藥物安全性評價-局部給藥毒性試驗譚

姓名 譚珍媛電話Q 539967694 廣西醫(yī)科大學藥物安全性評價中心 藥物安全性評價中局部給藥毒性試驗 被 反應停 奪去胳膊的孩子們 反應停 的兩種手性結構分子 反應停 事件 50年代 德國 海豹畸形嬰兒 海豹畸形人 龍膽瀉肝丸事件 90年代 中國 馬兜鈴酸 腎病 腎衰 毒尿癥 案例 痤瘡是一種毛囊皮脂炎癥 多發(fā)于青年男女面部 胸部等皮脂分泌旺盛的區(qū)域 持續(xù)時間長 且易反復發(fā)作 克林霉素 過氧苯甲酰凝膠是由克林霉素磷酸脂與過氧苯甲酰制成的復方制劑 臨床用于痤瘡治療 要求觀察其對皮膚的刺激性與過敏反應 藥物安全性評價中局部給藥毒性試驗 局部給藥毒性試驗概念 是指局部用藥后所引起的毒性反應 最常用制劑 有皮膚用藥制劑 涂劑 擦劑 膏藥劑 透皮吸收制劑等 滴眼劑 滴鼻劑和噴霧劑 肌內(nèi)注射劑 直腸和陰道用藥制劑等等 第一節(jié)皮膚用藥的毒性評價 一 皮膚組織結構皮膚覆蓋于整個體表 由表皮 真皮和皮下組織組成 二 化學物質對皮膚毒性作用的類型 根據(jù)性質不同 由藥物引起的皮膚損害包括原發(fā)性刺激炎癥反應和致敏反應 偶然也可引起皮膚癌 三 皮膚給藥毒性評價包括 1 急性毒性試驗2 長期毒性試驗3 皮膚刺激性試驗4 過敏試驗5 光敏試驗等 一 皮膚用藥急性毒性實驗 1 定義 指動物完整或破損皮膚一次性接觸受試物后在短期內(nèi)出現(xiàn)的毒性反應實驗 2 受試物 使用臨床制劑 如臨床制劑濃度無法滿足劑量要求 受試物為粉末狀的用適宜基質 如凡士林 羊毛脂等 溶解混勻 3 實驗動物及實驗條件每組動物數(shù) 一般選白色家兔 小型豬4 6只 大鼠或豚鼠10只 雌雄各半 動物體重 家兔2 3kg 豚鼠200 300g 大鼠200 250g 小型豬30 40kg 飲食 攝水 自由飲食 攝水 動物房溫濕度 家兔 豚鼠及小型豬控制在18 26 大鼠控制在20 25 相對濕度均為40 70 換氣次數(shù)為10 20次 min 12h明暗交替光照 4 劑量設計至少應設三個劑量組 另設賦形劑對照組 必要時設空白對照組 如受試物在擬用臨床給藥時有可能與破損皮膚接觸 則應另設破損皮膚組 5 實驗操作給藥前24h對給藥區(qū) 通常在背部 進行脫毛處理 給藥時將受試物均勻涂于動物脫毛區(qū) 液體制劑 應將受試物涂于敷料上 再貼于脫毛或破損皮膚區(qū) 用半封閉的外罩固定敷料 涂敷24h后 除去敷料 用溫水或適宜的溶劑除去殘留的受試物和賦形劑 觀察期 連續(xù)觀察14d 觀察1 2次 天 也可根據(jù)出現(xiàn)毒性反應的情況適當延長 觀察指標 給藥前后7d 14d稱體重 觀察給藥后動物的全身反應 皮毛 眼睛 黏膜 呼吸 行為 自主活動 肌張力等 有無顫抖 震顫 抽搐 流涎 腹瀉 少動 精神萎靡不振 昏迷等毒性反應癥狀 若有動物死亡應立即進行尸檢 有明顯異常時 應進一步進行病理組織學檢查 6 觀察指標 7 結果評價對觀察到的陽性癥狀結合大體解剖或病理組織學結果進行綜合分析 與對照組比較 對動物的毒性反應及死亡原因作出明確判斷 病理組 對照組 二 皮膚給藥長期毒性實驗 1 定義指動物完整或破損皮膚長期反復接觸受試物后出現(xiàn)的毒性反應及其可逆程度實驗 2 受試物與 皮膚給藥急性毒性試驗 基本相同 3 實驗動物及條件與 皮膚給藥急性毒性試驗 一致 4 劑量設計至少應設三個劑量組 可設賦形劑對照組 必要時設空白對照組 高劑量 原則上應使動物產(chǎn)生明顯的毒性反應 甚至出現(xiàn)個別動物死亡 低劑量 原則上應高于動物藥效學實驗的等效劑量 并不使動物出現(xiàn)毒性反應 中劑量 動物可出現(xiàn)輕度毒性反應 5 給藥期限 6 給藥頻率 給藥期限 3個月 原則上應每天給藥 給藥期限 3個月 每周至少應給藥6d 也可根據(jù)臨床給藥頻率給藥 7 恢復期限給藥結束后保留部分動物 繼續(xù)觀察其可能出現(xiàn)的延遲性毒性反應 并了解毒性反應的可逆程度 根據(jù)受試物的藥代動力學特點 靶器官或靶組織的毒性反應和實際恢復情況確定恢復期的長短 8 實驗操作首次給藥前24h對給藥區(qū)在背部進行脫毛處理 每天給藥1次 每次至少接觸6h 保證受試物與給藥部位具有良好接觸并避免動物食入藥物 可用紗布等無刺激性輔料包裹或給動物穿上特制的通透性好的外套 9 觀察指標 除增加給藥部位皮膚及其周圍組織乃至全身皮膚變化和皮膚病理學檢查外 其余指標與長期毒性實驗要求一樣 10 結果評價全身毒性反應的結果評價與長毒實驗要求一樣 應根據(jù)各檢測指標及病理組織學檢查結果綜合分析 除此以外還應注意評價給藥局部及其周圍組織的毒性反應 三 皮膚刺激性實驗 1 定義 皮膚刺激性 指經(jīng)皮膚給藥后 在皮膚上產(chǎn)生的可逆性炎性病變 若給藥部位產(chǎn)生了不可逆性的組織損傷則稱為腐蝕性 皮膚刺激性實驗 是觀察動物的皮膚接觸受試物后是否引起紅腫 充血 滲出等局部反應 2 受試物應采用與臨床應用制劑一致 符合臨床用質量標準規(guī)定的受試物進行實驗 同時注明其名稱 來源 批號 含量 或規(guī)格 賦形劑 保存條件及配制方法等 其中賦形劑和雜質等的名稱和量應盡可能明確 并附有研制單位的自檢報告 所用賦形劑應該標明批號 規(guī)格和生產(chǎn)廠家 并符合實驗要求 3 實驗動物多種哺乳動物可以選擇 一般首選白色家兔 每組動物數(shù)4 8只 雌 雄各半 也可以選用其他種屬的動物 如小型豬等 選擇家兔和小型豬以外的動物應闡明合理性 4 實驗操作設賦形劑對照 采用同體左右側自身對比法 試驗前24h對給藥區(qū)進行脫毛處理 去毛范圍各3cm 3cm 給藥前應檢查去毛皮膚是否因去毛而受損傷 有損傷的皮膚不宜進行實驗 進行破損皮膚的刺激性研究時 在用藥部位用砂紙磨或劃 井 字并以滲血為度 4 實驗操作受試物藥量一般是固體或半固體0 5g 液體0 5ml 直接涂布于一側已去毛的皮膚上 然后用兩層紗布 2 5cm 2 5cm 和一層玻璃紙或類似物覆蓋 再用無刺激性膠布和繃帶加以固定 另一側涂布賦形劑做對照 貼敷時間至少4h 貼敷結束后 除去受試物并用溫水或無刺激性溶劑清潔給藥部位 注 多次給藥皮膚刺激性實驗應連續(xù)在同一部位給藥 每次給藥時間相同 貼敷期限一般不超過4周 5 觀察指標在自然光線或全光譜燈光下觀察皮膚反應 按表給出的評分標準對皮膚紅斑和水腫進行評分 6 結果評價單次給藥實驗 計算每一觀察時間點各組受試物及賦形劑皮膚反應積分的平均分值 按表進行刺激強度評價 多次給藥實驗 首先計算每一觀察時間點各組積分均值 然后計算觀察期限內(nèi)每天每只動物積分均值 按表進行刺激強度評價 四 皮膚過敏性實驗 1 概念 皮膚過敏性試驗 是觀察動物皮膚初始接觸受試物后 再進行受試物激發(fā)接觸 觀察是否產(chǎn)生全身或局部過敏反應 2 過敏性常用試驗方法 Buehler試驗 在第0 6 8和13 15天有封閉片局部給藥誘導 在第27 28天未給藥肋腹部貼6h局部激發(fā) 除去封閉片24和48h讀取結果 GMPT試驗 皮內(nèi)注射進行誘導 5 8天后再次誘導 第20 22天給激發(fā)劑量24h 去除激發(fā)劑量24和48h讀取結果 1 光過敏性實驗 光變態(tài)反應 2 光毒性實驗 光刺激性 3 皮膚光過敏性實驗 第二節(jié)腔道給藥的毒性實驗 一 腔道給藥的急性毒性實驗1 定義指通過動物腔道 包括眼 耳 鼻腔 直腸 陰道 一次性接觸受試物后在短期內(nèi)出現(xiàn)的毒性反應實驗 2 受試物應使用臨床制劑 如臨床制劑濃度無法滿足毒性實驗的劑量要求 應根據(jù)臨床制劑的制備標準制備高濃度制劑用于本研究 如為滴鼻劑或吸人劑 則受試物多為液體或粉劑 如為直腸 陰道用藥 受試物多為栓劑 液體或膏劑 若受試物為粉末狀 則應用適宜的基質 如凡士林 羊毛脂等 溶解混勻 3 實驗動物及實驗條件滴劑或吸入劑急毒實驗一般選擇大鼠或豚鼠 家兔 需直腸 陰道用藥時應選擇大鼠或家兔 其中大鼠應選擇SPF級動物 如選擇其他動物應充分說明其理由 每組動物 家兔4 6只 大鼠或豚鼠10只 雌雄各半 動物體重 家兔2 3kg 大鼠 豚鼠250 300g 4 實驗步驟 1 劑量設計 2 實驗操作 3 觀察指標 4 結果評價 對經(jīng)直腸 陰道給藥的受試物 應根據(jù)其藥效作用特點及臨床用藥方案 選用家兔 大鼠或beagle犬進行長期毒性實驗 給藥途徑應盡量模擬臨床給藥途徑 每次藥后保留時間盡量與臨床一致 確保藥物與給藥局部的接觸時間 給藥劑量 給藥期限 恢復期限及觀察指標可參考長期毒性常規(guī)要求 應特別注意觀察給藥局部及可能累及的周圍組織的反應和病理改變 二 腔道給藥的長期毒性實驗 第三節(jié)刺激性實驗 1 定義刺激性 是指非口服給藥制劑給藥后對給藥部位產(chǎn)生的可逆性炎癥反應 若給藥部位產(chǎn)生了不可逆性的組織損傷則稱為腐蝕性 刺激性實驗 是觀察動物的血管 肌肉 皮膚 黏膜等部位接觸受試物后是否引起紅腫 充血 滲出 變性或壞死等局部反應 分類 眼刺激性實驗 血管刺激實驗 肌肉刺激實驗 直腸刺激實驗 陰道刺激實驗 滴鼻劑和吸入劑刺激性實驗 口腔用藥和滴耳劑刺激性實驗等 2 眼刺激性毒性實驗案例例 氯霉素滴眼液氯霉素是一種廣譜抗生素 是目前眼用制劑中用量最多的抗生素 其水溶液穩(wěn)定性較差 典型反應為水解反應 還會發(fā)生氧化還原反應 將氯霉素滴眼液高溫加速破壞 用HLPC法檢測到降解產(chǎn)物主要為二醇物 強光照射 其降解產(chǎn)物主要為對硝基苯甲醛 因此 要考查其降解產(chǎn)物對眼的刺激作用 1 實驗動物的選擇依據(jù)擬采用的實驗模型和觀察指標選擇實驗動物 一般每個實驗選擇一種動物進行評價 2 給藥的頻率與期限給藥的頻率與期限應依據(jù)擬定臨床應用的情況來決定 重復給藥的制劑 一般每天給藥一次 給藥期限最長不超過4周 單次給藥的制劑可用單次給藥的方法進行實驗 3 可逆性觀察為明確毒性反應的性質 建議進行停藥后恢復期的觀察 局部毒性反應的可逆性評價應包括局部及相關部位的反應 小結 注意問題 4 受試物受試物應與臨床應用制劑一致 5 對照組以溶媒和是 或 賦形劑作陰性對照 必要時用已上市制劑作對照 6 劑量劑量設計主要應該考慮受試物濃度和總劑量 一般采用與臨床制劑相同濃度 設一個劑量組 可以通過改變給藥頻率進行劑量的調(diào)整 必要時應該進行不同濃度的刺激性實驗 對于皮膚刺激性實驗 在給藥面積不變的情況下 不應通過增加厚度來滿足增加給藥量的目的 注意問題 7 給藥方案給藥方案原則上應與臨床用藥方案一致 但設計給藥容積