅離子涂層的鈦材料在抑菌效果上是有了很大的提升的。也說明了鋅離子作為滅菌劑，其對細菌有很強的滅殺抑制效果。而且我們可以通過提高醋酸鋅溶液的濃度，來使鈦材表面上粘附的鋅離子更多，從而讓鈦材具有更高的抑菌率。趕輾雛紈顆鋝討躍滿賺。表1 為40 mg/mL的醋酸鋅溶液進行層層組裝處理后鈦材的抑菌率樣品Ti （菌落數(shù)）Ti-Zn2（菌落數(shù)）抑菌率 （%）1451250188.902387944288.613391237890.03CCK-8（全稱為Cell Counting Kit 8）是一種綜合能力很好的細胞活性檢測試劑，而利用CCK-8試劑檢測的方法就是CCK-8實驗了。這種試劑的檢驗原理是因為CCK-8試劑中含有WST-8。WST