海洋藥用活性化學(xué)成分分離分析的基本方法.ppt

第二章海洋藥用活性化學(xué)成分分離分析的基本方法 結(jié)構(gòu)鑒定 預(yù)鑒定 提取 純化 分離 第一節(jié)預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)化合物成分 海洋天然產(chǎn)物經(jīng)溶劑提取以后 經(jīng)生物活性篩選確定活性部位 確定活性部位以后 要分離出藥用活性成分 就要借助預(yù)實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)該活性部位含有哪種類(lèi)型的化學(xué)成分 以便于選用合適的分離手段和方法進(jìn)行下一步活性化學(xué)成分的分離和分析 1 一般檢查 石油醚提取液滴于濾紙上 如濾紙上的油斑在大氣中能揮發(fā) 就可能含有揮發(fā)油 如果油斑不消失 可能含有揮發(fā)油油脂或類(lèi)脂體 揮發(fā)油和油脂 2 0 05 熒光素水溶液 將石油醚提取液點(diǎn)在紙片上 噴灑0 05 熒光素水溶液后 將紙片暴露在溴蒸氣中 或碘蒸氣中 含有雙鍵的萜類(lèi)就呈黃色 背景很快就變?yōu)榈t色 揮發(fā)油和油脂 3 25 磷鉬酸乙醇溶液 將石油醚提取液點(diǎn)在濾紙片上 噴灑25 磷鉬酸乙醇溶液后 將紙片放在115 118 烘箱中2min 對(duì)油脂 三萜及甾醇等呈藍(lán)色 背景為黃綠色或藏青色 揮發(fā)油和油脂 1 用PH試紙檢查 生物樣的水浸液和酒精提取液如呈酸性 就可能含有游離酸或酚性化合物 有機(jī)酸 2 溴酚藍(lán)溶液 點(diǎn)樣于濾紙片上 噴灑0 1 溴酚藍(lán)溶液 溶于70 乙醇中 立即在藍(lán)色的背景上顯黃色的斑點(diǎn) 如覺(jué)得這樣還不夠明顯 再?lài)姙彼?然后暴露在鹽酸氣體中 背景逐漸由藍(lán)色變?yōu)辄S色 而有機(jī)酸鹽的斑點(diǎn)仍然為藍(lán)色 經(jīng)過(guò)這樣一個(gè)反復(fù) 用pH試紙難以肯定的有機(jī)酸樣品也可檢出 有機(jī)酸 1 間二硝基苯試劑 使用前制備2 的間二硝基苯乙醇溶液和14 的氫氧化鉀乙醇溶液的等量混合液 將樣品點(diǎn)在紙上 噴灑上述試劑后 置空氣中干燥約10min 就呈黃褐色或紫色 甾體 2 三氯化銻溶液 先制備三氯化銻的氯仿飽和溶液 臨用時(shí)加氯化亞砜 1 10 1 5量 甾體化合物能呈各種顏色 若不加氯化亞砜 單獨(dú)使用三氯化銻的氯仿溶液也能呈色 有些甾體樣品需要加熱100 左右3 5min才能呈現(xiàn)各種顏色 三氯化銻反應(yīng)與強(qiáng)心甙 三萜類(lèi)均能呈類(lèi)似顏色 甾體 3 醋酐濃硫酸試驗(yàn) 取乙醇浸出液將溶劑蒸干 殘?jiān)尤?mL冰醋酸使其溶解 再加lmL醋配酐最后滴入1滴濃硫酸 若試管顏色逐漸由黃 紅 紫 藍(lán) 墨綠進(jìn)行變化 則表示有甾醇 甾體皂甙的甙元及三萜類(lèi)化合物 甾體 1 取水浸液1 2mL置于試管內(nèi) 激烈振搖 如果產(chǎn)生持續(xù)性泡沫 就可能含有皂甙 高級(jí)脂肪酸鹽 蛋白質(zhì)或者粘液 皂素和脂肪酸鹽 泡沫特別顯著 甾試管內(nèi)能持續(xù)10min以上 即使加熱加酒精 泡沫液不會(huì)明顯減少 皂甙 2 醋酐濃硫酸反應(yīng) Liebermann Burchard反應(yīng) 取酒精提取液 蒸干酒精 殘?jiān)芙饣驊腋∮诖佐? 5mL中 加入一滴濃硫酸 如果呈紫紅色 并且溶液上層逐漸變綠 就表明含有甾體三萜類(lèi)或者皂甙 皂甙 1 三氯醋酸 將制備好的中性乙酸乙酯溶液點(diǎn)于紙上 配制三氯醋酸1 5 乙醇溶液及氯胺3 的水溶液 將三氯醋酸 氯胺 15 1V V 的混合液噴在紙上 紙片于110 120 烘10min 取出在紫外線照射下 呈藍(lán)紫 藍(lán) 黃褐 黃等各種顏色 強(qiáng)心甙 2 苦味酸試劑 0 9g苦味酸溶于95mL甲醇 再加l 氫氧化鈉2 5mL 最后用蒸餾水稀釋至50mL 將中性乙酸乙酯液取出少量蒸干 將樣品溶于少量甲醇 加入上述試劑2 3mL 放置15min左右即有紅色出現(xiàn) 對(duì)狄戈辛等強(qiáng)心甙立刻呈紅色 強(qiáng)心甙 3 Kedde試劑 將中性乙酸乙酯部位 點(diǎn)于紙片上 取3 5 二硝基苯甲酸lg溶于50mL甲醇 再加9N氫氧化鉀50mL 噴灑上述試劑 強(qiáng)心甙能呈紫紅色斑點(diǎn) 本反應(yīng)對(duì) 不飽和內(nèi)酯化合物有同樣的顏色 強(qiáng)心甙 1 內(nèi)酯化合物的開(kāi)環(huán)與閉環(huán)反應(yīng) 取1mL乙醇浸提液 加2mL1 氫氧化鈉 于沸水中煮3 4min 液體比未加熱前清晰很多 再加2 鹽酸酸化 液體變未混濁 說(shuō)明被檢出樣品中含有萜類(lèi)內(nèi)酯或者香豆素類(lèi)化合物 萜類(lèi)內(nèi)酯與香豆素類(lèi)化合物 2 香豆素的呈色反應(yīng) 將中性乙酸乙酯溶液點(diǎn)于紙上 先噴灑0 5 的碳酸鈉水溶液 于60 加熱20min左右 香豆素內(nèi)酯開(kāi)環(huán)后產(chǎn)生酚性羥基 進(jìn)行酚的呈色反應(yīng) 另外液可以噴灑0 9 4 氨基安替比林和5 4 的鐵氰化鉀水溶液 就呈紫紅色斑點(diǎn) 如香豆素開(kāi)環(huán)后的羥基再對(duì)位有取代基時(shí) 不顯色 萜類(lèi)內(nèi)酯與香豆素類(lèi)化合物 3 羥胺反應(yīng) 制備 a 新鮮的1N鹽酸羥胺的甲醇液 b 1 1N氫氧化鉀的甲醇液 將中性的乙酸乙酯溶液點(diǎn)于紙片上再將a b二溶液按1 1 V V 混合后噴在紙上 于空氣中干燥10min左右 再用溶于1 鹽酸中的1 三氯化鐵溶液噴于紙上 內(nèi)酪化合物和一些酯類(lèi)化合物呈紅色斑點(diǎn) 萜類(lèi)內(nèi)酯與香豆素類(lèi)化合物 4 間硝基甲苯試劑 Zimmermann s 取中性的乙酸乙酯液 點(diǎn)在紙上 配制2 的間硝基甲苯乙醇液 待乙醇揮發(fā)后 再用2 5N氫氧化鉀水溶液噴于紙上 隨后將紙片放在70 100 的烘箱中 如有內(nèi)酯存在就出現(xiàn)紫紅色斑點(diǎn) 萜類(lèi)內(nèi)酯與香豆素類(lèi)化合物 1 碘化汞鉀試劑 Mayerr試劑 取水溶液加鹽酸至酸性 或取酒精提取物稀鹽酸溶解部分 加碘化汞鉀試劑 如有白色或淡黃色沉淀可能含有生物堿 因?yàn)榉磻?yīng)沉淀物能溶解于該試劑中 所以試劑不能加得過(guò)多 生物堿 2 碘化鉍鉀試劑 Dragendorff試劑 試樣同上 也呈酸性 加碘化鉍鉀試劑立即有橘紅色或黃色沉淀出現(xiàn)亦可能有生物堿 本反應(yīng)于紙片上進(jìn)行較為敏感 生物堿 3 硅鎢酸試劑 1g硅鎢酸溶于20mL水中 加10 鹽酸使呈酸性 試液如有生物堿 與硅鎢酸試劑相遇即產(chǎn)生灰白色或淺黃色沉淀 堿性氨基酸 內(nèi)酯化合物和生物胺也發(fā)生類(lèi)似顯色反應(yīng) 生物堿 1 茚三酮 Ninhydrin 試劑 樣品點(diǎn)在紙片上 滴上或噴灑0 2 茚三酮酒精溶液后 在100 左右的烘箱中放置2min 如有氨基酸和肽 就呈紫紅色或藍(lán)色斑點(diǎn) 也有少數(shù)氨基酸呈黃色斑點(diǎn) 亦可以在試管中進(jìn)行 取水提取液lmL加試劑2 3滴而后在沸水浴上加熱5min 冷后有藍(lán)或藍(lán)紫色出現(xiàn)表明有氨基酸或多肽 氨基酸和肽 2 吲哚醌 Isatin試劑 溶液 100mL1 的吲哚醌丙酮溶液 加10mL醋酸即可 將樣品點(diǎn)在紙上 滴上或噴灑吲哚醌試劑后 用吹風(fēng)機(jī)吹干 在120 加熱5min就呈各種顏色 本試劑主要對(duì)氨基酸 氨基酸衍生物及小肽有顏色反應(yīng) 肽越大靈敏度越差 氨基酸和肽 3 雙縮脲反應(yīng) 試劑為1 硫酸銅和40 氫氧化鈉溶液等量混合 本試劑主要是Cu 與蛋白質(zhì)或肽分子中肽鍵 CO NH絡(luò)合呈色 取1ml水浸液加入上述試劑 振搖 冷時(shí)顯紫紅表示可能有蛋白質(zhì)或肽 氨基酸和肽 4 酸性蒽醌紫 商品名 Solwaypurple 100mL0 05 酸性蒽醌紫溶液 加0 5mL硫酸即成 將水浸出液點(diǎn)在紙片上 就呈紫色 氨基酸 肽均不顯色 氨基酸和肽 5 溴百里藍(lán)鈉鹽溶液 將水浸出液點(diǎn)在紙上 噴灑上述試劑 就呈此紫色或綠色 若顯色不夠明顯 稍烘一下即可 背景為黃色 氨基酸和肽 用酸性蒽醌紫 溴百里藍(lán)鈉鹽溶液 雙縮脲反應(yīng)來(lái)鑒別 方法同上 蛋白質(zhì) 1 費(fèi)林試劑 Fehling試劑 水浸液試樣加費(fèi)林試劑 在沸水浴上加熱數(shù)分鐘 如果產(chǎn)生紅色的氧化亞銅沉淀 證明含有還原糖 若試樣不含還原糖 可將水浸液加少量鹽酸煮沸約30min 加氫氧化鈉溶液中和至堿性 然后加費(fèi)林試劑在沸水浴上加熱數(shù)分鐘 如果產(chǎn)生紅色沉淀 就可能含有配糖體或者多糖類(lèi)化合物 糖 多糖和配糖體 甙 2 萘酚試劑 Molish試劑 配置10 的 萘酚乙醇溶液 樣品以稀乙醇或水溶解 置試管內(nèi) 加入 萘酚試液數(shù)滴 此后再沿著試管壁滴加少量濃硫酸 如與濃硫酸的接觸面產(chǎn)生紫紅色環(huán)即有還原糖或其他還原性物質(zhì)存在 糖 多糖和配糖體 甙 3 氨性硝酸銀試劑 0 1N硝酸銀溶液和5N的氨水等量混和 樣品點(diǎn)再紙上 噴灑上述試劑 再100 加熱5 10min 還原糖就呈褐色 糖 多糖和配糖體 甙 4 苯胺 鄰苯二甲酸鹽 苯胺0 93g和鄰苯二甲酸1 6g溶于100mL水飽和的正丁醇中 將樣品點(diǎn)在紙上 噴灑上述試劑 在105 加熱5min 還原糖就呈桃紅色 有時(shí)也呈棕色斑點(diǎn) 一般來(lái)講 呈紅色的為戊醛糖和2 己酮糖酸 呈棕色的為己醛糖和5 己酮糖酸 糖 多糖和配糖體 甙 5 間苯二胺試劑 0 2N間苯二胺70 乙醇溶液 將樣品點(diǎn)在紙上 噴灑上述試劑 在在105 加熱5min呈黃色熒光即證明含糖 糖 多糖和配糖體 甙 蒽醌類(lèi) 1 1 硼酸水溶液 將乙醇提取液點(diǎn)于紙片上噴灑上述試劑 就呈黃 橙 紅色熒光 2 10 氫氧化鉀水溶液 將乙醇提取液點(diǎn)于紙上 噴灑上述試劑 就呈黃 橙 紅色熒光 3 5 醋酸鎂的甲醇溶液 將乙醇浸取點(diǎn)在紙片上 噴灑上述試劑 就呈橙紅色 紫色 黃酮類(lèi) 1 1 的三氯化鋁乙醇溶液 或5 三氯化鋁水溶液 將樣品點(diǎn)在紙上 噴灑上述試劑 干燥后 黃色斑點(diǎn)于紫外熒光燈下顯明顯熒光 2 濃氨水溶液 把進(jìn)行層析后的濾紙?jiān)跐獍彼可涎?立即置于熒光