G蛋白及其受體的研究

,2016.11.19,G蛋白及其 受體的研究進展,講述步驟,01,GPCR的概念,2.由，三個不同亞基組成。激素與激素受體合誘導GTP跟G蛋白結合的GDP進行交換結果激活位于信號傳導途徑中下游的腺苷酸環(huán)化酶。3. G蛋白將細胞外的第一信使腎上腺素等激素和細胞內的腺苷酸環(huán)化酶催化的腺苷酸環(huán)化生成的第二信使cAMP聯(lián)系起來。具有內源GTP酶活性。,1. G蛋白是指能與鳥嘌呤核苷酸結合，具有GTP水解酶活性的一類信號轉導蛋白,是細胞信號傳導中的重要蛋白質,GPCR分類,1,2,3,其中亞單位在多數G蛋白中 都非常類似，分子量36kDa左右。亞單位分子量在8-11kDa之間，除Gt外，大多數G蛋白的亞單位都是相同的。,兩個亞單位的不同可以將蛋白分為Gs、Gi、Go、Gq、G12及Gt等六類。這些不同類型的G蛋白在信號傳遞過程各種發(fā)揮不同的作用,GPCRs的概念,02,1. G蛋白偶聯(lián)受體,是一大類膜蛋白受體的統(tǒng)稱。2.這類受體的共同點是其立體結構中都有七個跨膜螺旋，且其肽鏈的C端和連接第5和第6個跨膜螺旋的胞內環(huán)上都有G蛋白（鳥苷酸結合蛋白）的結合位點。3.目前為止，研究顯示G蛋白偶聯(lián)受體只見于真核生物之中，而 且參與了很多細胞信號轉導過程。,GPCRs的概念,GPCRs的結構與分類,03,GPCRs的結構,GPCRs的分類,04,GPCRGPCRs研究進展,GPCR被發(fā)現的歷史,Lefkowitz通過同位素標記的配體結合等實驗提出配體-受體-效應器相互作用的三級復合物模型。,Lefkowitz 2011年第一次在原子分辨率闡明了GPCR參與信號轉導的機制,3 GPCR工作機制研究,方法,隨后Lefkowitz實驗室克隆的GPCR,標記并分離純化擴散型配體的GPCR,諾貝爾獎得主,諾貝爾獎得主羅伯特萊夫科維茨,1,2,1,2,b2腎上腺素能受體,異丙腎上腺素,Lefkowitz,腎上腺素受體擴散型配體的GPCR的基因克隆,基于這一推論，Lefkowitz，Kobilka等人很快成功克隆了編碼人類b2腎上腺素受體蛋白的cDNA，編碼人類b1腎上腺素受體、人類血小板2腎上腺素受體、5-羥色胺受體以及第一個孤兒受體等在內的一系列受體的基因,工作中得到的信息和技術也幫助了嗅覺受體這一超家族的發(fā)現和克隆,諾貝爾獎得主布萊恩-科比爾卡,2001,2007,2007年，Kobilka利用T4溶菌酶融合蛋白方法解析了第一個非視紫紅質GPCR晶體結構：人beta2腎上腺素受體，他還獨立地通過抗體片段介導法解析了人beta2腎上腺素受體的結構。,GPCR工作機制研究,1.中國科學院生物物理所的王江云課題組和山東大學醫(yī)學院的孫金課題組于2015年9月8號在權威期刊Nature communications上發(fā)表了研究論文，報道了他們應用最新的非天然氨基酸編碼技術，揭示了G蛋白偶聯(lián)受體重要的信號轉導機制的詳細過程,研究GPCR,GPCRs的新發(fā)現,2. 研究 GPCRs 與 G 蛋白相互作用的傳統(tǒng)技術包 括免疫共沉淀、免疫共定位、GST 融合蛋白沉降等， 這些技術自身存在一定的不足，無法滿足在生理條 件下檢測受體或蛋白的相互作用。 而BRET、TIRF 及 FRET 等相關技術的出現解決了這一難題，它們 可以實時、動態(tài)、連續(xù)地監(jiān)測生理狀態(tài)下受體-受體、 受體 -G 蛋白間的動力學關系，并且不會對細胞造 成損傷，這為受體與 G 蛋白相互作用的動力學研究 提供了更加便利、準確的研究手段。,研究GPCR,GPCRs的新發(fā)現,1,2,3,獲得第一 個人 GPCR 的精細結構，也是第 2 個 GPCR 的高 分辨率晶體結構，該結果被 Science 雜志評為 2007 年十大科技進展之一.,2008 年 5 月 Midori Murakami1 和 Tsutomu Kouyama 等報道了從烏賊視細胞中分離得到的 Rhodopsin 的精細結構，分辨率達 3.7 A，它與牛 Rhodopsin 結 構 基 本 相 似,主 要 區(qū) 別 在 于 牛 Rhodopsin 的 N 末 端 為 無 規(guī) 卷 曲 ， 而 烏 賊 Rhodopsin 的 N 末端形成了規(guī)則的 螺旋結構， 這可能與其生活的海洋環(huán)境有密切關系.,2008 年 7 月 Tony Warne 等采用缺失突變 的方法，將火雞 1 腎上腺素受體中不穩(wěn)定的氨基 酸進行點突變，,同時將較長的 N 末端、C 末端以 及胞內 loop 進行缺失突變，降低其柔性，增加了 穩(wěn)定性，最終獲得了該突變體 2.7 A的精細結構.,研究GPCR,GPCRs的新發(fā)現,1,2,1）膽酸鈉；2）飽和 劑量的受體拮抗劑 ZM241385；3） 膽固醇琥珀酸 單酯. 最終獲得了該突變體（A2A-T4L-C）與拮 抗劑 ZM241385 復合體 2.6 魡 的晶體結構，這也 是第二個人 GPCR 的高分辨率晶體結構.,除了上述兩個天然分離的 Rhodopsin 的結構 外，另外 3 個重組表達得到的 GPCR 晶體結構 （見表 ）也為我們提供了兩條可能獲得 GPCR 高 分辨率晶體結構的方法，即融合蛋白法和缺失突 變法.,盡管二者都對原始蛋白進行了結構改造， 這樣獲得的晶體結構可能會與其實際結構有一 定的差別，但也為我們更多了解該蛋白的結構與 功能關系提供了重要的參考.,1.近年來，有些學者還提出了另外一種可能獲 得高質量膜蛋白晶體的方法：盒式突變法. 即采 用漸進式的多位點突變技術，以親水殘基系統(tǒng)性 地替換 GPCR 蛋白跨膜螺旋表面的多個疏水殘