高中生物選修1-3知識(shí)點(diǎn)總結(jié)(詳細(xì))

1 選修選修 1 課題課題 1 1 果酒和果醋的制作果酒和果醋的制作 一 實(shí)驗(yàn)原理一 實(shí)驗(yàn)原理 1 酵母菌的細(xì)胞呼吸 酵母菌進(jìn)行有氧呼吸大量繁殖 表達(dá)式為 C6H12O6 O2 CO2 H2O 能量 酵母菌進(jìn)行無氧呼吸產(chǎn)生酒精和二氧化碳 表達(dá)式為 C6H12O6 C2H5OH CO2 能量 2 酵母菌發(fā)酵的最佳環(huán)境 酵母菌在有氧和無氧的條件下都能生活 在有氧時(shí) 酵母菌大量繁殖 但是不起到 發(fā)酵效果 在無氧時(shí) 繁殖速度減慢 但是此時(shí)可以進(jìn)行發(fā)酵 在利用酵母菌發(fā)酵時(shí)最 好是先通入足夠的無菌空氣在有氧環(huán)境下一段時(shí)間使其繁殖 再隔絕氧氣進(jìn)行發(fā)酵 20 左右最適合酵母左右最適合酵母菌繁殖 酒精發(fā)酵的最佳溫度是在 18 25 pH 最好是弱酸性 3 醋酸菌好氧性細(xì)菌 當(dāng)缺少糖源時(shí)和有氧條件下 可將乙醇 酒精 氧化成醋酸 表達(dá)式為 C2H5OH CH3COOH H2O 當(dāng)氧氣 糖源都充足時(shí) 醋酸菌將葡萄汁中的糖 分解成醋酸 醋酸菌生長(zhǎng)的最佳溫度是在 30 35 二 實(shí)驗(yàn)步驟二 實(shí)驗(yàn)步驟 1 對(duì)發(fā)酵瓶 紗布 榨汁機(jī) 盛葡萄汁的器皿等實(shí)驗(yàn)用具進(jìn)行清洗并消毒 先用溫 水反復(fù)沖洗幾次 再用體積分?jǐn)?shù)為 75 的酒精擦拭消毒 晾干待用 2 取葡萄 500 g 去除枝梗和腐爛的子粒 3 用清水沖洗葡萄 1 2 遍除去污物 注意不要反復(fù)多次沖洗 4 用榨汁機(jī)榨取葡萄汁后 將其裝入發(fā)酵瓶中或?qū)⑵咸汛虺蓾{后 用潔凈的紗布過 濾至發(fā)酵瓶中 蓋好瓶蓋 如果沒有合適的發(fā)酵裝置 可以用 500 mL 的塑料瓶替代 但注入的果汁量不要超過塑料瓶總體積的注入的果汁量不要超過塑料瓶總體積的 2 3 5 將發(fā)酵瓶置于適宜的溫度下發(fā)酵 6 由于發(fā)酵旺盛期 CO2的產(chǎn)量非常大 因此需要及時(shí)排氣 防止發(fā)酵瓶爆裂 如果 使用簡(jiǎn)易的發(fā)酵裝置 如瓶子 最好選用塑料瓶 每天要擰松瓶蓋 2 4 次 進(jìn)行排氣 7 10 d 以后 可以開始進(jìn)行取樣檢驗(yàn)工作 例如 可以檢驗(yàn)酒味 酒精的含量 進(jìn) 行酵母菌的鏡檢等工作 8 當(dāng)果酒制成以后 可以在發(fā)酵液中加入醋酸菌或醋曲 然后將裝置轉(zhuǎn)移至 30 35 的條件下發(fā)酵 適時(shí)向發(fā)酵液中充氣充氣 如果找不到醋酸菌菌種或醋曲 可嘗試 自然接種 但效果不是很好 如果沒有充氣裝置 可以將瓶蓋打開 在瓶口蓋上紗布 以減少空氣中塵土等的污染 三 注意事項(xiàng)三 注意事項(xiàng) 請(qǐng)分析此裝置中的充氣口 排氣口和出料口分別有哪些作用 為什么排氣口要通過 一個(gè)長(zhǎng)而彎曲的膠管與瓶身連接 結(jié)合果酒 果醋的制作原理 你認(rèn)為應(yīng)該如何使用這 個(gè)發(fā)酵裝置 充氣口 排氣口 酶 酶 酶 2 出料口 答 充氣口是在醋酸發(fā)酵時(shí)連接充氣泵進(jìn)行充氣用的 排氣口是在酒精發(fā)酵時(shí)用來 排出 CO2的 出料口是用來取樣的 排氣口要通過一個(gè)長(zhǎng)而彎曲的膠管與瓶身連接 其 目的是防止空氣中微生物的污染防止空氣中微生物的污染 使用該裝置制酒時(shí) 應(yīng)該關(guān)閉充氣口 制醋時(shí) 應(yīng)將 充氣口連接氣泵 輸入氧氣 課題課題 2 2 腐乳的制作腐乳的制作 一 一 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 1 參與豆腐發(fā)酵的微生物有青霉 酵母 曲霉 毛霉青霉 酵母 曲霉 毛霉等多種 其中起主要作用的 是毛霉毛霉 2 毛霉是一種絲狀真菌絲狀真菌 常見于土壤 水果 蔬菜 谷物上 具有發(fā)達(dá)的白色菌 絲 3 毛酶等微生物產(chǎn)生的蛋白酶蛋白酶能將豆腐中的蛋白質(zhì)分解成小分子的肽和氨基酸 脂脂 肪酶肪酶可將脂肪分解成甘油和脂肪酸 二 實(shí)驗(yàn)步驟二 實(shí)驗(yàn)步驟 1 將豆腐切成 3cm 3cm 1cm 的若干塊 所用豆腐的含水量為 7070 左右 水分過多 則腐乳不易成形 2 將豆腐塊平放在鋪有干粽葉的盤內(nèi) 粽葉可以提供菌種 并能起到保溫的作用可以提供菌種 并能起到保溫的作用 每塊豆腐等距離排放 周圍留有一定的空隙 豆腐上面再鋪上干凈的粽葉 氣候干燥氣候干燥時(shí) 將平盤用保鮮膜保鮮膜包裹 但不要封嚴(yán) 以免濕度太高 不利于毛霉的生長(zhǎng)以免濕度太高 不利于毛霉的生長(zhǎng) 3 將平盤放入溫度保持在 1515 1818 的地方 毛霉逐漸生長(zhǎng) 大約 5 d 后豆腐表面 叢生著直立菌絲 4 當(dāng)毛霉生長(zhǎng)旺盛 并呈淡黃色時(shí) 去除包裹平盤的保鮮膜以及鋪在上面的粽葉 使豆腐塊的熱量和水分能夠迅速散失 同時(shí)散去霉味 這一過程一般持續(xù) 36 h 以上 5 當(dāng)豆腐涼透后 將豆腐間連接在一起的菌絲拉斷 并整齊排列在容器內(nèi) 準(zhǔn)備腌 制 6 長(zhǎng)滿毛霉的豆腐塊 以下稱毛坯 與鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為 5 15 1 將培養(yǎng)毛坯時(shí)靠近 平盤沒長(zhǎng)直立菌絲的一面統(tǒng)一朝向玻璃瓶邊 將毛坯分層盤立擺放在容器中 分層加鹽 分層加鹽 并隨層加高而增加鹽量 在瓶口表面鋪鹽厚些并隨層加高而增加鹽量 在瓶口表面鋪鹽厚些 以防止雜菌從瓶口進(jìn)入防止雜菌從瓶口進(jìn)入 約腌制 8 d 注注 用鹽腌制時(shí) 注意鹽都用量 鹽的濃度過低 不足以抑制微生物生長(zhǎng) 可能導(dǎo)用鹽腌制時(shí) 注意鹽都用量 鹽的濃度過低 不足以抑制微生物生長(zhǎng) 可能導(dǎo) 致豆腐腐敗變質(zhì) 鹽的濃度過高 會(huì)影響腐乳的口味 致豆腐腐敗變質(zhì) 鹽的濃度過高 會(huì)影響腐乳的口味 7 將黃酒 米酒和糖 按口味不同而配以各種香辛料 如胡椒 花椒 八角茴香 桂皮 姜 辣椒等 混合制成鹵湯 鹵湯酒精含量控制在 1212 左右為宜 注 酒精含量的高低與腐乳后期發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短有很大關(guān)系 酒精含量越高 對(duì)酒精含量越高 對(duì) 蛋白酶的抑制作用也越大 使腐乳成熟期延長(zhǎng)蛋白酶的抑制作用也越大 使腐乳成熟期延長(zhǎng) 酒精含量過低 蛋白酶的活性高 加快酒精含量過低 蛋白酶的活性高 加快 蛋白質(zhì)的水解 雜菌繁殖快 豆腐易腐敗 難以成塊 蛋白質(zhì)的水解 雜菌繁殖快 豆腐易腐敗 難以成塊 8 將廣口玻璃瓶刷干凈后 用高壓鍋在 100 蒸汽滅菌 30 min 將腐乳咸坯擺入 瓶中 加入鹵湯和輔料后 將瓶口用酒精燈加熱滅菌 用膠條密封 在常溫情況下 一 般六個(gè)月可以成熟 三 注意事項(xiàng)三 注意事項(xiàng) 1 釀造腐乳的主要生產(chǎn)工序是將豆腐進(jìn)行前期發(fā)酵和后期發(fā)酵前期發(fā)酵和后期發(fā)酵 前期發(fā)酵所發(fā)生的 主要變化是毛霉在豆腐 白坯 上的生長(zhǎng)毛霉在豆腐 白坯 上的生長(zhǎng) 發(fā)酵的溫度為 15 18 此溫度不適于細(xì) 3 菌 酵母菌和曲霉的生長(zhǎng) 而適于毛霉慢慢生長(zhǎng) 毛霉生長(zhǎng)大約 5 d 后使白坯變成毛坯 前期發(fā)酵的作用 一是使豆腐表面有一層菌膜包住 形成腐乳的前期發(fā)酵的作用 一是使豆腐表面有一層菌膜包住 形成腐乳的 體體 二是毛霉分泌二是毛霉分泌 以蛋白酶為主的各種酶 有利于豆腐所含有的蛋白質(zhì)水解為各種氨基酸 以蛋白酶為主的各種酶 有利于豆腐所含有的蛋白質(zhì)水解為各種氨基酸 后期發(fā)酵主要 是酶與微生物協(xié)同參與生化反應(yīng)的過程酶與微生物協(xié)同參與生化反應(yīng)的過程 通過腌制并配入各種輔料 紅曲 面曲 酒釀 使蛋白酶作用緩慢 促進(jìn)其他生化反應(yīng) 生成腐乳的香氣 2 毛霉是一種低等絲狀真菌低等絲狀真菌 有多個(gè)細(xì)胞核 進(jìn)行無性繁殖 毛霉是食品加工業(yè)中 的重要微生物 它可以產(chǎn)生能夠分解大豆蛋白的蛋白酶 常用于制作腐乳和豆豉 課題課題 3 3 探討加酶洗衣粉的洗劑效果探討加酶洗衣粉的洗劑效果 一 實(shí)驗(yàn)原理一 實(shí)驗(yàn)原理 1 加酶洗衣粉是指含有酶制劑酶制劑的洗衣粉 目前常用的酶制劑有四類 蛋白酶 脂肪酶 蛋白酶 脂肪酶 淀粉酶和纖維素酶淀粉酶和纖維素酶 其中 應(yīng)用最廣泛 效果最明顯的是堿性蛋白酶和堿性脂肪酶 2 堿性蛋白酶能將血漬 奶漬血漬 奶漬等含有的大分子蛋白質(zhì)水解成可溶性的氨基酸或小分子可溶性的氨基酸或小分子 的肽 的肽 使污跡從衣物上脫落 脂肪酶 淀粉酶和纖維素酶也能分別將大分子的脂肪 淀 粉和纖維素水解為小分子物質(zhì) 使洗衣粉具有更好的去污能力 3 在本課題中 我們主要探究有關(guān)加酶洗衣粉的三個(gè)問題 一是普通洗衣粉和加酶洗 衣粉對(duì)衣物污漬的洗滌效果有什么不同 二是在什么溫度下使用加酶洗衣粉效果最好 三是添加不同種類的酶的的洗衣粉 其洗劑效果有哪些區(qū)別 二 實(shí)驗(yàn)步驟二 實(shí)驗(yàn)步驟 1 1 探究用加酶洗衣粉與普通洗衣粉洗滌的效果的不同探究用加酶洗衣粉與普通洗衣粉洗滌的效果的不同 在 2 個(gè)編號(hào)的燒杯里 分別注入 500mL 清水 取 2 塊大小相等的白棉布 用滴管在每塊白布上分別滴上等量的墨水 分別放入燒杯 里 用玻璃棒攪拌 將 2 個(gè)燒杯分別放入同等溫度的溫水中 保溫 5 分鐘 稱取 5 克加酶洗衣粉和 5 克普通洗衣粉 2 份 分別放入 2 個(gè)燒杯中 用玻璃棒均勻攪 拌 保溫 10 分鐘 觀察并記錄 2 個(gè)燒杯中的洗滌效果 2 2 探究用加酶洗衣粉洗滌的最佳溫度條件探究用加酶洗衣粉洗滌的最佳溫度條件 在 3 個(gè)編號(hào)的燒杯里 分別注入 500mL 清水 取 3 塊大小相等的白棉布 用滴管在每塊白布上分別滴上一滴食用油 雞血 牛奶 分別放入燒杯里 用玻璃棒攪拌 將 3 個(gè)燒杯分別放入 50 攝氏度的熱水 沸水和冰塊中 保溫 5 分鐘 稱取 5 克加酶洗衣粉 3 份 分別放入 3 個(gè)燒杯中 用玻璃棒均勻攪拌 保溫 10 分鐘 觀察并記錄 3 個(gè)燒杯中的洗滌效果 3 3 探究不同種類的加酶洗衣粉洗滌的效果探究不同種類的加酶洗衣粉洗滌的效果 污染物蛋白酶洗衣粉脂肪酶洗衣粉復(fù)合酶洗衣粉普通洗衣粉 油漬 汗?jié)n 血漬 4 觀察并記錄四種洗衣粉分別洗滌三種污染的洗滌效果 三 注意事項(xiàng)三 注意事項(xiàng) 1 變量的分析和控制 影響加酶洗衣粉洗滌效果的因素有水溫 水量 水質(zhì) 洗衣粉的用量 衣物的質(zhì)料 大小及浸泡時(shí)間和洗滌的時(shí)間等 在這些因素中 水溫是我們要研究的對(duì)象 而其他因 素應(yīng)在實(shí)驗(yàn)中保持不變 選擇什么樣的水溫進(jìn)行實(shí)驗(yàn)需要實(shí)驗(yàn)者根據(jù)當(dāng)?shù)匾荒曛械膶?shí)際 氣溫變化來確定水溫 通常情況下 冬季 春季 秋季和夏季可分別選取 5 15 25 和 35 的水溫 因?yàn)檫@ 4 個(gè)水溫是比較符合實(shí)際情況的 對(duì)現(xiàn)實(shí)也有指導(dǎo)意義 2 洗滌方式和材料的選擇 在洗滌方式中有機(jī)洗和手洗兩種方式 應(yīng)考慮其中哪一種比較科學(xué) 哪一種更有利 于控制變量 再有 洗衣機(jī)又可以分為半自動(dòng)和全自動(dòng)兩種 相比之下 采用全自動(dòng)洗 衣機(jī)比較好 并且應(yīng)該盡量使用同一型號(hào)小容量的洗衣機(jī) 其機(jī)械攪拌作用相同 關(guān)于 洗滌材料的選擇也有一些講究 用衣物作實(shí)驗(yàn)材料并不理想 這是因?yàn)樽鳛閷?shí)驗(yàn)材料的 衣物 其大小 顏色 潔凈程度等應(yīng)該完全一致 而這并不容易做到 此外 人為地在 衣物上增加污物 如血漬 油漬等 也令人難以接受 因此 選用布料作為實(shí)驗(yàn)材料比 較可行 在作對(duì)照實(shí)驗(yàn)時(shí) 可以控制布料的大小 顏色以及污物的量 使其相同 同時(shí) 也便于洗滌效果的比較 3 水量 水質(zhì)和洗衣粉用量的問題 水的用量和布料的大小是成正比的 做實(shí)驗(yàn)用的布料不易過大 水量不易過多 但 應(yīng)該讓布料充分浸泡在水中 水量和洗衣粉的用量可以參考下表 實(shí)驗(yàn)時(shí)可根據(jù)表中的 數(shù)據(jù)換算出實(shí)際用量 如果在實(shí)驗(yàn)中使用手洗的方法 如課本中圖 4 4 所示 使用 1 000 mL 的燒杯作為容器 可以用 500 mL 的水 洗衣粉的用量可以用 1 g 或 1 5 g 洗滌方式機(jī)洗手洗 水量0 5 L0 5 L 洗衣粉量0 5 g1 g 或 1 5 g 其他相關(guān)問題簡(jiǎn)述如下 實(shí)驗(yàn)中可以用滴管控制污物的量 待污物干燥后再進(jìn)行實(shí) 驗(yàn) 布料應(yīng)放在洗衣粉溶液中浸泡相同的時(shí)間 采用玻璃棒或筷子攪拌的方式模擬洗衣 過程 模擬攪拌的時(shí)間 次數(shù)和力量應(yīng)基本相同 課題課題 4 4 酵母細(xì)胞的固定化酵母細(xì)胞的固定化 一 實(shí)驗(yàn)原理一 實(shí)驗(yàn)原理 1 使用固定化酶技術(shù) 將這種酶固定在一種顆粒狀的載體上 再將這些酶顆粒裝到一 個(gè)反應(yīng)柱內(nèi) 柱子底端裝上分布著許多小孔的篩板 酶顆粒無法通過篩板的小孔 而反酶顆粒無法通過篩板的小孔 而反 應(yīng)溶液卻可以自由出入應(yīng)溶液卻可以自由出入 生產(chǎn)過程中 將葡萄糖溶液從反應(yīng)柱的上端注入 使葡萄糖溶將葡萄糖溶液從反應(yīng)柱的上端注入 使葡萄糖溶 液流過反應(yīng)柱 與固定化葡萄糖異構(gòu)酶接觸 轉(zhuǎn)化成果糖 從反液流過反應(yīng)柱 與固定化葡萄糖異構(gòu)酶接觸 轉(zhuǎn)化成果糖 從反 應(yīng)柱的下端流出應(yīng)柱的下端流出 反應(yīng)柱能連續(xù)使用半年 大大降低了生產(chǎn)成本 提高了果糖的產(chǎn)量和質(zhì)量 2 固定化酶和固定化細(xì)胞是利用物理或化學(xué)方法將酶或細(xì)胞固定 在一定空間內(nèi)的技術(shù) 包括包埋法 化學(xué)結(jié)合法和物理吸附法包埋法 化學(xué)結(jié)合法和物理吸附法 一般來說 酶酶更適合采用化學(xué)結(jié)合法和物理吸附法固定化學(xué)結(jié)合法和物理吸附法固定 而細(xì)胞細(xì)胞 多采用包埋法包埋法固定化 這是因?yàn)榧?xì)胞個(gè)大 而酶分子很小 個(gè)大 的難以被吸附或結(jié)合 而個(gè)小的酶容易從包埋材料中漏出個(gè)小的酶容易從包埋材料中漏出 固定化酶優(yōu)點(diǎn) 使酶既能與反應(yīng)物接觸 又能與產(chǎn)物分離 還可 以被反復(fù)利用 5 固定化細(xì)胞優(yōu)點(diǎn) 成本更低 操作更容易 可以催化一系列的化學(xué)反應(yīng) 二 實(shí)驗(yàn)步驟二 實(shí)驗(yàn)步驟 1 1 細(xì)胞的活化 細(xì)胞的活化 稱取 lg 干酵母 放入 50 mL 的小燒杯中 加人蒸餾水 10 mL 用玻璃棒攪拌 使酵 母細(xì)胞混合均勻 成糊狀 放置 1h 左右 使其活化 注 活化 讓處于休眠狀態(tài)的微生物重新恢復(fù)正常的生活狀態(tài) 2 2 配制物質(zhì)的量濃度為 配制物質(zhì)的量濃度為 0 05mo1 L0 05mo1 L 的的 CaClCaCl2 2溶液溶液 稱取無水 CaCl2 0 83g 放人 200mL 的燒杯中 加入 150mL 的蒸餾水 使其充分溶解 待用 3 3 配制海藻酸鈉溶液 配制海藻酸鈉溶液 稱取 0 7g 海藻酸鈉 放入 50mL 小燒杯中 加人 10mL 水 用酒精燈加熱 邊加熱邊 攪拌 將海藻酸鈉調(diào)成糊狀 直至完全溶化 用蒸餾水定容至 10 mL 注意 加熱時(shí)要 用小火 或者間斷加熱 反復(fù)幾次 直到海藻酸鈉溶化為止 4 4 海藻酸鈉溶液與酵母細(xì)胞混合 海藻酸鈉溶液與酵母細(xì)胞混合 將溶化好的海藻酸鈉溶液冷卻至室溫 加人已活化的醉母細(xì)胞 進(jìn)行充分?jǐn)嚢?使 其混合均勻 再轉(zhuǎn)移至注射器中 注 冷卻至室溫的目的 防止殺死酵母菌 5 5 固定化酵母細(xì)胞 固定化酵母細(xì)胞 以恒定的速度緩慢地將注射器中的溶液滴加到配制好的 CaCl2溶液中 觀察液滴在 CaCl2溶液中形成凝膠珠的情形 將這些凝膠珠在 CaCl2溶液中浸泡 30 min 左右 注 CaCl2溶液的作用 使膠體聚沉 6 6 使用固定化酵母細(xì)胞發(fā)酵使用固定化酵母細(xì)胞發(fā)酵 a 將固定好的酵母細(xì)胞 凝膠珠 用蒸餾水沖洗 2 3 次 b 將 150mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10 的葡萄糖溶液轉(zhuǎn)移到 200mL 的錐形瓶中 再加入固定好 的酵母細(xì)胞 置于 25 下發(fā)酵 24h 三 注意事項(xiàng)三 注意事項(xiàng) 1 配制海藻酸鈉溶液 小火 間斷加熱 定容 如果加熱太快 海藻酸鈉會(huì)發(fā)生焦糊 2 海藻酸鈉溶液與酶母細(xì)胞混合 冷卻后再混合 注意混合均勻 不要進(jìn)入氣泡 3 制備固定化酵母細(xì)胞 高度適宜 并勻速滴入 4 剛形成的凝膠珠應(yīng)在 CaCL2溶液中浸泡一段時(shí)間 以便 Ca2 與 Na 充分交換 形成 的凝膠珠穩(wěn)定 檢驗(yàn)?zāi)z珠是否形成 可用下列方法 用鑷子夾起一個(gè)凝膠珠放在實(shí)驗(yàn) 桌上用手?jǐn)D壓 如果不容易破裂 沒有液體流出就表明成功地制成了凝膠珠 還可以用 手將凝膠珠在實(shí)驗(yàn)桌上用力摔打 如果凝膠珠很容易彈起 也表明制備的凝膠珠是成功 的 5 凝膠珠的顏色和形狀 如果制作的凝膠珠顏色過淺 呈白色凝膠珠顏色過淺 呈白色 說明海藻酸鈉的濃度偏低海藻酸鈉的濃度偏低 固定的酵母細(xì)胞固定的酵母細(xì)胞 數(shù)目較少數(shù)目較少 如果形成的凝膠珠不是圓形或橢圓形凝膠珠不是圓形或橢圓形 則說明海藻酸鈉的濃度偏高海藻酸鈉的濃度偏高 制作失 敗 需要再作嘗試 課題課題 5 DNA 的粗提取與鑒定的粗提取與鑒定 一 實(shí)驗(yàn)原理一 實(shí)驗(yàn)原理 提取生物大分子的基本思路是選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué) 6 性質(zhì)的生物大分子性質(zhì)的生物大分子 對(duì)于 DNA 的粗提取而言 就是要利用 DNA 與與 RNA 蛋白質(zhì)和脂 蛋白質(zhì)和脂 質(zhì)質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異 提取 DNA 去除其他成分 1 DNA 的溶解性的溶解性 DNA 和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的 NaCl 溶液中溶解度不同 利用這一特點(diǎn) 選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使 DNA 充分溶解 而使雜質(zhì)沉淀 或者相反 以達(dá)到分離目的 此外 DNA 不溶于酒精酒精溶液 但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精 利用這一原 理 可以將 DNA 與蛋白質(zhì)進(jìn)一步的分離 2 DNA 對(duì)酶 高溫和洗滌劑的耐受性對(duì)酶 高溫和洗滌劑的耐受性 蛋白酶能水解蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 但是對(duì) DNA 沒有影響 大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受 60 80oC 的 高溫 而 DNA 在 80oC 以上以上才會(huì)變性 洗滌劑能夠瓦解細(xì)胞膜細(xì)胞膜 但對(duì) DNA 沒有影響 3 DNA 的鑒定的鑒定 在沸水浴沸水浴條件下 DNA 遇二苯胺二苯胺會(huì)被染成藍(lán)藍(lán)色 因此二苯胺可以作為鑒定 DNA 的 試劑 二 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)二 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 1 實(shí)驗(yàn)材料的選取實(shí)驗(yàn)材料的選取 凡是含有 DNA 的生物材料都可以考慮 但是使用 DNA 含量相對(duì)較高含量相對(duì)較高的生物組織 成功的可能性更大 2 破碎細(xì)胞 獲取含破碎細(xì)胞 獲取含 DNA 的濾液的濾液 動(dòng)物細(xì)胞的破碎比較容易 以雞血細(xì)胞為例 在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水蒸餾水 同時(shí)用玻璃棒玻璃棒攪拌 過濾后收集濾液即可 如果實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞 需要先用洗滌劑洗滌劑 溶解細(xì)胞膜 例如 提取洋蔥的 DNA 時(shí) 在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑洗滌劑和食鹽食鹽 進(jìn)行充分的攪拌和研磨 過濾后收集研磨液 注意 為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂 蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來說是一種低滲液體 水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi) 使血細(xì)胞 脹裂 再加上攪拌的機(jī)械作用 就加速了雞血細(xì)胞的破裂 細(xì)胞膜和核膜的破裂 從而 釋放出 DNA 加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么 洗滌劑是一些離子去污劑 能溶解細(xì)胞膜 有利于 DNA 的釋放 食鹽的主要成分是 NaCl 有利于 DNA 的溶解 如果研磨不充分 會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響 研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的 DNA 釋放不完全 提取的 DNA 量變少 影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物 用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等 此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分 可能含有核蛋白 多糖和 RNA 等雜質(zhì) 3 去除濾液中的雜質(zhì)去除濾液中的雜質(zhì) 方案一的原理是 DNA 在不同濃度 NaCl 溶液中溶解度不同 方案二的原理是蛋白酶 分解蛋白質(zhì) 不分解 DNA 方案三的原理是蛋白質(zhì)和 DNA 的變性溫度不同 注意 為什么反復(fù)地溶解與析出 DNA 能夠去除雜質(zhì) 7 用高鹽濃度的溶液溶解 DNA 能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì) 用低鹽濃度使 DNA 析出 能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì) 因此 通過反復(fù)溶解與析出 DNA 就能夠除去 與 DNA 溶解度不同的多種雜質(zhì) 方案二與方案三的原理有什么不同 方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白 從而使提取的 DNA 與蛋白質(zhì)分開 方案三利用 的是 DNA 和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同 從而使蛋白質(zhì)變性 與 DNA 分離 4 DNA 的析出與鑒定的析出與鑒定 將處理后的溶液過濾 加入與濾液體積相等相等 冷卻的酒精溶液酒精溶液 靜置 2 3min 溶 液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物白色絲狀物 這就是粗提取的 DNA 用玻璃棒沿一個(gè)方向沿一個(gè)方向攪拌 卷起絲狀 物 并用濾紙吸取上面的水分 取兩支 20ml 的試管 各加入物質(zhì)的量濃度為 2mol L 的 NaCl 溶液 5ml 將絲狀物 放入其中一支試管中 用玻璃棒攪拌 使絲狀物溶解 然后 向兩支試管中各加入 4ml 的二苯胺試劑二苯胺試劑 混合均勻后 將試管置于沸水沸水中加熱 5min 待試管冷卻后 比較兩支試 管溶液顏色的變化 看看溶解有 DNA 的溶液是否變藍(lán)藍(lán) 三 實(shí)驗(yàn)步驟三 實(shí)驗(yàn)步驟 以洋蔥為實(shí)驗(yàn)材料以洋蔥為實(shí)驗(yàn)材料 1 稱取 30 克已切碎的洋蔥 放入研缽中 加入少量石英砂助研 倒入 10mL 2mol L 的 氯化鈉溶液 充分研磨 洋蔥含有揮發(fā)性刺激物 有效減少刺激 才能使實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行 上課前 教師可先 將洋蔥放入冰箱冷凍一會(huì)兒 使其涼透但又不能結(jié)冰 或?qū)⒀笫[切成幾大塊 放入清水 泡一會(huì)兒 讓其揮發(fā)性刺激物溶于水 可以減輕刺激 然后將洋蔥切碎備用 研磨的目 的主要是使洋蔥細(xì)胞破裂 使 DNA 溶于 2mol L 的氯化鈉溶液 沒必要將洋蔥研成粥糊 狀 后者既浪費(fèi)時(shí)間又影響實(shí)驗(yàn)效果 研磨時(shí) 切忌使用攪拌器 榨汁機(jī) 使用攪拌 器雖可以提高研磨效率 但攪拌器將洋蔥切成極細(xì)小的顆粒 無法通過過濾將洋蔥顆粒 剔除 只能將酒精直接倒入濾液中 許多洋蔥小顆粒因?yàn)檩p會(huì)漂浮起來 DNA 藏在其 中 無法分辨 學(xué)生看不到白色纖維狀粘稠物的 DNA 2 研磨后 用漏斗和紗布將汁液過濾到小燒杯中 得到濾液 3 向?yàn)V液中加入 95 的酒精溶液 20mL 沿?zé)诰従彽谷?不要震動(dòng)或攪拌 此時(shí) 燒杯中的液體分為上 下兩層 下層較渾濁 上層澄清 很快上層溶液中就 會(huì)有白色纖維狀粘稠物析出 用玻璃棒可將其輕輕卷起 這就是記錄生命遺傳信息的重 要物質(zhì) DNA DNA 析出的過程中 切忌震動(dòng)和攪拌 不震動(dòng)易于分層 我們就能很容 易觀察到上清液中的絲狀物 攪拌會(huì)使非常柔軟的 DNA 斷裂成小段 不易取出 如果 用玻璃棒 DNA 不易卷起 可改用表面打毛的牙簽 DNA 提取物就纏繞在牙簽上了 4 鑒定 取兩支試管 編為 1 2 號(hào) 各加入 2mol L 的氯化鈉溶液 2mL 向 1 號(hào)試管中 加入一些白色纖維狀物 振蕩使其溶解 然后向兩支試管中各加入 2mL 二苯胺試劑 沸 水浴加熱 5 分鐘 四 注意事項(xiàng)四 注意事項(xiàng) 1 以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí) 每 100ml 血液中需要加入 3g 檸檬酸鈉防止血液凝固 2 加入洗滌劑后 動(dòng)作要輕緩 柔和輕緩 柔和 否則容易產(chǎn)生大量的泡沫 不利于后續(xù)步驟地 操作 加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí) 動(dòng)作要輕緩輕緩 以免 DNA 分子的斷裂分子的斷裂 導(dǎo)致 DNA 分 子不能形成絮狀沉淀 3 二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用現(xiàn)配現(xiàn)用 否則會(huì)影響鑒定的效果 4 DNA 的溶解度與 NaCl 溶液濃度的關(guān)系 當(dāng) NaCl 溶液濃度低于 0 14mol L 時(shí) 隨濃度的升高 DNA 的溶解度降低 當(dāng) NaCl 8 溶液濃度高于 0 14mol L 時(shí) 隨濃度升高 DNA 的溶解度升高 5 盛放雞血細(xì)胞液的容器 最好是塑料容器 雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的 DNA 容易被玻璃容器吸附 由于細(xì)胞內(nèi) DNA 的含量本 來就比較少 再被玻璃容器吸附去一部分 提取到的 DNA 就會(huì)更少 因此 實(shí)驗(yàn)過程中 最好使用塑料的燒杯和試管 這樣可以減少提取過程的 DNA 的損失 課題課題 6 6 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離 一 實(shí)驗(yàn)原理一 實(shí)驗(yàn)原理 蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì) 形狀 大小 電荷性質(zhì)和多少 溶解度 吸附性質(zhì) 親和力 等千差萬別 由此提取和分離各種蛋白質(zhì) 1 凝膠色譜法 分配色譜法 凝膠色譜法 分配色譜法 1 原理 分子量大大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙多孔凝膠顆粒的間隙 路程短路程短 流動(dòng)快流動(dòng)快 分子量小小 的分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部 路程長(zhǎng) 流動(dòng)慢多孔凝膠顆粒內(nèi)部 路程長(zhǎng) 流動(dòng)慢 2 凝膠材料 多孔性 多糖類化合物 如葡聚糖 瓊脂糖 3 分離過程 混合物上柱 洗脫 大分子流動(dòng)快 小分子流動(dòng)慢 收集大分子 收集小分子 洗脫洗脫 從色譜柱上端不斷注入緩沖液 促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng) 4 作用 分離蛋白質(zhì) 測(cè)定生物大分子分子量 蛋白質(zhì)的脫鹽等 2 緩沖溶液 緩沖溶液 1 原理 由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成 如 H2CO3 NaHCO3 NaH2PO4 Na2HPO4等 調(diào)節(jié)酸和鹽的用量 可配制不同 pH 的緩沖液 2 緩沖液作用 抵制外界酸 堿對(duì)溶液抵制外界酸 堿對(duì)溶液 pH 的干擾而保持的干擾而保持 pH 穩(wěn)定 穩(wěn)定 3 凝膠電泳法 凝膠電泳法 1 原理 不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì) 電量 形狀和大小帶電性質(zhì) 電量 形狀和大小不同 在電場(chǎng)中受到的作用 力大小 方向 阻力不同 導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同 2 分離方法 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳等 3 分離過程 在一定 pH 下 使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電 加入帶負(fù)電荷多的 SDS 形成 蛋白質(zhì) SDS 復(fù)合物 使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小 二 實(shí)驗(yàn)步驟二 實(shí)驗(yàn)步驟 1 樣品處理 樣品處理 紅細(xì)胞的洗滌紅細(xì)胞的洗滌 9 洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白去除雜蛋白 采集的血樣要及時(shí)采用低速短時(shí)間低速短時(shí)間離心分離紅細(xì) 胞 然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿黃色血漿 將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體紅細(xì)胞液體倒入燒杯 再加入五倍體積的生理鹽水五倍體積的生理鹽水 緩慢攪拌 10min 低速短時(shí)間離心 如此重復(fù)洗滌三次 直至上清液中沒有黃色上清液中沒有黃色 表明紅細(xì)胞已洗滌干凈 血紅蛋白的釋放血紅蛋白的釋放 在蒸餾水蒸餾水和甲苯甲苯作用下 紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白 注 加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同 加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞 膜 有利于血紅蛋白的釋放和分離 2 粗分離 粗分離 分離血紅蛋白溶液分離血紅蛋白溶液 將攪拌好的混合溶液離心后 試管中的溶液分為 4 層 第一層為無色透明的甲苯層甲苯層 第 2 層為白色薄層固體 是脂溶性物質(zhì)的沉淀層脂溶性物質(zhì)的沉淀層 第 3 層是紅色透明液體 這是血紅蛋血紅蛋 白的水溶液白的水溶液 第 4 層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物 將試管中的液體用濾紙過濾 除去之 溶性沉淀層 于分液漏斗中靜置片刻后 分出下層的紅色透明液體 透析透析 取 1mL 的血紅蛋白溶液裝入透析袋透析袋中 將透析袋放入盛有 300mL 的物質(zhì)的量的濃 度為 20mmol L 的磷酸緩沖液中磷酸緩沖液中 透析 12h 透析可以去除樣品中分子量較小分子量較小的雜質(zhì) 或用于更換樣品的緩沖液緩沖液 3 3 純化 純化 調(diào)節(jié)緩沖液面 打開色譜柱下端的流出口 使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與 凝 膠面平齊 關(guān)閉出口 加入蛋白質(zhì)樣品 用吸管將透析后的樣品沿管壁環(huán)繞移動(dòng)沿管壁環(huán)繞移動(dòng)加到色譜柱的頂端 加樣 后 打開下端出口 使樣品滲入凝膠床內(nèi) 等樣品完全滲入凝膠層后 關(guān)閉出口 調(diào)節(jié)緩沖液面 加入 20mmol L 的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度 洗脫 連接緩沖液洗脫瓶 打開下端出口 進(jìn)行洗脫 收集分裝蛋白質(zhì) 待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí) 用試管收集 4 4 純度鑒定純度鑒定 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 選做 三 注意事項(xiàng)三 注意事項(xiàng) 1 電泳技術(shù) 電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下 利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身 10 大小 形狀等性質(zhì)的差異 使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度 從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分離 鑒定或提純的目的 2 紅細(xì)胞的洗滌 如果分層不明顯分層不明顯 可能是洗滌次數(shù)少 未能除去血漿蛋白的原因 此外 離心速度離心速度 過高和時(shí)間過長(zhǎng)過高和時(shí)間過長(zhǎng) 會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀 也得不到純凈的紅細(xì)胞 影響后續(xù) 血紅蛋白的提取純度 3 如何檢測(cè)凝膠色譜柱的裝填是否成功 由于凝膠是一種半透明的介質(zhì) 因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈 檢查凝膠是否裝填得均勻 此外 還可以加入大分子的有色物質(zhì) 觀察色帶移動(dòng)的情況 如果色帶均勻 狹窄 色帶均勻 狹窄 平整平整 說明凝膠色譜柱的性能良好 如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡 輕輕敲打柱體以消 除氣泡 消除不了時(shí)要重新裝柱 4 為什么凝膠的裝填要緊密 均勻 如果凝膠裝填得不夠緊密 均勻 就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙 使本該進(jìn)入凝 膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過 攪亂洗脫液的流動(dòng)次序 影響分離的效果 5 沸水浴處理加入洗脫液的濕凝膠的目的 不但節(jié)約時(shí)間節(jié)約時(shí)間 還能除去凝膠中可能帶有的微生物除去凝膠中可能帶有的微生物和排除凝膠內(nèi)的空氣排除凝膠內(nèi)的空氣 6 G 75 G 代表凝膠的交聯(lián)程度 膨脹程度及分離范圍 75 表示凝膠得水值 即每克凝膠 膨脹時(shí)吸水 7 5g 7 裝填完后 立即用洗脫液洗脫的目的 使凝膠裝填緊密使凝膠裝填緊密 8 加入檸檬酸鈉有何目的 為什么要低速 短時(shí)離心 為什么要緩慢攪拌 防止血液凝固 防止白細(xì)胞沉淀 防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白 9 與其他真核細(xì)胞相比 紅細(xì)胞的特點(diǎn)及這一特點(diǎn)對(duì)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離的意義 哺乳動(dòng)物及人的成熟的紅細(xì)胞是雙面凹圓餅狀 沒有細(xì)胞核和細(xì)胞器沒有細(xì)胞核和細(xì)胞器 其含有的血血 紅蛋白是有色蛋白紅蛋白是有色蛋白 因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集 脫液 這使血紅蛋白的分離過程非常直觀直觀 大大簡(jiǎn)化簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作 10 如何檢測(cè)血紅蛋白的分離是否成功 如果凝膠色譜柱裝填得很成功 分離操作也正確的話 能清楚地看到血紅蛋白的紅 色區(qū)帶均勻 狹窄 平整 隨著洗脫液緩慢流出 如果紅色區(qū)帶歪曲 散亂 變寬 說 明分離的效果不好 這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān) 選修選修 3 一 基因工程 1 1 a a 基因工程的誕生 基因工程的誕生 一 基因工程的概念 基因工程是指按照人們的愿望 進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì) 通過體外體外 DNA 重重組組和和轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因技基因技術(shù)術(shù) 賦 予生物以新的新的遺傳遺傳特性特性 創(chuàng)造出更符合人更符合人們們需要的新的生物需要的新的生物類類型和生物型和生物產(chǎn)產(chǎn)品品 基因工程是 在 DNA 分子水平分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的 又叫做 DNA 重重組組技技術(shù)術(shù) 2 a 基因工程的原理及技 基因工程的原理及技術(shù)術(shù) 原理 基因重組 技術(shù) 一 基因工程的基本工具 1 分子手術(shù)刀 限制性核酸內(nèi)切限制性核酸內(nèi)切酶酶 限制 限制酶酶 1 來源 主要是從原核生物原核生物中分離純化出來的 11 2 功能 能夠識(shí)別雙鏈 DNA 分子的某種特定特定的核苷酸序列 并且使每一條鏈中特定特定 部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二磷酸二酯鍵酯鍵斷開 因此具有專專一一性 3 結(jié)果 經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的 DNA 片段末端通常有兩種形式 黏性末端黏性末端和平末端平末端 2 分子縫合針 DNA 連連接接酶酶 1 兩種 DNA 連接酶 E coliDNA 連接酶和 T4DNA 連接酶 的比較 相同點(diǎn) 都縫合磷酸二磷酸二酯酯鍵 區(qū)別 E coliDNA 連接酶來源于 T4噬菌體噬菌體 只能將雙鏈 DNA 片段互補(bǔ)的黏性末端黏性末端之 間的磷酸二酯鍵連接起來 而 T4DNA 連接酶能縫合兩種末端兩種末端 但連接平末端的之間的效 率較低低 2 與 DNA 聚合酶作用的異同 DNA 聚合酶只能將單單個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸加到已有的核苷酸片段的末 端 形成磷酸二酯鍵 DNA 連接酶是連接兩個(gè)兩個(gè) DNA 片段片段的末端 形成磷酸二酯鍵 3 分子運(yùn)輸車 載載體體 1 載體具備的條件 能在受體能在受體細(xì)細(xì)胞中復(fù)制并胞中復(fù)制并穩(wěn)穩(wěn)定保存定保存 具有一至多個(gè)限制具有一至多個(gè)限制酶酶切切 點(diǎn) 供外源點(diǎn) 供外源 DNA 片段插入片段插入 具有具有標(biāo)記標(biāo)記基因 供重基因 供重組組 DNA 的的鑒鑒定和定和選擇選擇 2 最常用的載體是質(zhì)質(zhì)粒粒 它是一種裸露的 裸露的 結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單的 獨(dú)立于的 獨(dú)立于細(xì)細(xì)菌染色體之外菌染色體之外 并具 并具 有有自我復(fù)制能力自我復(fù)制能力的雙的雙鏈鏈環(huán)環(huán)狀狀 DNA 分子分子 3 其它載體 噬菌體的衍生物 噬菌體的衍生物 動(dòng)動(dòng)植物病毒植物病毒 二 基因工程的基本操作程序 第一步 目的基因的目的基因的獲獲取取 1 目的基因是指 編碼編碼蛋白蛋白質(zhì)質(zhì)的的結(jié)結(jié)構(gòu)基因構(gòu)基因 2 原核基因采取直接分離直接分離獲得 真核基因是人工合成人工合成 人工合成目的基因的常用方法有 反反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄法法 和化學(xué)合成法化學(xué)合成法 3 PCR 技術(shù)擴(kuò)增目的基因 1 原理 DNA 雙雙鏈鏈復(fù)制復(fù)制 2 過程 第一步 加熱至 90 95 DNA 解解鏈鏈 第二步 冷卻到 55 60 引物引物結(jié)結(jié) 合到互合到互補(bǔ)補(bǔ) DNA 鏈鏈 第三步 加熱至 70 75 熱穩(wěn)熱穩(wěn)定定 DNA 聚合聚合酶酶從引物起始互從引物起始互補(bǔ)鏈補(bǔ)鏈 的合成的合成 第二步 基因表達(dá)基因表達(dá)載載體的構(gòu)建體的構(gòu)建 1 目的 使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)穩(wěn)定存在定存在 并且可以遺傳遺傳至下一代至下一代 使目的基因能夠 表達(dá)和表達(dá)和發(fā)揮發(fā)揮作用作用 2 組成 目的基因目的基因 啟啟動(dòng)動(dòng)子子 終終止子止子 標(biāo)記標(biāo)記基因基因 1 啟動(dòng)子 是一段有特殊結(jié)構(gòu)的 DNA 片段片段 位于基因的首端首端 是 RNA 聚合聚合酶酶識(shí)別 和結(jié)合的部位 能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄出出 mRNA 最終獲得所需的蛋白蛋白質(zhì)質(zhì) 2 終止子 也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的 DNA 片段片段 位于基因的尾端尾端 3 標(biāo)記基因的作用 是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因是否含有目的基因 從而將含有目的基含有目的基 因的因的細(xì)細(xì)胞胞篩選出來 常用的標(biāo)記基因是抗生素基因抗生素基因 第三步 將目的基因?qū)⒛康幕驅(qū)?dǎo)入受體入受體細(xì)細(xì)胞胞 1 轉(zhuǎn)化的概念 是目的基因是目的基因進(jìn)進(jìn)入受體入受體細(xì)細(xì)胞內(nèi) 并且在受體胞內(nèi) 并且在受體細(xì)細(xì)胞內(nèi)胞內(nèi)維維持持穩(wěn)穩(wěn)定和表達(dá)的定和表達(dá)的過過程 程 2 常用的轉(zhuǎn)化方法 將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞 采用最多的方法是 農(nóng)農(nóng)桿菌桿菌轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法化法 其次還有 基因基因槍槍法法和 花粉管通道法花粉管通道法等 將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞 最常用的方法是 顯顯微注射技微注射技術(shù)術(shù) 此方法的受體細(xì)胞多是 受受 精卵精卵 12 將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 3 重組細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞后 篩選含有基因表達(dá)含有基因表達(dá)載載體受體體受體細(xì)細(xì)胞胞的依據(jù)是標(biāo)記標(biāo)記基因是否表基因是否表 達(dá)達(dá) 第四步 目的基因的目的基因的檢測(cè)檢測(cè)和表達(dá)和表達(dá) 1 首先要檢測(cè) 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因生物的染色體基因生物的染色體 DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因 方法是采用 DNA 分分 子子雜雜交技交技術(shù)術(shù) 2 其次還要檢測(cè) 目的基因是否目的基因是否轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄出了出了 mRNA 方法是采用 用用標(biāo)記標(biāo)記的目的基因作探的目的基因作探針針 與與 mRNA 雜雜交交 3 最后檢測(cè) 目的基因是否翻目的基因是否翻譯譯成蛋白成蛋白質(zhì)質(zhì) 方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取 蛋白蛋白質(zhì)質(zhì) 用相應(yīng) 的 抗體抗體進(jìn)行 抗原 抗體抗原 抗體雜雜交交 4 有時(shí)還需進(jìn)行 個(gè)體生物學(xué)水平個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定 如 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否出基因抗蟲植物是否出現(xiàn)現(xiàn)抗蟲性狀抗蟲性狀 三 三 b b 基因工程的應(yīng)用 基因工程的應(yīng)用 1 植物基因工程 抗蟲 抗病 抗逆抗蟲 抗病 抗逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因植物 利用基因植物 利用轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因改良植物的品基因改良植物的品質(zhì)質(zhì) 2 動(dòng)物基因工程 提高提高動(dòng)動(dòng)物生物生長(zhǎng)長(zhǎng)速度 改善畜速度 改善畜產(chǎn)產(chǎn)品品品品質(zhì)質(zhì) 用 用轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因基因動(dòng)動(dòng)物生物生產(chǎn)藥產(chǎn)藥物 物 3 基因治療 把正常的外源基因把正常的外源基因?qū)?dǎo)入病人體內(nèi) 使入病人體內(nèi) 使該該基因表達(dá)基因表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物物發(fā)揮發(fā)揮作用 作用 四 四 a a 蛋白質(zhì)工程的概念 蛋白質(zhì)工程的概念 蛋白質(zhì)工程是指以蛋白蛋白質(zhì)質(zhì)分子的分子的結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)規(guī)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ) 通過基因修基因修飾飾 或基因合成或基因合成 對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造改造 或制造一種新的蛋白新的蛋白質(zhì)質(zhì) 以滿足人類的生產(chǎn)和生 活的需求 基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在自然界已存在的蛋白質(zhì) 1 蛋白質(zhì)工程崛 起的緣由 基因工程只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)基因工程只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì) 2 蛋白質(zhì)工程的基本原理 它可以根據(jù)人的需求來設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 又稱為第二 代的基因工程 基本途徑 從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā) 設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列 找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列 基因 以上是蛋白質(zhì)工程特有的途徑 以下按照基因工以上是蛋白質(zhì)工程特有的途徑 以下按照基因工 程的一般步驟進(jìn)行 程的一般步驟進(jìn)行 注意 目的基因只能用人工合成的方法 注意 目的基因只能用人工合成的方法 設(shè)計(jì)中的困難 如何推測(cè)非編碼區(qū)以及內(nèi)含子的脫氧核苷酸序列設(shè)計(jì)中的困難 如何推測(cè)非編碼區(qū)以及內(nèi)含子的脫氧核苷酸序列 二 細(xì)胞工程 一 植物細(xì)胞工程 1 理論基礎(chǔ) 原理 細(xì)細(xì)胞全能性胞全能性 2 植物組織培養(yǎng)技術(shù) 植物組織培養(yǎng)技術(shù) b b 1 過程 離體離體的植物器官 組織或細(xì)胞 愈愈傷組織傷組織 試管苗 植物體 2 用途 微型繁殖 作物脫毒 制造人工種子 微型繁殖 作物脫毒 制造人工種子 單單倍體育種 倍體育種 細(xì)細(xì)胞胞產(chǎn)產(chǎn)物的工廠化生物的工廠化生產(chǎn)產(chǎn) A 植物繁殖 微型繁殖 可以高效快速地實(shí)現(xiàn)種苗的大量繁殖 作物脫毒 采用莖尖莖尖組織培養(yǎng)來除去病毒 因?yàn)橹参锓稚鷧^(qū)附近的病毒極少或沒有植物分生區(qū)附近的病毒極少或沒有 人工種子 以植物組織培養(yǎng)得到的胚狀體 不定芽 頂芽和腋芽等為材料 經(jīng)人工薄膜 包裝得到的種子 優(yōu)點(diǎn) 完全保持優(yōu)良品種的遺傳特性 不受季節(jié)的限制 方便儲(chǔ)藏和優(yōu)點(diǎn) 完全保持優(yōu)良品種的遺傳特性 不受季節(jié)的限制 方便儲(chǔ)藏和 運(yùn)輸運(yùn)輸 B 作物新品種培育 單倍體育種 a 過程 植株 AaBb 通過減數(shù)分裂得到花粉 AB Ab aB ab 四種類型 對(duì)花粉 進(jìn)行花藥離體培養(yǎng) 技術(shù)是植物組織培養(yǎng) 花藥離體培養(yǎng) 技術(shù)是植物組織培養(yǎng) 得到單倍體植株單倍體植株 對(duì)其幼苗時(shí)期進(jìn)行秋水秋水 13 仙素仙素處理 得到了正常的純合二倍體植株 AABB AAbb aaBB aabb 四種類型 b 優(yōu)點(diǎn) 明顯縮短育種年限 C 突變體利用 在組織培養(yǎng)中會(huì)出現(xiàn)突變體 通過從有用的突變體中選育出新品種 如如 篩選抗病 抗鹽 含高蛋白的突變體篩選抗病 抗鹽 含高蛋白的突變體 D 細(xì)胞產(chǎn)物的生產(chǎn) 通過能夠產(chǎn)生對(duì)人們有利的產(chǎn)物的細(xì)胞進(jìn)行組織培養(yǎng) 從而讓它們 能夠產(chǎn)生大量的細(xì)胞產(chǎn)物 3 地位 是培育轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因植物基因植物 植物體植物體細(xì)細(xì)胞胞雜雜交交培育植物新品種的最后一道工序 3 植物體 細(xì)胞雜交 技術(shù) 1 過 程 2 誘 導(dǎo)融合的方法 物理法包括離心 振離心 振動(dòng)動(dòng) 電電刺激刺激等 化學(xué)法一般是用聚乙二醇 聚乙二醇 PEG 作 為誘導(dǎo)劑 3 意義 克服了克服了遠(yuǎn)緣雜遠(yuǎn)緣雜交不交不親親和的障礙 和的障礙 二 動(dòng)物細(xì)胞工程 1 1 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) a a 1 概念 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)的組織組織 將它分散成單單個(gè)個(gè)細(xì)細(xì)胞胞 然后放在適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng)基中 讓這些細(xì)胞生生長(zhǎng)長(zhǎng)和繁殖和繁殖 2 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的流程 取動(dòng)物組織塊 動(dòng)動(dòng)物胚胎或幼物胚胎或幼齡動(dòng)齡動(dòng)物的器官或物的器官或組織組織 剪 碎 用胰蛋白胰蛋白酶酶或膠原蛋白或膠原蛋白酶酶處理分散成單單個(gè)個(gè)細(xì)細(xì)胞胞 制成細(xì)細(xì)胞胞懸懸液液 轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行 原代原代培養(yǎng) 貼滿瓶壁的細(xì)胞重新用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個(gè)細(xì)胞繼續(xù)傳傳代代 培養(yǎng) 3 細(xì)胞貼壁和接觸抑制 懸液中分散的細(xì)胞很快就貼貼附在瓶壁上附在瓶壁上 稱為細(xì)胞貼壁細(xì)胞貼壁 細(xì)胞數(shù)目不斷增多 當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長(zhǎng)到表面相互抑制相互抑制時(shí) 細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖停止分裂增殖 這種現(xiàn)象稱為細(xì)細(xì)胞的接觸抑制胞的接觸抑制 4 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)需要滿足以下條件 無菌 無毒的無菌 無毒的環(huán)環(huán)境境 培養(yǎng)液應(yīng)進(jìn)行無菌無菌處理 通常還要在培養(yǎng)液中添加一定量的抗生抗生 素素 以防培養(yǎng)過程中的污染 此外 應(yīng)定期更換培養(yǎng)液 防止代代謝產(chǎn)謝產(chǎn)物物積積累累對(duì)細(xì)對(duì)細(xì)胞自身胞自身 造成危害造成危害 營(yíng)營(yíng)養(yǎng)養(yǎng) 合成培養(yǎng)基成分 糖 氨基酸 促生長(zhǎng)因子 無機(jī)鹽 微量元素等 通常需加 入血清 血血清 血漿漿等天然成分 溫度溫度 適宜溫度 哺乳動(dòng)物多是 36 5 36 5 0 5 0 5 pH 7 27 2 7 47 4 植物細(xì)胞 A 植物細(xì)胞 B 雜種細(xì)胞 愈傷組織雜種植株 圖 2 14 氣體氣體環(huán)環(huán)境境 95 空氣空氣 5 COCO2 2 O2是細(xì)細(xì)胞代胞代謝謝所必需的 CO2的主要作用是維維持培養(yǎng)液持培養(yǎng)液 的的 pH 5 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用 制制備備病毒疫苗 制病毒疫苗 制備單備單克隆抗體 克隆抗體 檢測(cè)檢測(cè)有毒物有毒物質(zhì)質(zhì) 培養(yǎng) 培養(yǎng) 醫(yī)學(xué)研究的各種醫(yī)學(xué)研究的各種細(xì)細(xì)胞 胞 2 動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物 1 哺乳動(dòng)物核移植可以分為胚胎胚胎細(xì)細(xì)胞胞核移植 比較容易 和體體細(xì)細(xì)胞胞核移植 比較難 2 選用去核卵卵 母母 細(xì)細(xì)胞胞的原因 卵 母 細(xì)胞比比較較大 容易操作大 容易操作 卵 母 細(xì)胞細(xì)細(xì)胞胞質(zhì)質(zhì)多 多 營(yíng)營(yíng)養(yǎng)豐富養(yǎng)豐富 3 體細(xì)胞核移植的大致過程是 高產(chǎn)奶牛 提供體細(xì)胞 進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 同時(shí)采集卵母細(xì)胞 在體外培養(yǎng)到減二分裂中減二分裂中 期的卵母細(xì)胞期的卵母細(xì)胞 去核 顯微操作 注 為什么要用卵細(xì)胞 它可以提供充足的營(yíng)養(yǎng) 操注 為什么要用卵細(xì)胞 它可以提供充足的營(yíng)養(yǎng) 操 作簡(jiǎn)便 細(xì)胞質(zhì)不會(huì)抑制細(xì)胞核全能性的表達(dá)作簡(jiǎn)便 細(xì)胞質(zhì)不會(huì)抑制細(xì)胞核全能性的表達(dá) 將供體細(xì)胞注入去核卵母細(xì)胞 通過電 刺激使兩細(xì)胞融合 供體核進(jìn)入受體卵母細(xì)胞 構(gòu)建重組胚胎 將胚胎移入受體 代孕 母牛體內(nèi) 生出與供體奶牛遺傳基因相同的犢牛 4 體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用 加速家畜加速家畜遺傳遺傳改良改良進(jìn)進(jìn)程 促程 促進(jìn)進(jìn)良畜群繁育 良畜群繁育 保保護(hù)瀕護(hù)瀕危物種 增大存活數(shù)量 危物種 增大存活數(shù)量 生生產(chǎn)產(chǎn)珍珍貴貴的醫(yī)用蛋白 的醫(yī)用蛋白 作作為為異種移植的供體 異種移植的供體 用于用于組織組織器官的移植等器官的移植等 5 體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問題 克隆動(dòng)物存在著健康健康問題 表現(xiàn)出遺傳遺傳和生理和生理缺陷等 3 動(dòng)物細(xì)胞融合 1 動(dòng)物細(xì)胞融合也稱細(xì)細(xì)胞胞雜雜交交 是指兩個(gè)或多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞的過程 融合后形成的具有原來兩個(gè)或多個(gè)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞 稱為雜雜交交細(xì)細(xì)胞胞 2 動(dòng)物細(xì)胞融合與植物原生質(zhì)體融合的原理基本相同 誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的方法與 植物原生質(zhì)體融合的方法類似 常用的誘導(dǎo)因素有聚乙二醇 聚乙二醇 滅滅活的病毒 活的病毒 電電刺激刺激等 3 動(dòng)物細(xì)胞融合的意義 克服了遠(yuǎn)緣雜遠(yuǎn)緣雜交的不交的不親親和性和性 成為研究細(xì)細(xì)胞胞遺傳遺傳 細(xì)細(xì)胞免疫 胞免疫 腫腫瘤和生物生物新品種培育瘤和生物生物新品種培育的重要手段 4 動(dòng)物細(xì)胞融合與植物體細(xì)胞雜交的比較 細(xì)胞工程植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合 理論基礎(chǔ)細(xì)胞的全能性 細(xì)胞膜的流 動(dòng)性 細(xì)胞增殖 細(xì)胞膜的流動(dòng)性 融合前處理酶解法去除細(xì)胞壁 纖維素 酶 果膠酶 注射特定抗原 免疫處理正 常小鼠 誘導(dǎo)手段物理法 離心 振動(dòng) 電激 化學(xué)法 聚乙二醇 PEG 物理法 離心 振動(dòng) 電激 化學(xué)法 聚乙二醇 生物法 滅活的病毒 滅活 的仙臺(tái)病毒 誘導(dǎo)過程第一步 原生質(zhì)體的制備 酶解法 第二步 原生質(zhì)體融合 物 化法 第三步 雜種細(xì)胞的篩選和 培養(yǎng) 正常小鼠免疫處理 動(dòng)物細(xì)胞的融合 物 化 生法 雜交瘤細(xì)胞的篩選與培養(yǎng) 15 第四步 雜種植株的誘導(dǎo)與 鑒定 專一抗體檢驗(yàn)陽性細(xì)胞培養(yǎng) 單克隆抗體的提純 用途和意義克服遠(yuǎn)緣雜交的不親和障礙 大大擴(kuò)展雜交的親本組合范 圍 應(yīng)用 白菜 甘藍(lán)等雜種植 株 1 制備單克隆抗體 2 診斷 治療 預(yù)防 疾病 例如 生物 導(dǎo)彈 治療癌癥 4 單克隆抗體 1 抗體 一個(gè) B 淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體特異性抗體 從血清中分離出的抗體產(chǎn)產(chǎn)量低 量低 純純 度低 特異性差度低 特異性差 2 單克隆抗體的制備過程 對(duì)免疫小鼠注射特定的抗原蛋白 目的使小鼠產(chǎn)生了效應(yīng)目的使小鼠產(chǎn)生了效應(yīng) B B 細(xì)胞細(xì)胞 提取 B 淋巴細(xì)胞 同時(shí)用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的方法培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞并提取 促使它們細(xì)胞融合 注 融合的結(jié)注 融合的結(jié) 果是有很多不符合要求的 如有果是有很多不符合要求的 如有 2 2 個(gè)個(gè) B B 淋巴細(xì)胞融合的細(xì)胞等 所以要進(jìn)行篩選淋巴細(xì)胞融合的細(xì)胞等 所以要進(jìn)行篩選 在 特定的選擇培養(yǎng)基上篩選出融合的雜種細(xì)胞雜種細(xì)胞 特點(diǎn)是能迅速大量增殖