菠蘿蛋白酶測定實驗報告.doc

14食安（5）班 劉嘉盈 201430520513 劉紫瀅 01430520514 羅志鋒 201430520515馬俊宇 201430520516阮順敏 201330130122菠蘿蛋白酶的提取、初步分離純化及活性測定14食安（5）班 馬俊宇201430520516摘要：本次實驗通過對菠蘿皮中存在的菠蘿蛋白酶進行粗提取、鹽析和透析從而純化和分離；并采用考馬斯亮藍法測定提取液中蛋白質的含量，利用菠蘿蛋白酶水解酪蛋白后的水解產(chǎn)物酪氨酸，在280nm處吸光值的高低，判斷酶活性的大小。從實驗結果看出，純化程度越高，提取液中蛋白質的含量先降低，后升高。同時，實驗測得菠蘿蛋白酶的比活力、回收率隨純化程度的提高而先升高后降低。關鍵詞：菠蘿蛋白酶 純化 酶活性 蛋白質含量 前 言菠蘿蛋白酶主要分布于菠蘿的莖和果實中，能分解蛋白質、肽、脂和酰胺，具有較高的生物活性，在各個生產(chǎn)領域中得到廣泛的應用1。在食品工業(yè)中菠蘿蛋白酶作為一種食品添加劑，能分解蛋白質、肽、酯和酰胺等，可用于肉質嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生產(chǎn)等。菠蘿蛋白酶來可以用來增加豆餅和豆粉的PDI值和NSI值，從而生產(chǎn)出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷類食物和飲料。其它還有生產(chǎn)脫水豆類、嬰兒食品和人造黃油；澄清蘋果汁；制造軟糖；為病人提供可消化的食品；給日常食品添味等。在醫(yī)藥上它可以治療水腫及多種炎癥，并有助消化，健胃消食等功能2。菠蘿蘿蛋白酶 p H 在 4.05.5處于較穩(wěn)定的狀態(tài)，在中性環(huán)境中酶活保持最高，在偏酸環(huán)境下酶活下降較快，堿性環(huán)境能延緩失活3。本實驗研究粗提取、鹽析和透析所得到的菠蘿蛋白酶提取液中的蛋白質含量、酶活性高低、回收率和純化倍數(shù)等，對酶的純化情況進行研究。1 實驗材料與儀器11 實驗材料與試劑新鮮菠蘿（3個），鹽析粗提液（PBS），酪蛋白試劑，激活劑，三氯乙酸(TCA)，透析袋，牛血清蛋白，考馬斯亮藍，乙醇12 實驗儀器電子天平，臺式天平，恒溫水浴鍋，冰箱，高速離心機，分光光度計，研缽，燒杯，量筒，容量瓶，移液管，漏斗，漏斗架，濾紙，試管，試管架，滴管，玻璃棒，紗布，洗耳球，標簽紙，橡皮筋DS-1型高速組織搗碎機：上海標本模型廠HZS-H型水浴振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司2 實驗方法21 菠蘿蛋白酶的粗酶提取 稱取菠蘿皮材料20g，將菠蘿皮在清水中洗凈，瀝干，切成小段后置于超高 速攪拌機中，加入約60mL預冷的0.1mo1/L pH 7.8 PBS，持續(xù)攪拌1015min至粉碎，攪拌完成后用4層紗布過濾，得到濾液后，用冷凍離心機于4C 3000rpm離心6min，棄沉淀，即得到菠蘿蛋白酶粗提液，測定粗提液的體積、蛋白質含量和酶活性。22 鹽析 根據(jù)附錄的“硫酸銨飽和度計算表”，按30%硫酸銨飽和度計算在上述酶提取液中需添加的固體硫酸銨量，稱取固體硫酸銨于研缽中，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固體硫酸銨，邊加邊攪拌，使溶液最終硫酸銨飽和度為30%，放置于冰水混合物（4）30min 后，酶蛋白沉淀析出，4C 4000rpm離心10min，收集沉淀， 加入0.1mo1/L pH 7.8 PBS約15mL至完全溶解，測定其體積、蛋白質含量和酶活性。23透析 將溶解液裝入2.5 cm8cm透析袋（預先將透析袋在蒸餾水中煮沸30min）中，于 500mL 燒杯中，在磁力攪拌器攪拌下用蒸餾水透析，15min換水一次，換水34次后，檢查SO42-是否已被除凈（檢查的方法是：取2mLBaCl2溶液放入一支試管，滴加23滴透析外液至試管中，若出現(xiàn)白色沉淀，表示SO42- 未除凈，若無沉淀出現(xiàn)，表示透析完全）。若透析液有沉淀，將透析液用濾紙過濾，測定過濾液的體積、蛋白質含量和酶活性。24 酶活力測定方法 取2支試管，設置一支為實驗對照，三支為平行樣品。取0.1mL酶液，加入0.9mL激活劑，加入37預熱的1%酪蛋白溶液1mL，準確反應10min，加入10%三氯乙酸3mL反應終止酶反應。對照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它與測定管相同。離心（3000r/min，5min）或過濾，清液于280nm波長下測定光吸收值。酶活單位定義：在上述條件下 ，每10min增加0.001個光吸收值為1個酶單位（U）。實驗步驟按照表格1中完成。試劑(ml)對照組平行樣品1平行樣品2平行樣品3TCA3酶液0.10.10.10.1激活劑0.90.90.90.9酪蛋白111137C準確反應10minTCA333A280nm OD值表格13實驗結果與分析根據(jù)上述實驗步驟，測得粗提取、鹽析、透析得到的酶制劑在280nm處的吸光值如下表2示A280nm對照組平行樣品1平行樣品2平行樣品3粗提取00.5230.5010.433鹽析00.5340.4490.469透析00.4930.4500.535表231 蛋白質含量計算1233.13.1.1 標準曲線的繪制0-1000ug/ml標準曲線的繪制如表3管號1234 5 6 1000g/mL牛血清白蛋白（mL）蒸餾水（mL）蛋白質濃度（g/mL）01.000. 20. 82000. 40. 64000. 6 0. 8 1.00. 4 0. 2 0 600 800 1000表3 另取6支試管編號，按表中加入試劑。得到從1到6號管的牛血清白蛋白溶液濃度分別為0、200、400、600、800、1000g/mL，準確吸取各管溶液0.lmL，加入5ml考馬斯亮藍溶液，搖勻，靜置2min，測定595nm吸光值，繪制0-1000g/mL標準曲線。測得不同蛋白質濃度在595nm處的吸光度如下表4所示蛋白質濃度g/ml02004006008001000A595nm00.1200.3390.4760.5990.720 表4繪制蛋白質標準曲線如下圖1示3.1.2 樣品的測定 準確吸取樣品溶液0.1mL放入具塞刻度試管中，與步驟（1） 操作相同，測得樣品的光吸收值A595nm。測得樣品吸光值如下表5示。樣品粗提取蛋白質鹽析蛋白質透析蛋白質吸光度1.0361.2231.2631.0421.1891.3091.0271.2161.274平均值1.0351.2091.282表53.1.3 結果計算 由標準曲線可查出相應的蛋白濃度（g/mL），可按如下公 式計算出樣品中蛋白含量。 查出的蛋白提取液濃度（g/mL）定容體積(mL)樣品蛋白含量(g g鮮重) 樣品重量(g)實驗所用樣品質量為20g，根據(jù)標準曲線計算樣品中蛋白質含量如下表6示粗提取鹽析透析定容體積/ml5915.517.8蛋白質提取液濃度g/ml1469.91718.41822.7樣品蛋白質含量g g鮮重 4381.591344.111635.95樣品總蛋白質含量mg86.7226.6432.44表632酶活力計算0.0010.1A280nm酶液活力（U/mL）= 稀釋倍數(shù)樣品酶活力計算如下表7示粗提取鹽析透析A280nm平均值0.6061.0250.738蛋白質提取液酶活力U/mL6060102507380總活力U357540158875131364表733酶比活的計算 酶比活（U/mg 蛋白）=酶活力/酶蛋白質含量酶比活的計算結果如下表8示粗提取鹽析透析酶比活U/mg蛋白4122.95963.84049.4表834酶純化過程中回收率計算 回收率（%）=（純化酶總活力/ 粗酶液總活力）100= （純化酶活力純化酶液體積）/（粗酶活力粗酶體積）10035酶純化倍數(shù)的計算純化倍數(shù)=純化酶比活力/粗酶比活力36實驗結果 將測定的數(shù)據(jù)整理計算分別填入下表9示，并將菠蘿蛋白酶的分離純化效果進行分析和討論。菠蘿蛋白酶分離純化表步驟總體積（mL）總蛋白質含量（mg）總活力（U）比活力（U/mg 蛋白）回收率（%）純化倍數(shù)粗提取5986.723575404122.91001.00鹽析15.526.641588755963.844.41.45透析17.832.441313644049.436.70.98表9根據(jù)表9得出以下結論，在粗提取、鹽析和透析得到的提取液中：蛋白質含量先下降，后上升；蛋白酶總活力逐漸下降；蛋白質提取液的比活力先上升，后下降；酶純化過程的回收率分別為100%、44.4%和36.7%；純化倍數(shù)分別為1.00、1.45和0.98。4實驗結論與討論4.1數(shù)據(jù)分析a) 本實驗中利用粗提取鹽析透析的方法分離提純菠蘿皮中所含的菠蘿蛋白酶。菠蘿蛋白酶鹽析后的蛋白質提取液濃度最高，粗提取次之，透析最低。隨著鹽析和透析的進行，菠蘿蛋白酶的蛋白質含量和酶活力依次降低。菠蘿蛋白酶鹽析后的酶比活最高，粗提取略次之，透析最低。b) 提取液中總蛋白的含量下降，這是由于對菠蘿皮提取液進行了純化和分離，提取液中除了菠蘿蛋白酶外的其他物質被除去，酶蛋白純度提高。但提取液中總蛋白含量下降。c) 透析后比活力下降，理論上比活力應該升高，下降的原因可能是，實驗采用的是先進行粗提取，再進行鹽析，后進行透析，隨著反應時間的延長酶逐漸失活，導致最終測得的酶比活力下降。也可能是實驗環(huán)境中的溫度、pH、金屬離子等因素影響了酶分子的活性。d) 酶的回收率隨酶的純化程度的增強而降低。酶的回收率表示酶的穩(wěn)定性。從實驗結果看出，酶的回收率下降，可能的原因是反應時間的延長、環(huán)境溫度、pH、金屬離子等因素影響了酶的穩(wěn)定性，使酶的回收率下降。菠蘿蛋白酶因含有一個不穩(wěn)定的游離巰基，所以在實驗過程中極易被氧化而使其酶活下降4。e) 鹽析純化倍數(shù)大于1，透析純化倍數(shù)小于1。鹽析由于反應時間較短，純化效果較好，純化倍數(shù)是大于1的。而由于ii、iii中提到的因素對菠蘿蛋白酶活性的影響，導致純化后的酶對比于粗提取的酶，活性更低。所以透析得到的純化倍數(shù)為小數(shù)。4.2防止酶失活變性的措施由于菠蘿蛋白酶是一種巰基蛋白酶，極易被氧化而使其酶活下降。凡是能使蛋白質變性的因素都可能使它失去活性，比如物理因素溫度、時間、壓力、光、磁場；化學因素氧化、還原、溶劑、金屬離子、離子強度、pH和生物因素酶修飾和酶降解5。所以分離純化的時候要注意不能用不潔凈的儀器（盛裝過 PBS）來盛裝酶液，不能靠近萬用爐，不能用自來水作為透析液。在新型吸附沉淀法提取菠蘿蛋白酶中，可以利用乙二胺四乙酸，它是一種螯合物，可有效地螯合原料中某些重金屬離子，以避免其與酶結合而使酶失去活性，抗壞血酸則具有還原性，分子上的活潑羥基氫可使酶活性中心保持還原狀態(tài)，從而有效地保持酶活性，其中以EDTA和L-半胱氨酸組合，效果最佳5。維生素C，也可以增強菠蘿蛋白酶的穩(wěn)定性，使菠蘿蛋白酶的活性也有所提高，使用維生素C也比較經(jīng)濟6。4.3常見的酶活性表示方法a) U/mL酶液：1mL液體酶，1min水解酪蛋白產(chǎn)生1微克酪氨酸為一個酶活力單位。用于表示液體酶中的酶活大?。籦) U/mg蛋白質：1g酶制劑，1min水解酪蛋白產(chǎn)生1微克酪氨酸為一個活力單位。用于表示酶制劑中酶活的大?。籧) U/g干重或鮮重：1g樣品，1min水解酪蛋白產(chǎn)生1微克酪氨酸為一個活力單位。表示材料中酶活的大小。4.3硫酸銨鹽析選擇0%30%飽和度的原因實驗中硫酸銨鹽析選擇30%飽和度，是因為隨著硫酸銨濃度的逐漸增大，鹽析得到的菠蘿蛋白酶的酶活回收率逐漸增大，當硫酸銨的飽和度達到40%的時侯菠蘿蛋白酶的酶活回收率最大，為83.6%，往后開始逐漸減小，當硫酸銨的飽和度越大時，菠蘿皮浸提液的鹽析效果越好6，所以取30%左右的最好。參考文獻1歐英杰.蘿蛋白酶酶活力影響因素及測定酶活力方法的研究進展J.廣東化工.2010（37）：40-512 章佩芬，郭勇，羅煥敏等. 菠蘿蛋白酶的研究與應用進展J.華西藥學雜志，2002，17(2):128-129.3董瑞蘭.菠蘿蛋白酶的分離純化及部分應用性質的研究. D.福建：福建農林大學，20104 朱明英，林文