紙層析法測定葉綠素.doc

紙層析法測定葉綠素摘要：紙層析是用濾紙作為載體的一種色層分析法，其原理主要是利用混合物中各組分在；流動(dòng)相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分離。濾紙上吸附的水為固定相（濾紙纖維常能吸20%左右的水），有機(jī)溶劑如乙醇等為流動(dòng)相，色素提取液為層析試樣。把試樣點(diǎn)在濾紙的濾液細(xì)線位置上，當(dāng)流動(dòng)相溶劑在濾紙的毛細(xì)管的作用下，連續(xù)不斷地沿著濾紙前進(jìn)通過濾液細(xì)線時(shí)，試樣中各組份便隨著流動(dòng)相溶劑向前移動(dòng)，并在流動(dòng)相和固定相溶劑之間連續(xù)一次有一次的分配。結(jié)果分配比比較大的物質(zhì)移動(dòng)速度較快，移動(dòng)距離較遠(yuǎn)；分配比較小的物質(zhì)移動(dòng)較慢，移動(dòng)距離較近，試樣中各組分分別聚集在濾紙的不同的位置上，從而達(dá)到分離。關(guān)鍵詞：紙層析，葉綠素，分離，速度前言：初步掌握提取和分離葉綠體中色素的方法。葉綠體中有幾種色素。胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a、葉綠素b隨層析液在濾紙上擴(kuò)散速度不同，可以分出四條色素帶。材料和方法：（1） 材料：用具：剪刀一把、干燥的定性濾紙、50ml的燒杯及100ml的燒杯各3個(gè)、白紙3張、試管架一個(gè)、研缽一個(gè)、玻璃漏斗一個(gè)、尼龍布或紗布、毛細(xì)血管一只、藥勺一個(gè)、10ml量筒一只，天平一只，試管3支、紙板一塊、棉塞3個(gè)、培養(yǎng)皿3個(gè)、刻度尺、注射器一只、蓋玻片 試劑：丙酮、無水乙醇、層吸液（20份石油醚、2份丙酮、1份苯配置而成）、二氧化硅、碳酸鈣、碳酸鈉 材料：新鮮的菠菜葉、青菜葉（2） 方法和步驟： 1提取綠色葉片中的色素 （1）取幾片綠色的葉片，去掉葉柄和主脈，用天平稱取 5g 葉片，剪碎，放 入研缽中。 （2）向研缽中放入少許二氧化硅和碳酸鈣，進(jìn)行充分的研磨。用量筒量取 5 ml 丙酮，倒入研缽中，迅速充分研磨。 （3） 將研磨液迅速倒入小玻璃漏斗中進(jìn)行過濾。 將濾液收集到一個(gè)小試管中， 及時(shí)用棉塞將試管目塞緊。 2制備濾紙條 取一塊預(yù)先干燥處理過的定性濾紙，將濾紙剪成長 10 cm、寬 1cm 的濾紙 條，在距濾紙條一端 1cm 處用鉛筆畫一條細(xì)的橫線。 3畫濾液細(xì)線、 用毛細(xì)吸管吸取少量濾液，沿鉛筆線均勻地畫出一條細(xì)而直的濾液細(xì)線。待 濾液于后，再畫 23 次。 4分離葉綠體中的色素 將 3 mL 層析液倒入燒杯中，將濾紙條（有濾液細(xì)線的一端朝下）略微料靠著 燒杯的內(nèi)壁，輕輕地插入到層析液中，隨后用培養(yǎng)皿蓋蓋上燒杯；（注意，不能讓濾紙上的濾液細(xì)線觸到層析液。紙層析法中所用的有機(jī)溶劑如丙酮等，一般有揮發(fā)性、并有一定毒性，使用時(shí)要注意密封層析，避免吸入過多有害揮發(fā)物。）結(jié)果： 經(jīng)過1015分鐘后，觀察分離后色素帶的分布。最上端橙黃色為胡蘿卜素，其次黃色為葉黃素，再下面藍(lán)綠色為葉綠素a，最后的黃綠色為葉綠素b。討論與分析：分析：紙層析法依據(jù)極性相似相容原理，是以濾紙纖維的結(jié)合水為固定相，而以有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相。由于樣品中各物質(zhì)分配系數(shù)不同，因而擴(kuò)散速度不同，從而達(dá)到分離的目的。一般用于葉綠體中色素的分離，葉綠體中色素主要包括胡蘿卜素、葉黃素、 1葉綠素a、葉綠素b，它們?cè)趯游鲆褐械娜芙舛炔煌芙舛却蟮碾S層析液在濾 紙上擴(kuò)散地快，反之則慢；含量較多者色素帶也較寬。最后在濾紙上留下4條色素帶，所以利用紙層析法 能清楚地將葉綠體中的色素分離。討論：1、 葉綠素等是脂溶性的有機(jī)分子，根據(jù)相似相溶的原理，葉綠素等色素分子溶于有機(jī)溶劑而不溶于有極性的水。故在研磨和收集葉綠色素時(shí)要用丙酮或乙醇等有機(jī)溶劑而不用水。 2、 葉綠素分布于基粒的片層薄膜上，加入少許二氧化硅是為了磨碎細(xì)胞壁、質(zhì)膜、葉綠體被膜和光合片成，使色素溶解于丙酮中。 3. 破碎的細(xì)胞中含有草酸等有機(jī)酸，葉綠素分子中含有的Mg元素處于不穩(wěn)定化合態(tài)，鎂離子與有機(jī)酸結(jié)合將導(dǎo)致色素分子破壞。加入少許碳酸鈣使得鈣離子與有機(jī)酸結(jié)合，減少鎂離子的轉(zhuǎn)移，防止研磨時(shí)葉綠體色素的破壞。所以在研磨時(shí)加入適量的碳酸鈣，同時(shí)加入碳酸鈉的道理亦如此。 4、 在過濾時(shí)選用脫脂棉或紗布，而不用濾紙。原因主要有下：（1）色素分子比較大，不容易透過濾紙； （2）濾紙有較強(qiáng)的吸附性而使色素吸附在濾紙上，從而降低色素濃度，影響實(shí)驗(yàn)效果；（3）葉綠素是脂溶性，根據(jù)相似相容的原理，脫脂棉可以減少實(shí)驗(yàn)過程中色素的流失，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)效果。 5、 根據(jù)物理學(xué)中的毛細(xì)現(xiàn)象，畫濾紙細(xì)線前濾紙必須經(jīng)過干燥處理，是為了阻止水分子堵塞濾紙中的毛細(xì)管而影響層析液的擴(kuò)散。但如果用火烤的話，會(huì)使濾紙纖維變形同時(shí)破壞啦毛細(xì)管，而影響層析液的擴(kuò)散。 6、 由于液面的不同位置表面張力不同，紙條接近液面時(shí)，其邊緣的表面的張力較大，層析液沿濾紙邊緣擴(kuò)散過快，而導(dǎo)致色素帶分離不整齊的現(xiàn)象。故而，在插入層析液的濾紙條一端剪去兩個(gè)角。 7、 為了防止濾紙條倒入層析液中而使層析實(shí)驗(yàn)失敗。同時(shí)，防止因液體表面張力引起層析液沿濾紙條向上的“壁流”而導(dǎo)致色素溶解。 8、 色素分離的原理：紙層析是用濾紙作為載體的一種色層分析法，其原理主要是利用混合物中各組分在；流動(dòng)相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分離。濾紙上吸附的水為固定相（濾紙纖維常能吸20%左右的水），有機(jī)溶劑如乙醇等為流動(dòng)相，色素提取液為層析試樣。把試樣點(diǎn)在濾紙的濾液細(xì)線位置上，當(dāng)流動(dòng)相溶劑在濾紙的毛細(xì)管的作用下，連續(xù)不斷地沿著濾紙前進(jìn)通過濾液細(xì)線時(shí)，試樣中各組份便隨著流動(dòng)相溶劑向前移動(dòng)，并在流動(dòng)相和固定相溶劑之間連續(xù)一次有一次的分配。結(jié)果分配比比較大的物質(zhì)移動(dòng)速度較快，移動(dòng)距離較遠(yuǎn)；