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CHIP PROTOCOL（基于millipore EZ-CHIP catalog#17-371）：實(shí)驗(yàn)原理：在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。 實(shí)驗(yàn)步驟：第一天：【實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備】： 1000ul、100ul、200ul、20ul移液器，大、中、小號(hào)tip，1.5ml EP管，200ul PCR管?！緦?shí)驗(yàn)儀器準(zhǔn)備】： 臺(tái)式低溫離心機(jī)，超聲儀，電泳設(shè)備一套，旋轉(zhuǎn)混勻儀，層析柜?！緦?shí)驗(yàn)試劑準(zhǔn)備】：SDS lysis buffer復(fù)溫，使其充分溶解，避免沉淀；protease inhibitor cocktail室溫下充分解凍；PBS預(yù)冷（若使用試劑盒提供10xPBS，使用前還需用去離子水稀釋成1xPBS工作液）。（一）、細(xì)胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎*。1、收集細(xì)胞（1-2x107），加入37%甲醛，使得甲醛的終濃度為1%（0.7%）。2、室溫孵育10min（精確計(jì)時(shí)）。3、及時(shí)終止交聯(lián)：加10x甘氨酸終濃度為1x?；靹蚝螅谑覝叵路胖?min。4、沉淀細(xì)胞（700g 4 2-5min），用冰冷的PBS清洗細(xì)胞2次。5、棄上清（細(xì)胞沉淀可以暫時(shí)凍存于-80備用）。6. 準(zhǔn)備裂解液（1ml SDS lysis buffer+5ul protease inhibitor cocktail）；按照細(xì)胞量（1x107 hela細(xì)胞對(duì)應(yīng)1ml SDS lysis buffer）加入SDS Lysis Buffer，重懸細(xì)胞。分裝成300-400ul1管（裂解產(chǎn)物可以-80凍存?zhèn)溆茫?、超聲破碎（根據(jù)具體情況調(diào)整）：普通超聲儀： 3檔 沖擊15s 冰上放置45s 共5次Bioruptor超聲神器： 中檔 沖擊15s 停頓45s 14次（更均一更集中）8、瓊脂糖凝膠電泳鑒定：取1x105個(gè)細(xì)胞，加入CHIP dilution buffer至終體積50ul，進(jìn)行解交聯(lián)后電泳Option1a. 加入RNase A（10mg/ml）1ul，37孵育30分鐘。b. 加入蛋白酶K 1ul，62孵育2小時(shí)。c. 取上清跑膠（2%瓊脂糖凝膠 電壓130V 時(shí)間20min），smear條帶集中在200-1000bp即可，500左右為佳。 Option2a. 加入蛋白酶K 1ul，62孵育2小時(shí)。 b. 每50ul樣本加入0.25ml結(jié)合試劑A（5倍體積），充分混勻。 c. 將上述混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，吸附柱放在收集管內(nèi)。 d. 1000015000g離心30秒，去下清。 e向吸附柱內(nèi)加入洗滌液B 500ul，1000015000g離心30s，去下清。 f. 空離30s，1000015000g。 g. 將吸附柱轉(zhuǎn)移至新的EP管，向吸附柱中心滴加50ul洗脫液C，1000015000g離心30s，洗脫液即為純化回收的DNA。 h. 取上清跑膠（2%瓊脂糖凝膠 電壓130V 時(shí)間20min），smear條帶集中在200-1000bp即可，500左右為佳。9、離心去除不溶物質(zhì)（1000015000g 4 10min），收集上清，分裝至100ul 1管，-80可保存2個(gè)月?！緦?shí)驗(yàn)補(bǔ)充及注意事項(xiàng)】：1、不是所有CHIP都需甲醛固定。做甲醛固定的為X-ChIP，而不需要固定的為N-ChIP。native ChIP主要用于組蛋白修飾、核小體定位的研究,由于組蛋白與DNA之間的作用力較強(qiáng)，因此N-CHIP不需要采用甲醛固定，而是讓DNA結(jié)合蛋白與DNA之間保持一種自然狀態(tài)，采用微球菌核酸酶對(duì)染色質(zhì)進(jìn)行消化，比如： Histone H3 and Histone H4 都不需要交聯(lián)反應(yīng), 因?yàn)樗鼈儽旧韥碚f和DNA結(jié)合的非常緊密. 組蛋白H2A和H2B并不是緊密聯(lián)接,但是在native ChIP中依然可以不需要交聯(lián)反應(yīng).X-CHIP適用于結(jié)合力較弱的DNA-蛋白質(zhì)相互作用的研究。2、當(dāng)用甲醛處理時(shí)，相互靠近的蛋白與蛋白，蛋白與核酸（DNA或RNA）之間會(huì)產(chǎn)生共價(jià)鍵。例如細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)TF與Promoter相互結(jié)合（生物意義上的結(jié)合）時(shí)，它們必然靠的比較近，或者契合在一起，這個(gè)時(shí)候用甲醛處理，能使它們之間產(chǎn)生共價(jià)鍵。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)是完全可逆的，交聯(lián)的進(jìn)程可被加入的甘氨酸終止。3、交聯(lián)時(shí)間需要預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定。交聯(lián)時(shí)間如果過長(zhǎng)，細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結(jié)果，而且實(shí)驗(yàn)材料也容易在離心過程中丟失，另外基因組上結(jié)合了太多的蛋白，也會(huì)增加背景；交聯(lián)時(shí)間如果過短，則交聯(lián)不完全，產(chǎn)生假陰性。4、超聲波是使用機(jī)械力斷裂染色質(zhì)，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫，這都會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而影響ChIP的效率。所以在超聲波斷裂染色質(zhì)時(shí)，要在冰上進(jìn)行，且要設(shè)計(jì)時(shí)斷時(shí)續(xù)的超聲程序，保證低溫。使用普通超聲儀時(shí)超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側(cè)壁，以免產(chǎn)生泡沫。總超聲時(shí)間也不要太長(zhǎng)，以免蛋白降解。5、有研究建議解交聯(lián)后瓊脂糖凝膠電泳鑒定，具體步驟如下：取5ul超聲破碎后產(chǎn)物，加入5MNaCl（終濃度為0.2M NaCl），65處理2h解交聯(lián)，電泳檢測(cè)超聲效果。一般，理想的超聲破碎得到的片段大小是200bp1000bp（以3個(gè)核小體左右大小為宜，大約500bp左右）。普通超聲儀效果：Bioruptor超聲效果：（二）、預(yù)清潔及抗體孵育。10、準(zhǔn)備足夠Dilution buffer（900ul dilution buffer+4.5ul protease inhibitor cocktail）。11、每100ul的超聲破碎產(chǎn)物中（冰上解凍），加入900ulChIPDilutionBuffer。再各加入60ulProteinGAgarose/SalmonSpermDNA（預(yù)清潔），4旋轉(zhuǎn)混勻1h*。12、1h后，在4靜置2min沉淀，4 3000-5000g離心1min。13、取上清，每個(gè)樣本留取10ul做為input，4保存?zhèn)溆?。14、收集剩余約1ml上清至新EP管，加入IP抗體（具體加入抗體量具體調(diào)整）*。 陽(yáng)性對(duì)照：加入1ug anti-RNA polymerase抗體 陰性對(duì)照：加入1 ug目的抗體來源種屬的IgG 實(shí)驗(yàn)組：加入目的抗體（1-10ug，可根據(jù)抗體說明書決定用量，一般3ug左右）15、4旋轉(zhuǎn)混勻過夜（12-16h）?！緦?shí)驗(yàn)補(bǔ)充及注意事項(xiàng)】1、吸取瓊脂糖珠子的中號(hào)tip需減頭，避免機(jī)械力破壞珠子，且珠子需充分混勻。2、鮭魚精子DNA包被瓊脂糖珠子，因?yàn)轷q魚精子用于降低降低染色質(zhì)DNA與瓊脂糖珠子的非特異性結(jié)合。Proterin A/G可以與抗體Fc段結(jié)合。蛋白質(zhì)A結(jié)合到IgG的Fc部分。蛋白質(zhì)G選擇性結(jié)合到IgG的Fc部分，但也能結(jié)合到Fab區(qū)域，因此可用于純化IgG1的Fab片段。 3、input是用來檢查PCR系統(tǒng)是否work。4、抗原抗體之間的結(jié)合是通過抗體特異性的識(shí)別抗原表位并結(jié)合的，有的抗體識(shí)別的抗原表位比較小，不容易暴露，在ChIP實(shí)驗(yàn)中容易被DNA包裹，從而使抗體無法結(jié)合，因此用來做ChIP的抗體一般是需要經(jīng)過chip實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的，必須是IP級(jí)別的抗體。5、單抗與多抗的選擇：?jiǎn)慰固禺愋詮?qiáng)，背景低。但是單抗有一個(gè)致命的弱點(diǎn)，就是識(shí)別位點(diǎn)單一，而在ChIP甲醛交聯(lián)的過程中，很有可能該位點(diǎn)被其它蛋白或核酸結(jié)合而被封閉，導(dǎo)致單抗不能識(shí)別靶蛋白。多抗雖然沒有這個(gè)問題，但是多抗特異性較差，背景可能會(huì)偏高。一般而言，如果沒有十足把握（單抗的識(shí)別位點(diǎn)遠(yuǎn)離靶蛋白與核酸結(jié)合的區(qū)域），選擇多抗比較穩(wěn)妥一些。第二天：【實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備】： 1000ul、200ul、20ul移液器，大、中、小號(hào)tip，1.5ml EP管。【實(shí)驗(yàn)儀器準(zhǔn)備】： 臺(tái)式低溫離心機(jī)，旋轉(zhuǎn)混勻儀，層析柜，水浴鍋（調(diào)節(jié)水浴鍋溫度到65備用）?！緦?shí)驗(yàn)試劑準(zhǔn)備】：室溫充分溶解1M NaHCO3。（一）、免疫復(fù)合物的沉淀及清洗。16、孵育過夜后，每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4旋轉(zhuǎn)孵育1h。17、4靜置10min后，4 30005000g離心1min。除去上清。18、依次用下列溶液清洗沉淀復(fù)合物。清洗的步驟：加入1ml洗滌液，在4旋轉(zhuǎn)孵育3-5min，4靜置2min沉淀，3000-5000g離心1min，除去上清。洗滌溶液*：a.low salt wash buffer-1次b.highsalt wash buffer-1次c.LiCl wash buffer-1次d.TE buffer-2次19、洗脫：洗脫液的配方：10ul20%SDS，20ul1MNaHCO3，170ulddH2O，共200ul。Input管加入200ul洗脫buffer，室溫下備用；IP管加入100ul洗脫液，輕柔彈勻，室溫孵育15min，離心（4 3000-5000g 1min）后，收集上清至新EP管。重復(fù)洗滌一次。最終的洗脫液為每管200ul。20、解交聯(lián)*：每管中加入8ul 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2M）?；靹颍?5解交聯(lián)，時(shí)間4-5h或者過夜。（解交聯(lián)后樣本可凍存在-20備用）【實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充及注意事項(xiàng)】： 1、頭四次洗滌不要求完全棄上清，避免反復(fù)及不必要的樣本丟失，最后一次要求盡量去除干凈上清。 2、雖然說明書上說4小時(shí)已經(jīng)足夠，但是建議解交聯(lián)過夜。因?yàn)樵谀菢迎h(huán)境里，DNA不會(huì)降解，過夜解交聯(lián)更充分些。注意在EP管口封上封口膜（避免樣本蒸干）。 第三天：【實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備】： 1000ul、100ul、200ul、20ul移液器，大、中、小號(hào)tip，1.5ml EP管?！緦?shí)驗(yàn)儀器準(zhǔn)備】： 臺(tái)式低溫離心機(jī)，水浴鍋（調(diào)節(jié)水浴鍋溫度到37備用）?！緦?shí)驗(yàn)試劑準(zhǔn)備】：充分解凍RNaseA、蛋白酶K，準(zhǔn)備足量0.5MEDTA及1MTris.HC，CHIP配套DNA回收試劑、收集管、吸附柱，或者Promega回收試劑盒A9281，95%乙醇，漂浮板。（一）、DNA樣品的純化回收21、解交聯(lián)結(jié)束后，每管加入1ul RNaseA，37孵育30min。22、每管加入4ul 0.5MEDTA，8ul1MTris.HCl，1ul蛋白酶K（可預(yù)先配成mix）。水浴鍋45處理1-2h。23、DNA片段的回收Millipore：a. 每管加入1ml 結(jié)合試劑A（5:1體積），混勻，終體積1200ul。 b. 將樣本與結(jié)合試劑混合液分兩次轉(zhuǎn)移至吸附柱（吸附柱放置在收集管內(nèi)），每次600ul，離心（10000-15000g 30s）棄下清。 c. 500ul 洗滌試劑B洗滌吸附柱，離心（10000-15000g 30s）棄下清。 d. 空離（10000-15000g 30s）后，將吸附柱轉(zhuǎn)移至新收集管。 e. 向吸附柱中央吸附膜上滴加50ul洗脫試劑C，離心（10000-15000 30s），棄吸附柱，收集管內(nèi)洗脫液即為純化回收的DNA樣本，可以凍存在-20供后續(xù)分析。promega膠回收試劑盒：a. 第一次打開試劑盒時(shí)，MWS中加入95%乙醇，加入體積請(qǐng)參照瓶上的標(biāo)簽。b. 加等倍體積的MBD至膠中（膠體350mg，點(diǎn)離；c. 55-65C水浴10分鐘，水浴過程中每隔2-3分鐘振蕩EP管一次，以幫助凝膠溶解；d. 將SV微型柱置于2ml的收集管中，待上一步的所有液體冷卻至室溫后，將其加入離心柱中，室溫孵育1min，13,000rpm離心1分鐘；e. 棄掉廢液，將離心柱放回收集管中；f. 向離心柱中加入700ul的MWS，13,000rpm離心1分鐘，倒掉廢液，將離心柱放回收集管中；g. 向離心柱中加入500ul的MWS，13,000rpm離心5分鐘； h. 倒掉廢液，將離心柱放回收集管中， 13,000rpm再離心2分鐘；i. 將離心柱放入干凈的1.5mlEP管中，室溫干燥2分鐘，再向離心柱的膜中央懸空滴加50ul的無酶水，室溫孵育1分鐘后，13,000rpm離心1分鐘，所得液體即為純化的PCR產(chǎn)物。j. 將上述所得液體重新懸空滴加至離心柱膜中央，室溫孵育1分鐘后13,000rpm離心1分鐘。k. 純化后的PCR產(chǎn)物于-20C保存?！緦?shí)驗(yàn)補(bǔ)充及注意事項(xiàng)】;1、樣品中SDS樣品較高，普通的PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，很有可能會(huì)在最終的樣品中混入SDS，影響PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。小Tip：過柱前，在樣品中加入一定量的異丙醇，能有效的消除SDS沉淀（網(wǎng)絡(luò)意見尚未驗(yàn)證）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析【CHIP-qPCR】：假設(shè)對(duì)照組S1，實(shí)驗(yàn)組S2計(jì)算如下：Input Dilution Factor=100（fraction of the input chromatin saved) -1 (-1次方)）% InputNormalized (S1)：1） Ct normalized ChIP (S1)= (Ct ChIP - (Ct Input -Log2 (Input Dilution Factor) Ct normalized ChIP (IgG/NIS)= (Ct ChIP - (Ct Input -Log2 (Input Dilution Factor)2）% InputAntibody = Log2 (-Ct normalized ChIP) % InputIgG/NIS = Log2 (-Ct normalized ChIP)3）%InputNormalized (S1)= % InputAntibody - % InputIgG/NIS% InputNormalized (S2)計(jì)算：1)Ct normalized ChIP (S2)= (Ct ChIP - (Ct Input -Log2 (Input Diluti