真核細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控.doc

MCB課程 真核細(xì)胞的基因表達(dá)和調(diào)控一，生物體內(nèi)遺傳物質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位是基因 上個(gè)世紀(jì)70年代在細(xì)胞生物學(xué)，細(xì)胞遺傳學(xué)和生物化學(xué)的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)一系列重大發(fā)現(xiàn)而奠定基礎(chǔ)，逐步發(fā)展形成了分子生物學(xué)(molecular biology)這一現(xiàn)代生命學(xué)科。分子生物學(xué)認(rèn)為生物體內(nèi)存在著決定生物體性狀的遺傳物質(zhì)，其基本的結(jié)構(gòu)和功能單位是基因(gene)?；虻谋举|(zhì)是一段攜帶著能合成功能蛋白質(zhì)所需的全部信息的DNA，其中包括著蛋白質(zhì)的編碼序列，也包括非編碼的調(diào)控序列?；蛑饕哂袃纱蠊δ?。一是指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)，通過(guò)蛋白質(zhì)發(fā)揮的功能將遺傳信息轉(zhuǎn)換成具體的細(xì)胞性狀和功能；二是通過(guò)細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中的DNA復(fù)制(replication)，將遺傳信息傳遞給子代細(xì)胞，從而保持子代細(xì)胞與母代細(xì)胞性狀的一致性。基因在雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA長(zhǎng)鏈組成的染色體上呈線性排列。在哺乳動(dòng)物的真核細(xì)胞中線性排列的基因以核小體 (nucleosome) 的形式被緊密包繞存在于細(xì)胞核中，組成核染質(zhì)(chromatin)。核小體的核心是由H2a,H2b,H3和H4四組組蛋白形成的八聚體，核心外包繞著1又3/4圈的DNA長(zhǎng)鏈。因此在電鏡下核染質(zhì)呈“串珠樣“結(jié)構(gòu)。由于基因的本質(zhì)是呈雙螺旋結(jié)構(gòu)的方向相反的兩條脫氧核糖核酸（DNA）分子，因此基因的排列具有方向性，其DNA分子的5端為基因的上游，3端為基因的下游。構(gòu)成基因DNA分子序列的有腺嘌呤（A）胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）和鳥(niǎo)嘌呤（G）4種堿基。在雙鏈DNA分子中一條DNA分子上的A總是以兩條氫鍵與 另一條DNA分子上的T相結(jié)合，而C總是以三條氫鍵與G相結(jié)合。A與T，C與G之間稱為互補(bǔ)關(guān)系(complementary)。雙鏈DNA分子中A,T,C,G的不同組合排列形成了三聯(lián)密碼，每一個(gè)三聯(lián)密碼都代表著一種相應(yīng)的氨基酸。然而，基因中的編碼序列往往并不連續(xù)，其中間隔著非編碼的序列。這些編碼的序列稱為基因結(jié)構(gòu)中的外顯子，而非編碼序列稱為內(nèi)含子。在基因的上游端具有啟動(dòng)基因表達(dá)作用的特殊序列稱為啟動(dòng)子，它們的序列中富含A,T,C, 在基因的上游，下游較遠(yuǎn)處，乃至基因內(nèi)部還有某些序列對(duì)基因的表達(dá)有明顯的促進(jìn)作用，稱為增強(qiáng)子?；虻南掠味送€有基因表達(dá)的終止信號(hào)。上述基因本身的主要結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱為基因的順式元件，而參與基因表達(dá)過(guò)程的基因外的蛋白質(zhì)因子稱為基因的反式元件（見(jiàn)下節(jié)）。上述排列著基因的DNA成為基因組DNA，真核細(xì)胞中除了基因組DNA攜帶遺傳信息外，線粒體中能獨(dú)立復(fù)制的DNA也攜帶著遺傳信息。( 圖1: 分子生物學(xué)的中心法則-基因的表達(dá) ) 二，生物個(gè)體的基因型決定了表現(xiàn)型分子生物學(xué)的中心法則 生物體內(nèi)基因所攜帶的遺傳信息是通過(guò)分子生物學(xué)中心法則(central dogma)所表述的過(guò)程轉(zhuǎn)變成生物體的性狀的。中心法則表明，一方面基因作為DNA可以通過(guò)復(fù)制使遺傳信息傳遞給新生的DNA分子，從而傳給子代細(xì)胞。另一方面，攜帶遺傳信息的DNA分子可以作為模版，通過(guò)轉(zhuǎn)錄(transcription)而傳遞給轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA（核糖核酸）分子, RNA又能通過(guò)翻譯(translation)將其攜帶的遺傳信息再轉(zhuǎn)換成多肽/蛋白質(zhì)，從而使基因所攜帶的遺傳信息最終轉(zhuǎn)換成功能蛋白質(zhì)而賦予生物體細(xì)胞特定的性狀。基因的遺傳信息從DNA的形式最終轉(zhuǎn)換成功能蛋白質(zhì)的整個(gè)過(guò)程稱為基因的表達(dá)。生物體內(nèi)基因的結(jié)構(gòu)和功能形式稱為基因型(genotype)，而生物體表現(xiàn)的外部形狀稱為表現(xiàn)型(phenotype)。所以，理論上生物體有怎樣的基因就會(huì)產(chǎn)生怎樣的性狀。生物體的基因型決定了表現(xiàn)型。但在實(shí)際的具體生物個(gè)體上，基因型與表現(xiàn)型的關(guān)系不一定很明確。特別是在真核細(xì)胞生物中，一方面其細(xì)胞中含有比原核細(xì)胞復(fù)雜得多的遺傳物質(zhì)，其基因的數(shù)目成千上萬(wàn)，基因結(jié)構(gòu)更精細(xì)更復(fù)雜。而這些遺傳物質(zhì)以一定的方式被緊緊包裹壓縮在細(xì)胞核內(nèi)的極小的空間里。另一方面，真核細(xì)胞生物大多數(shù)為多細(xì)胞生物，生物體內(nèi)往往已進(jìn)化出多種組織細(xì)胞，它們具有完全相同的基因型，卻在生物體生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段表現(xiàn)出不同的表型和功能。 所以，作為多細(xì)胞組成總體的真核細(xì)胞生物來(lái)說(shuō)，許多基因的功能不一定能在外部明確表現(xiàn)出來(lái)，許多基因的功能之間可以重疊和互補(bǔ)，因而掩蓋了某一單個(gè)基因的功能。同時(shí)，具有某一種功能的基因都是以等位基因的形式成對(duì)地分別排列在一對(duì)染色體的相應(yīng)位點(diǎn)上的。如果等位基因中的一個(gè)基因發(fā)生缺損，另一基因仍正常發(fā)揮功能，生物體的性狀并不發(fā)生改變，必須兩個(gè)基因都失去功能，生物體的性狀才會(huì)發(fā)生改變。這樣的基因稱為隱性基因。如果等位基因中的一個(gè)基因發(fā)生缺損生物體的性狀即發(fā)生改變。這樣的基因稱為顯性基因。此外在形成生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程中，線性排列在一對(duì)染色體上的幾個(gè)基因有可能由于一段染色體的同源交叉(crossover)而變換位置，發(fā)生重組。如果不同基因之間距離很近，往往同時(shí)變換位置，因而重組體的子代細(xì)胞中，它們決定的幾種性狀也往往同時(shí)出現(xiàn)或改變。這些基因之間稱為具有連鎖關(guān)系(linkage). 位于性染色體X上的基因?yàn)樾赃B鎖基因，它們所決定的性狀與一定的性別同時(shí)出現(xiàn)，稱為伴性遺傳。 總之，真核細(xì)胞生物的基因型和表現(xiàn)型之間的相互關(guān)系日趨復(fù)雜和精細(xì)，而兩者之間的關(guān)系，即細(xì)胞的基因型如何轉(zhuǎn)換成表現(xiàn)型，就取決于基因如何表達(dá)的過(guò)程和被調(diào)控的機(jī)理。 Staudt LM. N Engl J Med. 2003;348:1777-1785三，真核細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)過(guò)程和調(diào)控機(jī)理 真核細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)是一個(gè)多步驟的，連續(xù)的，精細(xì)復(fù)雜的過(guò)程。主要可分為轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后加工，翻譯和翻譯后修飾三個(gè)大階段。轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步，是在細(xì)胞核內(nèi)由單鏈的基因組DNA為模版，以RNA聚合酶和一系列酶為工具進(jìn)行的合成反應(yīng)，其產(chǎn)物是單鏈的RNA分子。轉(zhuǎn)錄從基因上游5端的啟動(dòng)子開(kāi)始，RNA聚合酶II為主的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物（主要是通用轉(zhuǎn)錄因子GTFs與其他因子構(gòu)成的全酶 holoenzyme）.結(jié)合到啟動(dòng)子上后不斷沿著DNA模版向基因的3端移動(dòng)，轉(zhuǎn)錄也即開(kāi)始從基因的5端向3端進(jìn)行。直到RNA聚合酶II為主的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物達(dá)到模版上基因的終止信號(hào)后，轉(zhuǎn)錄復(fù)合物即與模版分離，使轉(zhuǎn)錄停止。轉(zhuǎn)錄過(guò)程中RNA聚合酶II根據(jù)與DNA模版序列的互補(bǔ)原則，將帶有四種堿基的核苷酸聚合成RNA分子，不過(guò)RNA中不存在T，由與A互補(bǔ)的U代替。為了使RNA聚合酶和其他蛋白質(zhì)因子易于結(jié)合到基因的啟動(dòng)子上，首先必須使基因所在的核染質(zhì)的空間構(gòu)型松解開(kāi)放，雙鏈DNA必須解聚為單鏈，這些都需要一系列酶的參與，如拓?fù)涿福庑傅?，也涉及核染質(zhì)構(gòu)型的重塑機(jī)制 (chromatin remodeling). 這一過(guò)程主要是由構(gòu)成核小體中的組蛋白在核內(nèi)酶的作用下發(fā)生周期性的乙酰化和去乙?；瑥亩购巳举|(zhì)的構(gòu)型不斷發(fā)生緊縮閉合和松解開(kāi)放的交替變化。當(dāng)核染質(zhì)松解開(kāi)放時(shí)，外來(lái)的轉(zhuǎn)錄因子等蛋白質(zhì)容易接近而與DNA上基因的轉(zhuǎn)錄啟始點(diǎn)結(jié)合而啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄；反之，當(dāng)核染質(zhì)變得緊縮閉合時(shí)，外來(lái)的轉(zhuǎn)錄因子等蛋白質(zhì)難以接近DNA上基因的轉(zhuǎn)錄啟始點(diǎn)，因而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。AcetylationDeacetylation （圖2: 核小體組成的核染質(zhì)的重塑）新生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA稱為核內(nèi)不均一RNA，很不穩(wěn)定，容易降解。必須經(jīng)過(guò)RNA的轉(zhuǎn)錄后加工(post-transcriptional processing)才能成為穩(wěn)定的mRNA. 大約只有15-20%的核內(nèi)不均一RNA被加工成mRNA.，通過(guò)細(xì)胞核核膜上的核孔輸出到細(xì)胞質(zhì)中，到核糖體上進(jìn)一步翻譯。RNA的轉(zhuǎn)錄后加工主要包括在5端加上 M-7Gppp 帽，在3端加上約20個(gè)多聚腺苷酸 (poly A)的尾,以及RNA分子的剪切(splicing). 剪切是復(fù)雜精細(xì)的過(guò)程，由核內(nèi)剪切子(spliceosome)或稱snRNPs介導(dǎo)進(jìn)行，它可識(shí)別RNA中內(nèi)含子5端和3端的GU和AG，將前后兩個(gè)外顯子的兩端拉近，中間內(nèi)含子部分形成的攀被RNA酶切除后，各外顯子就連接成完整的mRNA.。由于剪切過(guò)程中可以發(fā)生不同的剪切方式，即選擇性剪切 (alternative splicing), 形成的mRNA.中可能含有同一基因的多段不同的外顯子成分，因而可翻譯成幾種結(jié)構(gòu)和功能不完全相同的蛋白質(zhì)異構(gòu)體。使單一的基因可以編碼幾種蛋白質(zhì)。mRNA在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)翻譯的場(chǎng)所是核糖體(ribosome),它由60S 和40S的兩個(gè)亞單位組成，其中分別含有28S 和18S兩種核糖體RNA（rRNA）。mRNA分子遭遇附著核糖體后，其戴帽的5端就從兩個(gè)亞單位之間穿過(guò)并前行。也即核糖體沿著作為模版的mRNA從5端向3端移動(dòng)。隨著移動(dòng)核糖體就能讀出mRNA分子序列中的三聯(lián)密碼，每種三聯(lián)密碼都編碼一種氨基酸，但每種氨基酸可以有幾種相應(yīng)的三聯(lián)密碼，其中AUG不編碼氨基酸，而代表翻譯的起始密碼，UAA，UGA和 UAG代表翻譯終止的密碼?；虻姆g還需要轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）的參加。tRNA分子呈三葉草狀，一條臂可與rRNA相連合，一條臂攜帶一個(gè)氨基酸，另一條臂為反密碼臂。當(dāng)核糖體讀到某三聯(lián)密碼時(shí)，具有與此密碼互補(bǔ)的反密碼臂的tRNA就會(huì)結(jié)合到核糖體上，從而將相應(yīng)的氨基酸帶來(lái)并整合到氨基酸鏈上。隨著氨基酸的增加，合成的肽鏈不斷延長(zhǎng)。直到核糖體讀到終止密碼，mRNA分子與核糖體分離，翻譯即告終止。從AUG開(kāi)始，三聯(lián)密碼必須遵循一定的開(kāi)放閱讀框架 (open reading frame ORF) 閱讀，直到終止密碼，才能合成正確的氨基酸肽鏈，如果ORF改變，合成的氨基酸肽鏈也就變了。例如當(dāng)mRNA模版發(fā)生突變或缺失時(shí)ORF發(fā)生改變。此時(shí)，合成的肽鏈中某些氨基酸可能發(fā)生改變，使其功能受到一定影響，這種突變成為誤義突變。也可能所發(fā)生突變或缺失使終止密碼提早出現(xiàn)，從而使肽鏈不能合成或僅僅能合成很短，并導(dǎo)致喪失功能，這種突變成為無(wú)義突變。一條mRNA模版可以同時(shí)穿過(guò)多個(gè)核糖體，也即多個(gè)核糖體可同時(shí)按序從mRNA分子的5端向3端移動(dòng)，所以一條mRNA模版可以同時(shí)翻譯合成多條肽鏈。翻譯合成的肽鏈尚不是最終產(chǎn)物功能蛋白質(zhì)，還必須經(jīng)過(guò)翻譯后加工，包括肽鏈間的連接裁剪，形成蛋白質(zhì)后分子的折疊，以及糖基化，磷酸化，乙?；刃揎棧拍茏詈蟪蔀榫哂泄δ艿牡鞍踪|(zhì)。 （圖3: 真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的模式圖）處于某一時(shí)刻的真核細(xì)胞內(nèi)并非所有的基因都在同時(shí)有同樣水平的表達(dá)。對(duì)于一個(gè)細(xì)胞體內(nèi)每時(shí)每刻都在進(jìn)行的如此精細(xì)復(fù)雜的多步驟的連續(xù)過(guò)程，顯然需要有一套精密靈敏的調(diào)控機(jī)制加以掌握，才能保證所有基因在質(zhì)，量和時(shí)空各方面的準(zhǔn)確高效表達(dá)，以敷細(xì)胞各種生理功能行為之需。如果表達(dá)調(diào)控機(jī)制出了差錯(cuò)，必然使細(xì)胞遭受危害，甚至是致命的打擊。所以基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理是分子生物學(xué)理論研究的核心問(wèn)題。目前可將基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理簡(jiǎn)單歸納如下：在轉(zhuǎn)錄前，主要是確定將啟動(dòng)表達(dá)的有哪些基因，此基因所在的核染質(zhì)構(gòu)型是否松解開(kāi)放，該基因是否具備完備有效的啟動(dòng)子等順式元件和其他轉(zhuǎn)錄條件。而被啟動(dòng)表達(dá)的基因往往必須首先感知到編程的信號(hào)或來(lái)自細(xì)胞外部而傳入的信號(hào)，所以這些信號(hào)和指令是基因表達(dá)的先決條件。在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，影響轉(zhuǎn)錄效率的主要是結(jié)合到DNA模版上的各種轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)。轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)至今已逾20年，做為基因轉(zhuǎn)錄的反式元件，早先對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的一般概念是它含有兩種結(jié)構(gòu)域: DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域使之與DNA相連，激活或抑制結(jié)構(gòu)域使之能調(diào)控轉(zhuǎn)錄。近年的研究對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的認(rèn)識(shí)又有顯著的深化和發(fā)展。例如，轉(zhuǎn)錄因子在缺乏DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域時(shí)也可通過(guò)蛋白質(zhì)之間的相互作用而與基因DNA上的啟動(dòng)子結(jié)合。又如轉(zhuǎn)錄因子可同時(shí)含有激活和抑制結(jié)構(gòu)域，而DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域本身就可起轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域的作用。另一個(gè)重要概念是轉(zhuǎn)錄因子一般并非單獨(dú)起作用，而是多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)相互作用，協(xié)同或組成復(fù)合物形式來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子的作用需要其他蛋白質(zhì)作為共活化或共抑制因子參與，而轉(zhuǎn)錄因子的功能本身也受一些小分子或其本身翻譯后的修飾所調(diào)控，這種調(diào)控可通過(guò)多渠道，并發(fā)生在多層面上。影響轉(zhuǎn)錄水平的另一重要機(jī)理是基因啟動(dòng)子序列內(nèi)CpG的甲基化，高甲基化會(huì)導(dǎo)致基因的低轉(zhuǎn)錄表達(dá)，甚至使基因沉默(gene silencing). 這些機(jī)理都是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控主要作用于RNA的加工環(huán)節(jié)。新生的RNA分子能否正確地“戴帽”“加尾”關(guān)系到形成的mRNA的穩(wěn)定性，能否穩(wěn)定地被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中，并順利附著到核糖體上進(jìn)行下一步的翻譯。不能“戴帽”“加尾”的RNA將很快降解。另一個(gè)轉(zhuǎn)錄后加工的重要環(huán)節(jié)就是剪切。它關(guān)系到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是否正確以及最終是否能獲得功能蛋白質(zhì)產(chǎn)物。這一步驟精細(xì)復(fù)雜，往往易出差錯(cuò)而影響下一步的翻譯，是進(jìn)行調(diào)控的重要環(huán)節(jié)。翻譯過(guò)程中主要影響因素是mRNA分子5端帽結(jié)構(gòu)和3端的非翻譯區(qū)5-UTR和 3-UTR，其中前者的影響更大。5-UTR的突變或缺失會(huì)使翻譯效率大受影響。mRNA的穩(wěn)定性也是影響翻譯效率的重要因素。穩(wěn)定的mRNA分子可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)作為模版而翻譯出較多的肽鏈，而不穩(wěn)定的mRNA分子僅能充當(dāng)幾次模版就降解了。綜上所述，基因的表達(dá)處在非常復(fù)雜的調(diào)控機(jī)理控制下，任何環(huán)節(jié)發(fā)生問(wèn)題和差錯(cuò)，都會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)在質(zhì)，量和時(shí)空方面的異常，從而導(dǎo)致細(xì)胞表型的紊亂，影響細(xì)胞的正常生理功能和行為。四，真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳學(xué)調(diào)控：近年來(lái)提出了表觀遺傳學(xué)調(diào)控的概念。這一概念主要來(lái)自對(duì)真核細(xì)胞發(fā)育進(jìn)化過(guò)程的考察發(fā)現(xiàn)真核細(xì)胞內(nèi)的基因的數(shù)量增加與其功能的多樣化完全不相稱。最明顯的現(xiàn)象是人類基因組的研究結(jié)果表明人類的基因組中只含有大約28000 - 30000個(gè)基因，而這比人們根據(jù)人類所具有的復(fù)雜功能所想象的基因數(shù)目要少得多，與簡(jiǎn)單的低等動(dòng)物的基因組中的基因數(shù)相比并沒(méi)有多少增加。在類似的環(huán)境下的遺傳背景相似的真核細(xì)胞生物，其表現(xiàn)出來(lái)的功能表型可以有很大的差異。這些現(xiàn)象提示真核細(xì)胞生物進(jìn)化過(guò)程中獲得的復(fù)雜多樣的表型并非僅靠基因數(shù)目的增加，而更重要是靠每一個(gè)基因表達(dá)方式的增加，即單個(gè)基因表達(dá)能被編程和調(diào)控的方式變得越來(lái)越復(fù)雜多樣。這些無(wú)形的基因表達(dá)和調(diào)控的方式并不因?yàn)槟复?xì)胞分裂為子代細(xì)胞而消失，相反它可以在基因數(shù)目本身和DNA序列并無(wú)改變的情況下通過(guò)減數(shù)分裂或有絲分裂而遺傳給子代。所以我們現(xiàn)在可以將真核細(xì)胞內(nèi)包含的信息分為兩種：有形的遺傳信息和無(wú)形的表觀遺傳信息。遺傳信息為真核細(xì)胞制造所有必須的蛋白質(zhì)提供了藍(lán)圖，而表觀遺傳學(xué)信息則為細(xì)胞何時(shí)何地如何使用這些藍(lán)圖提供了指令。在結(jié)構(gòu)基因組學(xué)進(jìn)入功能基因組學(xué)的時(shí)代，很顯然，研究無(wú)形的表觀遺傳學(xué)的調(diào)控機(jī)理比有形的基因結(jié)構(gòu)的遺傳學(xué)對(duì)闡明真核細(xì)胞生物的功能具有更重大深遠(yuǎn)的意義。 目前認(rèn)為表觀遺傳學(xué)機(jī)理是細(xì)胞genotype和phenotype之間的橋梁。在細(xì)胞genotype不變的情況下，環(huán)境的作用也會(huì)通過(guò)影響表觀遺傳學(xué)的調(diào)控機(jī)理，從而改變細(xì)胞的phenotype。不過(guò)環(huán)境影響所致的表觀遺傳學(xué)的改變往往非常微細(xì)和緩慢，不易覺(jué)察，且這種改變?cè)谔囟〞r(shí)間段內(nèi)是可逆的，因此，細(xì)胞的Phenotype 的改變不一定顯現(xiàn)出來(lái)。各組織體細(xì)胞隨著正常的發(fā)育分化過(guò)程根據(jù)其內(nèi)在的表觀遺傳學(xué)機(jī)理對(duì)基因的總體轉(zhuǎn)錄實(shí)行編程(program), 決定基因轉(zhuǎn)錄的態(tài)勢(shì)，從而賦予分化成熟的各組織細(xì)胞特定的表型。如果人為地改變環(huán)境而改變一系列表觀遺傳學(xué)作用機(jī)制，可以使體細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄的總態(tài)勢(shì)被“重編程”(reprogramming)，從而改變體細(xì)胞的Phenotype,甚至賦予成熟的體細(xì)胞新的“多能性”(pluripotency)。多細(xì)胞的真核細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)激活的核心問(wèn)題是基因所處的染色質(zhì)的修飾，即一方面包裹在致密的染色質(zhì)中的某個(gè)靶基因如何通過(guò)染色質(zhì)組蛋白的修飾和重塑而被識(shí)別并激活，另一方面又需防止這些修飾重塑的染色質(zhì)的范圍蔓延擴(kuò)散而使不應(yīng)表達(dá)的基因被激活。典型的染色質(zhì)修飾起源于基因組的某一點(diǎn)（一般相當(dāng)于某基因的增強(qiáng)子），再向周圍擴(kuò)散，一般是單方向的。這種染色質(zhì)的修飾會(huì)受到某些基因邊緣的DNA序列的限制，這些序列稱為邊界元素(boundary element)或絕緣子(insulator)，對(duì)它們的作用和機(jī)理目前所知甚少。這些序列可能與特定的蛋白質(zhì)結(jié)合，也可能在復(fù)合位點(diǎn)中將不同組織特異性增強(qiáng)子分隔開(kāi)，使某一時(shí)間只有一種增強(qiáng)子發(fā)揮功能。邊界元素防止中心?；蚨肆Ｌ幍漠惾旧|(zhì)擴(kuò)散到常染色質(zhì)區(qū)域。4.1，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重塑機(jī)理及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重塑調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄主要通過(guò)兩種復(fù)合物來(lái)進(jìn)行。一是ATP依賴的酶復(fù)合 物，應(yīng)用ATP作為能量水解破壞和改變局部組蛋白與DNA鏈之間結(jié)合；二是組蛋白的乙 酰化和去乙?；笍?fù)合物改變組蛋白氨基端的乙?；潭?。 4.1.1, 組蛋白的乙?；腿ヒ阴；c基因轉(zhuǎn)錄活化和抑制 組蛋白的翻譯后乙?；腿ヒ阴；饕山M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase, HAT）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase, HDAC）復(fù)合物分別執(zhí)行。組蛋白的乙?；欣诨蜣D(zhuǎn)錄的活化。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的組蛋白乙?；福╤istone acetylase）有p300/CBP(CREB-binding protein)。它是CREB(cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein) 轉(zhuǎn)錄因子的共刺激因子。許多轉(zhuǎn)錄因子都需與p300/CBP結(jié)合成復(fù)合物來(lái)激活轉(zhuǎn)錄。p300/CBP本身具有乙酰化酶活性，與其結(jié)合的p/CAF和 hGCN5以及TAF250也可能有組蛋白乙酰化酶活性。這幾種乙?；附M成的復(fù)合物被轉(zhuǎn)錄因子帶到特異性基因啟動(dòng)子激活轉(zhuǎn)錄。此外ACTR (activator of the thyroid and retinoic acid receptor) 和 SRC-1(steroid receptor coactivator)也具有乙?；富钚裕谀承┗蜣D(zhuǎn)錄活化中起作用。多種組蛋白乙酰化酶往往組成不同的復(fù)合物共同激活一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，提示不同的乙?；缚赡茏饔糜诓煌暮藘?nèi)組蛋白底物，表明了問(wèn)題的復(fù)雜性。 另一方面，組蛋白的去乙?；种苹虻霓D(zhuǎn)錄。長(zhǎng)期以來(lái)就知道某些物質(zhì)，如丁酸鈉，trichostatin A和 trapoxin 會(huì)造成組蛋白高乙?；?。它們都是組蛋白去乙?；福℉DAC）的抑制劑，丁酸鈉的作用較為非特異，而trichostatin A和 trapoxin分別可逆和不可逆地特異性抑制組蛋白去乙?；?。HDAC是進(jìn)化中高度保守的，它一般都以與Sin3 和Rb等共抑制因子組成的復(fù)合物形式存在，并被某些特異的DNA結(jié)合性轉(zhuǎn)錄因子，如Mad, E2F和未結(jié)合配體的核激素受體，帶到DNA特定序列附近。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)HDAC涉及基因前CpG的甲基化過(guò)程而抑制基因的轉(zhuǎn)錄，甲基化的CpG及與之特異性結(jié)合的Mecp2蛋白已知能使基因沉默。目前認(rèn)為是Mecp2能將Sin3和HDAC拉近DNA上的啟動(dòng)子序列從而抑制轉(zhuǎn)錄。有趣的是，大多數(shù)組裝著HDAC復(fù)合物的DNA序列都可對(duì)其下游基因轉(zhuǎn)錄有著兩種相反的調(diào)控功能，是使轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)還是沉默取決于組裝其上的是組蛋白乙?；笍?fù)合物，還是HDAC復(fù)合物。不同真核細(xì)胞內(nèi)有多種HDAC/Rpd3蛋白質(zhì)。人類的3種HDAC/Rpd3蛋白質(zhì)在各種組織細(xì)胞中都表達(dá)，似乎沒(méi)有組織特異性的表達(dá)譜，對(duì) 4種組蛋白底物也未報(bào)導(dǎo)有作用特異性。其轉(zhuǎn)錄抑制功能來(lái)自去乙?；拿笇W(xué)活性，如果HDAC/Rpd3突變使去乙?；钚匀毕?，則以顯性負(fù)作用方式使轉(zhuǎn)錄抑制功能喪失。 4.1.2, ATP依賴性染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑復(fù)合物與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控 除了對(duì)組蛋白的乙?；揎椡猓硪活悈⑴c染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑的酶復(fù)合物也調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，它們含有腺嘌呤三磷酸腺苷酶(ATPase) 活性，能利用ATP提供能量水解而破壞或改變局部DNA與組蛋白間的相互作用。這類復(fù)合物包括酵母中的SWI/SNF 和高等真核細(xì)胞中的 BRG1和BRM. 它們都能改變核小體的結(jié)構(gòu)而使轉(zhuǎn)錄因子易與之結(jié)合。酵母中的RSC (remodeling the structure of chromatin)和果蠅中的NURF (nucleosome-remodeling factor)都含這類復(fù)合物。這些不同物種的復(fù)合物中雖然包括不同的組分并具有各異的性質(zhì)，但他們都含有SWI/SNF相關(guān)的亞單位，因而具有ATPase 和螺旋酶(Helicase)活性。實(shí)驗(yàn)表明人類hSWI/SNF的作用是使核小體在正常構(gòu)型和較開(kāi)放的構(gòu)型之間可逆地交互變換。這一變換之際為轉(zhuǎn)錄因子接近并與DNA結(jié)合提供了機(jī)會(huì)。雖然一般認(rèn)為ATP驅(qū)動(dòng)的染色質(zhì)重塑活性與組蛋白乙?；煌?，但近來(lái)的研究表明兩種活性可能密切相連。例如應(yīng)用HDAC1和HDAC2單抗提純細(xì)胞內(nèi)組蛋白去乙?；赶嚓P(guān)蛋白時(shí)，發(fā)現(xiàn)多個(gè)含有HDAC1/2的蛋白復(fù)合物，而在這樣的復(fù)合物中就有兩種蛋白質(zhì)(CHD-3,CHD-4)是SWI/SNF樣蛋白質(zhì)，具有ATP依賴性染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑活性。這種活性雖非為使組蛋白去乙酰所必需，但能促進(jìn)其組蛋白去乙?；傅幕钚?。此復(fù)合物稱為NRD (nucleosome remodeling and histone deacetylases), 其兩種活性相輔相成，能充分地調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中BRG1和BRM.具有ATPase酶活性，是SWI/SNF復(fù)合物中的主要成分，有利于促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。它們常與Rb蛋白相互作用，而Rb常會(huì)拉近組蛋白去乙酰化酶來(lái)抑制轉(zhuǎn)錄。這提示兩種相反的染色質(zhì)重塑活性結(jié)成對(duì)子，可能是調(diào)控轉(zhuǎn)錄的一種常見(jiàn)形式。長(zhǎng)期以來(lái)，人們較多關(guān)注轉(zhuǎn)錄因子對(duì)真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的作用，近兩年的發(fā)現(xiàn)表明轉(zhuǎn)錄因子激活轉(zhuǎn)錄還必須通過(guò)與某些基本的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中的成分相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)。轉(zhuǎn)錄需要分幾步進(jìn)行。第一步由上述兩種不同的染色質(zhì)重塑機(jī)制（組蛋白乙?；虯TP依賴性染色質(zhì)重塑活性）協(xié)同重塑細(xì)胞染色質(zhì)，然后由轉(zhuǎn)錄因子和基本的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中的成分相互作用，并與基因啟動(dòng)子DNA上轉(zhuǎn)錄活化基序結(jié)合，從而使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物參與激活轉(zhuǎn)錄。在這過(guò)程的開(kāi)始，一類轉(zhuǎn)錄因子可能首先與處于核小體之間的DNA上轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，并將組蛋白乙?；笍?fù)合物拉近DNA而乙酰化核小體中的組蛋白，開(kāi)放核小體結(jié)構(gòu)，使之易于接受其他轉(zhuǎn)錄因子或基本轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。然后第二類轉(zhuǎn)錄因子再引入其他基本轉(zhuǎn)錄復(fù)合物而激活轉(zhuǎn)錄。同樣，轉(zhuǎn)錄抑制可能也是這樣兩步的過(guò)程。 4.1.3, DNA甲基化和染色質(zhì)蛋白甲基化對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的影響 基因組含有遺傳(genetic)和表觀遺傳(epigenetic)兩類信息。遺傳信息為合成生命所需的全部蛋白質(zhì)提供藍(lán)本，而遺傳外信息為遺傳信息在何時(shí)何地如何發(fā)揮作用提供指令。最重要的遺傳外信息是DNA的甲基化，也即在CpG中的胞嘧啶的5位上以共價(jià)鍵加上甲基基團(tuán)的態(tài)勢(shì)。DNA的甲基化對(duì)哺乳動(dòng)物的基因組有重大的影響，包括對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的抑制，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾，X染色體失活和基因組的完整性和穩(wěn)定性等。CpG的甲基化由三種獨(dú)立的甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1, DNMT3A 和DNMT3B催化。最近還克隆了第四種甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT2。利用果蠅基因敲除實(shí)驗(yàn)表明DNMT3屬于“初始類”（de.novo）,而DNMT1屬于“維持類”（maintenance）。因?yàn)镈NMT1敲除的ES細(xì)胞仍能保持初始的甲基化活性，而DNMT3A 和DNMT3B的純合缺失并不能改變ES細(xì)胞中已存在的DNA甲基化態(tài)勢(shì)。但DNMT1基因的雜合性缺失卻造成甲基化胞嘧啶的含量減少70%。不過(guò)某些轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果也提出了爭(zhēng)議。有可能此3種DNMT酶在體內(nèi)都具有起始和維持甲基化的功能，它們對(duì)特定的基因組DNA的轉(zhuǎn)甲基功能必須視與其他核蛋白或DNA結(jié)合因子的相互作用而定。ICF是一種極為罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病，具有嚴(yán)重的免疫缺陷（至少2種免疫球蛋白嚴(yán)重減低），伴有呼吸道感染，不同程度智力低下，發(fā)育遲緩和奇特面容。目前研究表明，ICF可能由DNMT3B基因在不同區(qū)段的突變而使甲基化功能減低或影響其與其他DNA結(jié)合蛋白的相互作用所致。多種智力低下的遺傳病均有細(xì)胞內(nèi)甲基化的缺陷，提示甲基化介導(dǎo)的染色質(zhì)修飾可能對(duì)腦的發(fā)育具有特殊的重要意義。在腫瘤細(xì)胞中，基因組的甲基化態(tài)勢(shì)經(jīng)常有很大改變。在基因組整體低甲基化的大環(huán)境中特定區(qū)域出現(xiàn)高甲基化。大多數(shù)低甲基化發(fā)生在正常時(shí)原本高甲基化的重復(fù)或“寄生”的元件區(qū)域，使這些轉(zhuǎn)座元件的轉(zhuǎn)錄增加而增加了基因組的不穩(wěn)定性。許多實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明DNA甲基化對(duì)腫瘤發(fā)生具有早期直接的作用。例如在某些抑癌基因（如Rb）的啟動(dòng)子處發(fā)生高甲基化，就可使抑癌基因的表達(dá)沉默而使細(xì)胞獲得增殖的優(yōu)勢(shì)。又如具有微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的大腸癌細(xì)胞中錯(cuò)配基因hMLH1的啟動(dòng)子也發(fā)生高甲基化而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默。此外，在實(shí)驗(yàn)性腫瘤模型和自然發(fā)生的肺癌上皮細(xì)胞中也可測(cè)知P16INK4a的啟動(dòng)子高甲基化。在腫瘤細(xì)胞DNA中約45000個(gè)CpG中，有人分析了98種腫瘤標(biāo)本中的1184個(gè)CpG的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)平均608個(gè)CpG有異常甲基化（最高可達(dá)4500個(gè)CpG）。但甲基化程度在不同個(gè)體和不同腫瘤類型之間有差別。乳腺，頭頸部和睪丸瘤的CpG異常甲基化率較低而大腸癌，腦膠質(zhì)瘤和白血病細(xì)胞的異常甲基化率顯著增高。此外，CpG的異常甲基化并非隨機(jī)分布，提示某些基因CpG比其他處更易甲基化或某些基因CpG丟失甲基化能使細(xì)胞獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。甲基化的DNA可能通過(guò)與之結(jié)合的MeCP2蛋白拉近HDAC，而使局部染色質(zhì)核組蛋白去乙?；瑥亩种妻D(zhuǎn)錄。除了MeCP2以外，近來(lái)還發(fā)現(xiàn)MBD1,2,3 , RbAp46/48等蛋白質(zhì)也與甲基化的DNA相連，并與染色質(zhì)重塑機(jī)理相關(guān)。除了DNA甲基化外，近來(lái)發(fā)現(xiàn)核內(nèi)組蛋白在賴氨酸和精氨酸位上的甲基化也能與組蛋白的其他翻譯后修飾共同調(diào)控染色質(zhì)構(gòu)型和基因的轉(zhuǎn)錄。在H3分子的核心及尾部的多處賴氨酸位點(diǎn)，以及H4尾部單個(gè)賴氨酸位點(diǎn)可發(fā)生甲基化，此外，還有H3的三處精氨酸位點(diǎn)和H4上一處精氨酸位點(diǎn)也發(fā)生甲基化。許多轉(zhuǎn)錄因子和與RNA加工過(guò)程相關(guān)的蛋白質(zhì)也都會(huì)甲基化，提示核內(nèi)許多蛋白質(zhì)的甲基化也可通過(guò)其他途徑調(diào)控轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后步驟。在表觀基因組(Epigenome)中（見(jiàn)下圖），H3K4me1, H3K36me3和H3K4ace是染色質(zhì)開(kāi)放（呈常染色質(zhì)），基因轉(zhuǎn)錄活化的標(biāo)志；相反，H3K9me2,3和H3K27me3是染色質(zhì)閉鎖（異染色質(zhì)），基因轉(zhuǎn)錄受抑而靜息的標(biāo)志。組蛋白賴氨酸的甲基化由賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(KMTs或 HMTs)催化。這些酶大多數(shù)含有保守區(qū)SET結(jié)構(gòu)域。與組蛋白乙?；嗤?，組蛋白甲基化也是可逆的。兩族賴氨酸去甲基化酶(KDMs), 包括LSD1和Jumonji酶可使H3或H4的賴氨酸去甲基化。同樣，不同的酶也可使精氨酸去甲基化。這些組蛋白甲基化和乙酰化修飾相互排斥，也可相互轉(zhuǎn)換，從而使不同基因的轉(zhuǎn)錄態(tài)勢(shì)處于某種動(dòng)態(tài)的平衡。在靜息或異染色質(zhì)區(qū)域，H3K9的甲基化與DNA的甲基化相關(guān)聯(lián)。 靶向H3K9 賴氨酸的酶是含SET結(jié)構(gòu)域的Suv39h1. HDAC對(duì)H3K9的去乙酰化必須發(fā)生在該位點(diǎn)的甲基化之前。甲基化的H3K9會(huì)募集蛋白質(zhì)HP1, 結(jié)合于H3K9me的HP1 則靶向激活DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 (DNMTs), 使該處的DNA發(fā)生甲基化。在整個(gè)基因組的范圍內(nèi)，標(biāo)示出各DNA序列所處的染色質(zhì)構(gòu)型的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志，從而顯示出各基因的轉(zhuǎn)錄活性，就形成了表觀基因組。 4,1,4 非編碼RNA近年來(lái)，繼在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)有小RNA (約50-200核苷酸) small RNA(sRNA)可調(diào)控靶基因的翻譯后，在大多數(shù)真核細(xì)胞內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有微小RNA (MicroRNA, miRNA)能調(diào)控許多基因的轉(zhuǎn)錄。miRNA是約22個(gè)核苷酸的非編碼RNAs (non-coding RNAs)，能夠以序列特異性的方式，通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯和促使mRNA降解的方式調(diào)控基因的表達(dá)。人類基因組中估計(jì)有1000多種基因編碼miRNAs參與細(xì)胞內(nèi)的RNA干擾(RNAi) 而不編碼蛋白質(zhì)。 其中約半數(shù)以編碼基因的內(nèi)含子為模板產(chǎn)生，另一半來(lái)自長(zhǎng)非編碼RNA (lncRNA)，有些miRNA甚至來(lái)自失活的假基因。此外，生殖細(xì)胞內(nèi)有一類特殊的miRNA稱為piRNA (piwi-associated RNAs)。另一種在病毒感染時(shí)產(chǎn)生的siRNA (small interfering RNA), 兩者都能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)可移動(dòng)元素的表達(dá)。miRNAs的生物合成過(guò)程主要分為兩個(gè)步驟：首先在細(xì)胞核內(nèi)由編碼miRNA的基因?yàn)槟０遛D(zhuǎn)錄為初始轉(zhuǎn)錄本 (pri-miRNA), 其分子序列往往自我互補(bǔ)而自動(dòng)折疊成雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)。此分子在細(xì)胞核內(nèi)被Drosha (一種RNase III超家族成員的內(nèi)切酶) 切割成約70bp的前miRNA (pre-miRNA)后轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核，到達(dá)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。第二步，再由Dicer酶催化切割成22bp的雙鏈RNA。這些短小的雙鏈RNA參與組成復(fù)合物RISC (RNA-induced silencing complex)，該復(fù)合物中的Argonaute (Ago) 家族蛋白可以最終將之加工成單鏈的miRNA，并投遞到其靶mRNA的3-UTR上發(fā)揮作用。作為一種公認(rèn)的重要表遺傳機(jī)理，雖然它們并不影響DNA序列的改變，但對(duì)人類的健康生長(zhǎng)發(fā)育和疾病的發(fā)生卻有著非常深遠(yuǎn)的影響。據(jù)2007年8月發(fā)布的最新資料統(tǒng)計(jì)，目前在人類基因組中已被確認(rèn)的miRNA序列已有500多種，并預(yù)測(cè)至少還有相同數(shù)量的miRNA序列有待證實(shí)。人類細(xì)胞中約有三分之一mRNA種類都受miRNA的負(fù)調(diào)控。在進(jìn)化上miRNA比較保守，其分子莖部保守性更強(qiáng)，而環(huán)部可能存在突變。miRNA基因以單拷貝，多拷貝和集簇等形式排列在基因組中，絕大多數(shù)位于蛋白質(zhì)編碼的基因間隔區(qū)，獨(dú)立轉(zhuǎn)錄，但不翻譯成蛋白質(zhì)，其表達(dá)水平有較強(qiáng)的組織特異性和時(shí)相性。miRNA一般不改變其作用靶mRNA的穩(wěn)定性，而通過(guò)抑制mRNA的翻譯而使基因沉默。 由于一般miRNA針對(duì)mRNA分子3端的非翻譯區(qū)形成互補(bǔ)，并不能完全封閉其翻譯，所以在表遺傳的層面上miRNA本身只以一種潛在的，非直接的方式同時(shí)調(diào)控許多基因的表達(dá)。miRNA有兩種方式降解和下調(diào)mRNA。如果兩者高度互補(bǔ)，則miRNA通過(guò)去除帽和polyA的尾而切割和降解mRNA。不過(guò)大多數(shù)情況miRNA與其互補(bǔ)序列結(jié)合得并不完全，因此僅能抑制靶mRNA的翻譯。4.2，轉(zhuǎn)錄因子功能的調(diào)控 轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)至今已逾20年，做為基因轉(zhuǎn)錄的反式元件，早先對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的一般概念是它含有兩種結(jié)構(gòu)域: DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域使之與DNA相連，激活或抑制結(jié)構(gòu)域使之能調(diào)控轉(zhuǎn)錄。近年的研究對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的認(rèn)識(shí)又有顯著的深化和發(fā)展。例如，轉(zhuǎn)錄因子在缺乏DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域時(shí)也可通過(guò)蛋白質(zhì)之間的相互作用而與基因DNA上的啟動(dòng)子結(jié)合。又如轉(zhuǎn)錄因子可同時(shí)含有激活和抑制結(jié)構(gòu)域，而DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域本身就可起轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域的作用。另一個(gè)重要概念是轉(zhuǎn)錄因子一般并非單獨(dú)起作用，而是多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)相互作用，協(xié)同或組成復(fù)合物形式來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子的作用需要其他蛋白質(zhì)作為共活化或共抑制因子參與，而轉(zhuǎn)錄因子的功能本身也受一些小分子或其本身翻譯后的修飾所調(diào)控，這種調(diào)控可通過(guò)多渠道，并發(fā)生在多層面上。4.2.1, 轉(zhuǎn)錄活化和抑制結(jié)構(gòu)域 (domain) 的作用機(jī)理 RNA聚合酶II對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄需要在基因的啟動(dòng)子上組裝通用性轉(zhuǎn)錄因子(general transcription factors GTFs) 來(lái)構(gòu)成啟動(dòng)前復(fù)合物 (preinitiation complex, PIC). 對(duì)大多數(shù)基因啟動(dòng)子來(lái)說(shuō)，開(kāi)始由GTF-TFIID 與TATA盒結(jié)合。TFIID是一個(gè)多亞單位因子，由TATA結(jié)合蛋白（TBP）和TBP相關(guān)蛋白（TAFs）組成，再加入TFIIA, TFIIB，然后再結(jié)合上TFIIE, F, H 和RNA聚合酶II組成完整的PIC。不過(guò)，正常情況下似乎許多GTF還和其他因子與RNA聚合酶II共同組成一個(gè)全酶 (holoenzyme).雖然不同方法提取的全酶的組分高度變化，但各種方法的全酶提取物中總含有幾種GTFs，包括SRB (suppressors of RNA polymerase B)和MED (MEDiator) proteins.所以PIC的組裝可能僅需要有限的因子，這些因子被認(rèn)為對(duì)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄是最重要的。上述PIC足以在裸露的DNA模板上啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，但在活細(xì)胞內(nèi)DNA組裝成染色質(zhì)，使PIC不易接近DNA。所以染色質(zhì)結(jié)構(gòu)必須經(jīng)過(guò)重塑（見(jiàn)上述重塑機(jī)理）才使PIC得以與啟動(dòng)子結(jié)合。轉(zhuǎn)錄效率被嚴(yán)格控制，例如在細(xì)胞有絲分裂時(shí)轉(zhuǎn)錄過(guò)程即停頓。此時(shí)轉(zhuǎn)錄機(jī)器被直接修飾，故影響到所有的基因。還有些機(jī)制是全局性的，如Dr1是通用的轉(zhuǎn)錄抑制因子，它直接接觸TFIID，阻止TFIID 與TATA盒結(jié)合而使PIC不能組裝。更重要的是那些作用于特異基因啟動(dòng)子相關(guān)序列元件而以基因特異性方式影響轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子。特定基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程包括一系列分子事件。其中有多處環(huán)節(jié)可被調(diào)控。例如染色質(zhì)重塑，PIC在轉(zhuǎn)錄前的組裝，PIC的結(jié)合使DNA模板熔為單鏈并由RNA聚合酶II與啟動(dòng)子結(jié)合，此后伴隨著核小體的重塑，PIC中的多種因子脫離而變成為延長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄的新的PIC。其間，TFIID始終保持與TATA盒的結(jié)合。延長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄的復(fù)合物也是被調(diào)控的靶點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子可在上述所有環(huán)節(jié)上調(diào)控轉(zhuǎn)錄，某些可活化轉(zhuǎn)錄，某些抑制轉(zhuǎn)錄。不過(guò)近來(lái)發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在不同的細(xì)胞環(huán)境下既可激活，也可抑制轉(zhuǎn)錄。 轉(zhuǎn)錄活化因子的活化結(jié)構(gòu)域根據(jù)其氨基酸組成大致可分為幾類：一類如皰疹病毒VP16 蛋白和酵母GAL4蛋白中活化結(jié)構(gòu)域那樣的酸性轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域，另有谷氨酸富集（如SP1）和脯氨酸富集(如CTF1)的兩類轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域。其中某幾組疏水的氨基酸殘基在上述三類轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域中都對(duì)其活性功能起關(guān)鍵作用。轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域怎樣發(fā)揮功能是基因表達(dá)的中心問(wèn)題。轉(zhuǎn)錄活化因子的作用必須與染色質(zhì)重塑過(guò)程相配合。幾種染色質(zhì)重塑因子與轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域都相互作用。例如作為HATs的共活化因子p300/CBP與轉(zhuǎn)錄活化蛋白 CREB相互作用，也作用于 GTFs。轉(zhuǎn)錄活化因子將p300/CBP拉至基因啟動(dòng)子，同時(shí)也會(huì)拉住ATP依賴性染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑復(fù)合物，使組蛋白乙?；腿旧|(zhì)構(gòu)型失穩(wěn)以便在該區(qū)域形成PIC。有證據(jù)表明轉(zhuǎn)錄活化因子能促進(jìn)PIC的組裝。TFIID與TATA結(jié)合，作為PIC 組裝的第一步可能是轉(zhuǎn)錄活化因子作用的靶點(diǎn)，不過(guò)對(duì)此尚有爭(zhēng)議。位于同一個(gè)啟動(dòng)子的多個(gè)轉(zhuǎn)錄活化因子總是協(xié)同激活轉(zhuǎn)錄，從而獲得大大超過(guò)預(yù)期的轉(zhuǎn)錄水平。這可能因?yàn)椴煌D(zhuǎn)錄因子活化結(jié)構(gòu)域可與PIC中各個(gè)成分接觸并相互作用，因而在PIC組裝的不同步驟都影響和促進(jìn)了PIC的組裝。也有人認(rèn)為TFIID中的TAFs與轉(zhuǎn)錄活化因子的協(xié)同作用有關(guān)。 大致有三種機(jī)制可使特異性的基因轉(zhuǎn)錄被抑制：轉(zhuǎn)錄抑制因子可以阻止轉(zhuǎn)錄活化因子與啟動(dòng)子相結(jié)合或著可以抑制結(jié)合于DNA上的轉(zhuǎn)錄活化因子蛋白的功能。第三種所謂“真正的抑制因子”是指含有的轉(zhuǎn)錄因子抑制結(jié)構(gòu)域能阻止轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成。例如Rb既能抑制與DNA結(jié)合的 E2F的活化結(jié)構(gòu)域，又具有轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域與 HDACs接觸，破壞PIC的組裝。一般認(rèn)為轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域含有疏水的堿性氨基酸，如富集丙氨酸。實(shí)際上也有抑制結(jié)構(gòu)域富集脯氨酸的，如在Oct2 和WT-1抑癌蛋白分子中。Eve是一種在果蠅和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄抑制因子。其功能不但需要丙氨酸富集區(qū)，也需要其自身結(jié)構(gòu)域。體外實(shí)驗(yàn)表明Eve阻止TFIID與TATA結(jié)合而影響PIC 的組裝。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中另一轉(zhuǎn)錄抑制因子Msx-1也需通過(guò)其自身結(jié)構(gòu)域與TBP的相互作用來(lái)抑制轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用一般不互相協(xié)同。這可能因?yàn)檗D(zhuǎn)錄活化因子在PIC組裝的不同步驟都影響和促進(jìn)了PIC的組裝而轉(zhuǎn)錄抑制因子只需破壞其中一個(gè)步驟即可?；罨D(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控子復(fù)合物 (negative regulator of activated transcription，NAT) 也包含一組SRBs 和MEDs，其轉(zhuǎn)錄抑制功能在于SRB10/11異二聚體，它能在PIC組裝前磷酸化RNA聚合酶Pol II中的CTD，使Pol II失去功能而抑制轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄抑制因子的主要功能是使啟動(dòng)子相關(guān)的染色質(zhì)恢復(fù)受抑構(gòu)型。它的抑制結(jié)構(gòu)域作用于幾種含HDAC活性的復(fù)合物而發(fā)揮作用。如NcoR (nuclear receptor corepressor) 和SMRT (silencing mediator for retinoic acid receptor and thyroid hormone receptor) 。這些復(fù)合物含有HDAC1/2 和Sin3共抑制因子。NuRD (neucleosome remodelling and histone deacetylase)復(fù)合物含有ATP依賴的核小體重塑活性SWI/SNF和HDAC1/2，也是抑制結(jié)構(gòu)域的作用靶點(diǎn)。此復(fù)合物中還含有的MBD3蛋白具有與甲基化CpG結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，而與甲基化DNA特異性結(jié)合的蛋白MeCP2也與HDAC復(fù)合物相連，進(jìn)一步將DNA甲基化與HDAC活性在抑制轉(zhuǎn)錄方面的作用聯(lián)系起來(lái)。 幾種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在不同的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境下既可激活轉(zhuǎn)錄也可抑制轉(zhuǎn)錄。例如果蠅細(xì)胞內(nèi)的kruppel蛋白濃度增加時(shí)可從活化轉(zhuǎn)錄變成抑制轉(zhuǎn)錄。這與其從單體形式二聚化有關(guān)。WT1也是這樣。不僅與DNA直接結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，某些共調(diào)控因子也有此特性。如Mdm2對(duì)P53是共抑制因子，對(duì)E2F卻是共激活因子。還有一些核激素受體在與配體結(jié)合后也會(huì)由抑制轉(zhuǎn)錄變成激活轉(zhuǎn)錄。它們未結(jié)合配體時(shí)與含有HDAC活性的NcoR/SMRT/SIN3共抑制復(fù)合物接觸. 當(dāng)與激素配體結(jié)合后，它們脫離NcoR/SMRT/Sin3共抑制復(fù)合物，轉(zhuǎn)而與含組蛋白乙?；富钚缘膒300/CBP或p/CAF復(fù)合物結(jié)合，從而激活轉(zhuǎn)錄。4.2.2, 磷酸化對(duì)轉(zhuǎn)錄因子功能的調(diào)控細(xì)胞外環(huán)境對(duì)細(xì)胞的刺激通過(guò)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)遞通路將信號(hào)送達(dá)細(xì)胞核內(nèi)的DNA，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，使細(xì)胞從而做出相應(yīng)的反應(yīng)。這一調(diào)控主要是通過(guò)信號(hào)傳遞通路中一系列介質(zhì)的磷酸化，最后作用于轉(zhuǎn)錄因子，使其轉(zhuǎn)錄活性發(fā)生快速的改變而實(shí)現(xiàn)的。因此，轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子和染色質(zhì)重塑因子如何受蛋白質(zhì)磷酸化激酶作用而磷酸化，或受蛋白質(zhì)磷酸酶作用而去磷酸化是這一調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。這也為某些疾病中的治療性干預(yù)提供了可能的靶點(diǎn)。蛋白質(zhì)的磷酸化或去磷酸化可以通過(guò)以下至少5種機(jī)理來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的功能：影響轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用的持續(xù)時(shí)間；影響轉(zhuǎn)錄因子受蛋白水解酶降解的難易程度；影響轉(zhuǎn)錄因子，共調(diào)節(jié)因子和基本轉(zhuǎn)錄復(fù)合物之間的相互作用；影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合；以及修飾染色質(zhì)的空間構(gòu)型。具體來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化/去磷酸化首先能決定轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞內(nèi)的位置。雖然許多轉(zhuǎn)錄因子原本就在細(xì)胞核內(nèi)被磷酸化/去磷酸化，但有相當(dāng)多的轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間穿梭往來(lái)。它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的位置取決于其蛋白分子上核定位信號(hào)（nuclear localization signal, NLSs）和核輸出信號(hào)（nuclear export signal, NESs）是否能被核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的蛋白所識(shí)別。轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化/去磷酸化會(huì)影響NLSs和NESs被核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制蛋白的識(shí)別。例如在被激活的T淋巴細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子（NF-AT）的核漿穿梭就是受磷酸化/去磷酸化調(diào)控的。NF-AT被細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣依賴性蛋白磷酸酶（Calcineurin）作用，在絲氨酸去磷酸化后，使NF-AT被輸入細(xì)胞核內(nèi)。反之NF-AT可被某些蛋白磷酸化激酶（如MAPK）磷酸化后運(yùn)出細(xì)胞核。磷酸化也可調(diào)控決定轉(zhuǎn)錄因子定位的調(diào)節(jié)蛋白的功能。如轉(zhuǎn)錄因子NF-k B異二聚體通常與其胞質(zhì)錨定蛋白抑制分子lk B相結(jié)合，其NLS被遮蓋從而防止被轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞對(duì)感染信號(hào)起反應(yīng)時(shí)，lk B的NH2端兩處絲氨酸被lk B激酶（IKK）復(fù)合物磷酸化，從而易被泛素化（ubiquitination）而快速降解。這時(shí)NF-k B分子上的NLS暴露出來(lái)并被識(shí)別，NF-k B異二聚體就能進(jìn)入細(xì)胞核去發(fā)揮功能了。蛋白質(zhì)的磷酸化/去磷酸化不但能調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活因子，也能調(diào)控轉(zhuǎn)錄抑制因子在細(xì)胞內(nèi)的定位。其次，磷酸化可使轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生蛋白酶介導(dǎo)的降解。這種降解最典型的是由泛素(ubiquitin）通過(guò)一組酶（如E1, E2和 E3）與靶蛋白相連而實(shí)行的。泛素化的蛋白質(zhì)接著被26S蛋白酶復(fù)合物降解。上述lk B/NF-k B是最為人了解的以磷酸化/去磷酸化所致的蛋白溶酶調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子。抑癌基因P53是另一個(gè)例子，作為轉(zhuǎn)錄因子，其磷酸化狀態(tài)影響它被降解的命運(yùn)。癌蛋白Mdm2與P53蛋白的NH2端相結(jié)合而抑制其轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)還起著E3泛素連接酶的作用，使P53被泛素介導(dǎo)的溶蛋白酶降解。當(dāng)P53反轉(zhuǎn)錄區(qū)段的絲氨酸被磷酸化時(shí)，Mdm2與P53蛋白連接的親和力減低，使P53蛋白的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性增加。另一方面非活化的MAP蛋白激酶 JNK也與P53蛋白NH2端相結(jié)合介導(dǎo)泛素的蛋白溶酶降解作用。JNK的激活可使P53蛋白NH2端磷酸化,阻滯其與Mdm2的結(jié)合而使P53蛋白更穩(wěn)定。轉(zhuǎn)錄因子與共調(diào)節(jié)因子和基本轉(zhuǎn)錄復(fù)合物之間存在著相互作用，許多轉(zhuǎn)錄因子分子中存在磷酸化依賴性轉(zhuǎn)錄活化或轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)域。這些區(qū)域的磷酸化可能直接阻擋轉(zhuǎn)錄因子與其他分子的聯(lián)系或改變轉(zhuǎn)錄因子局部的空間構(gòu)型，從而影響轉(zhuǎn)錄因子與共調(diào)節(jié)因子和基本轉(zhuǎn)錄復(fù)合物之間的親和力。蛋白質(zhì)磷酸化還可直接調(diào)控共調(diào)節(jié)因子本身的活性。例如細(xì)胞受刺激時(shí)CREBP (cAMP-response element binding protein)在133位絲氨酸可被許多蛋白質(zhì)激酶所磷酸化（如PKA, CaMKII及 MAPK等）。Ser-133的磷酸化使之能與CBP (CREB-binding Protein)和基本轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相連，從而增加了轉(zhuǎn)錄活性。而CBP作為一種共活化因子，其本身也需要被PKA, CaMKIV及 MAPK磷酸化才具有轉(zhuǎn)錄活性?；巨D(zhuǎn)錄復(fù)合物 (basal transcriptional complex) 中的許多成分，如TFIID, TFIIF 和TFIIH都具有磷酸化激酶活性，它們?cè)谡{(diào)控基本轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄活性方面的功能尚不清楚。蛋白質(zhì)磷酸化還能直接或間接地調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子與DNA上啟動(dòng)子的結(jié)合。許多轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)段呈堿性，而在此區(qū)段的磷酸化會(huì)引進(jìn)負(fù)電荷而使之不能有效地與DNA結(jié)合。例如WT-1，作為一種含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄抑制因子，被PKA磷酸化其鋅指區(qū)內(nèi)的絲氨酸可抑制其