衛(wèi)生微生物檢測方法.ppt

1 本章主要內(nèi)容 第一節(jié)衛(wèi)生微生物檢測的特點及基本原則第二節(jié)衛(wèi)生指示微生物第三節(jié)衛(wèi)生微生物研究和檢測的方法第四節(jié)衛(wèi)生微生物研究和檢測方法發(fā)展前景 2 第一節(jié)衛(wèi)生微生物學檢測的特點與基本原則 檢測特點 檢測對象 致病 非致病 條件致病微生物標本來源 人體 環(huán)境環(huán)境中致病微生物數(shù)量少 需要特異的檢測方法 并且多依靠衛(wèi)生指示微生物檢測原則 樣品的采集原則樣品的運送原則實驗室檢驗原則 3 一 樣品的采集原則 一 樣品必須要有代表性 采樣量 滿足檢測要求采樣部位 均勻采樣采樣時間 便于分析微生物的動態(tài)變化采樣批號 盡量檢測每個批號 4 二 避免對樣品的污染器材滅菌 無菌操作 三 避免對樣品中微生物的殺滅和抑制避免有毒物質(zhì)的殘留和高溫影響 四 對樣品進行詳細的標記這是基本要求 1 所有盛樣容器必須有和樣品一致的標記 在標記上應(yīng)記明產(chǎn)品標志與號碼和樣品順序號以及其他需要說明的情況 標記應(yīng)牢固 具防水性 字跡不會被擦掉或脫色 2 當樣品需要托運或由非專職抽樣人員運送時 必須封識樣品容器 5 二 樣品的運送原則盡快送檢一般3 4h內(nèi)送檢 減少細菌死亡和進一步繁殖帶來的影響 如不能及時運送 應(yīng)根據(jù)樣品性質(zhì)采取常溫冷暗 0 4 冰箱 15 以下冰箱或冷藏庫內(nèi)保存 注意保護待檢的微生物一定的溫度加保護劑或去除不利因素運送培養(yǎng)基 運輸緩沖液 如病毒 厭氧菌等 6 根據(jù)生物安全規(guī)定 妥善包裝待運輸?shù)臉吮具M行完善的樣品交接必須有樣品送檢單 與實驗室人員逐項核對后交接 7 三 實驗室檢驗原則 1 具有相應(yīng)的實驗室硬件設(shè)施WHO對微生物危害性的分級生物安全等級 biosafetylevel BSL BSL 1 P1實驗室 檢驗非致病微生物 BSL 2 P2實驗室 檢驗一般致病微生物 BSL 3 P3實驗室 可檢驗特殊危險致病微生物 BSL 4 P4實驗室 可檢驗危害性最嚴重的病原體 世衛(wèi)組織感染性微生物的危險度等級分類 危險度等級一級無或極低的個體和群體危險不太可能引起人或動物致病的微生物危險度等級二級個體危險中等 群體危險低病原體能引起人或動物的疾病 但不太可能對實驗室工作人員 社區(qū) 牲畜或環(huán)境造成嚴重危害 實驗室暴露也許會引起嚴重感染 但是對感染有有效的預(yù)防和治療措施感染傳播的危險有限 世衛(wèi)組織感染性微生物的危險度等級分類 危險度等級三級個體危險高 群體危險低病原體通常能引起人或動物的嚴重疾病 但一般不會發(fā)生感染個體向其他個體的傳播對感染有有效的預(yù)防和治療措施危險度等級四級個體和群體的危險均高病原體通常能引起人或動物的嚴重疾病 并且很容易發(fā)生個體之間的直接或間接傳播一般沒有有效的預(yù)防和治療措施 BSL 1 不太可能引起人類疾病或獸醫(yī)學意義的無疾病安全措施 參照標準微生物學安全操作 標準預(yù)防措施 預(yù)期的安全設(shè)備 不需要 所以也不需要生物安全柜實驗室設(shè)備要求 需要開放實驗臺和水槽 BSL 2 對群體中出現(xiàn)的中等危險和人類疾病有關(guān)系的的微生物 危險性在于皮膚損傷 攝食 黏膜暴露 這一防護級別代表的微生物為 金黃色葡萄球菌 沙門菌 輪狀病毒 甲型流感病毒 麻疹病毒等 安全措施 參照一級生物安全實驗室操作 進入受限生物危害警告標志 銳器 防范措施清除污染生物安全手冊預(yù)期的安全設(shè)備 在操作產(chǎn)生噴濺或氣溶膠的感染微生物時 使用驗收過的物理防護設(shè)備 如I級或II級生物安全柜 BSL 2 PPE 個體防護裝備 根據(jù)需要穿戴實驗室大褂 手套和面部保護用具 實驗室設(shè)備要求 需要開放實驗臺 水槽和高壓滅菌器 BSL 2 高壓滅菌器 洗眼器 BSL 2 對本地或外來的呼吸傳播微生物 氣溶膠 以及可能引起嚴重的或潛在致命感染的微生物 這一防護級別代表的微生物為 結(jié)核桿菌 炭疽桿菌 霍亂弧菌 高致病性禽流感病毒 黃熱病病毒 艾滋病病毒等 重視環(huán)境和實驗室人員的保護屏障 BSL 3 安全措施 參照二級生物安全實驗室操作 進入控制全部廢棄物均清除污染實驗室服裝在洗熨前須清除污染免疫血清基線預(yù)期的安全設(shè)備 對于所有開放性微生物操作使用I級或II級生物安全柜 BSL 3 PPE 個體防護裝備 根據(jù)需要穿戴實驗室大褂 手套和呼吸器 實驗室設(shè)備要求 二級生物安全實驗室要求 實驗室與公共走廊通道在物理上分開門自動關(guān)閉 雙門入口排出廢氣不可再循環(huán)實驗室內(nèi)負壓 BSL 3 對于危險的或外來的微生物 它們是危及生命的很高個體危險 通過氣溶膠或未知傳播風險的微生物進行傳播 而且目前尚無疫苗或治療 這一防護級別代表的微生物為 天花病毒 埃博拉病毒 危險性在于呼吸暴露接觸到傳染性的氣溶膠 黏膜 或是暴露的損傷皮膚接觸到傳染唾沫 BSL 4 安全措施 參照三級生物安全實驗室操作 進入前更換衣服出口處淋浴離開實驗室時 全部物品都要清除污染預(yù)期的安全設(shè)備 全部操作程序均在III級生物安全柜內(nèi)進行 或者穿正壓供氣的的連體防護服 Hazmat套服 并I級和II級生物安全柜 BSL 4 實驗室設(shè)備要求 三級生物安全實驗室要求 獨立的建筑或明確劃分出的隔離區(qū)域?qū)Ｓ眠M排氣 真空和清除污染系統(tǒng)安全文件明確規(guī)定的其他附加要求重點防止活性微生物污染環(huán)境 BSL 4 微生物危險度等級與生物安全水平 操作和設(shè)備的關(guān)系 GMT 微生物學操作技術(shù)規(guī)范 微生物危險度等級與生物安全水平 操作和設(shè)備的關(guān)系 23 2 具有合格的人員和標準檢驗方法人員要有資質(zhì) 并經(jīng)常接受培訓采用國家標準方法或公認方法 WHO EPA等 3 加強實驗室質(zhì)量控制儀器 設(shè)備 試劑 定期檢定和校準注意記錄和核查 如GLP實驗室報告規(guī)范 數(shù)據(jù)規(guī)范 完整簽名蓋章 三 實驗室檢驗原則 4 實驗室應(yīng)有應(yīng)急措施應(yīng)對突發(fā)事件能力需做多種檢驗時 微生物優(yōu)先恰當?shù)臉悠诽幚砼c檢驗 24 三 實驗室檢驗原則 25 第二節(jié)衛(wèi)生檢驗中的指示微生物 指示微生物 indicatormicroorganism 定義 在常規(guī)衛(wèi)生監(jiān)測中 用以指示檢品衛(wèi)生狀況及安全性的 非致病 微生物 或細菌 設(shè)定指示微生物的原因微生物 包括致病和非致病的 種類繁多 不可能一一檢測環(huán)境中致病微生物往往數(shù)量少 檢測困難 需要用相對易于檢測的微生物來間接反映 26 一 指示微生物的選擇 選擇原則數(shù)量大 易于檢出 方法簡單 有代表性 指示微生物的種類 反映微生物綜合污染 細菌 霉菌和酵母菌落總數(shù)反映微生物污染來源 糞便污染指示菌 大腸菌群 糞大腸菌群等 空氣污染指示菌 溶血性鏈球菌等 不得檢出的致病微生物間接反映致病微生物 如反映腸道病毒的噬菌體等消毒效果指示菌 嗜熱脂肪芽孢桿菌 壓力蒸汽滅菌 短小芽孢桿菌 電離輻射滅菌 枯草桿菌黑色變種芽孢 環(huán)氧乙烷滅菌 27 二 常用的指示微生物 一 綜合污染指標 菌落總數(shù)定義 單位量的被檢樣品 g ml cm2 m3 內(nèi) 所含有的能在某種培養(yǎng)基上經(jīng)一定條件 一定時間培養(yǎng)后生成的菌落數(shù)量 表述 細菌菌落總數(shù) 霉菌和酵母菌菌落總數(shù) cfu g cfu ml cfu colonyformingunit 意義 綜合判定檢樣被微生物污染程度 方法 標準平板計數(shù)法 表面涂布法 28 二 來源污染指標 糞便 空氣污染指示菌 糞便污染指示菌的選擇標準是人及溫血動物腸道正常菌群的組成部分 且數(shù)量大 在糞便污染的樣品中易檢出 未被污染的樣品中無此菌存在 排出體外后 在外環(huán)境存活時間與腸道致病菌大致相似或稍長 在外環(huán)境中不繁殖 如作為飲用水的指示菌 對氯 臭氧等抵抗力應(yīng)不低于腸道致病菌或略強 檢驗方法簡便 易于檢出和計數(shù) 29 常見糞便污染指示菌 1 大腸菌群 coliformgroup 概念 指一群需氧的或兼性厭氧的 在35 37 24h培養(yǎng)能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的G 無芽孢桿菌 種類 大腸埃希菌屬 枸櫞酸桿菌屬 腸桿菌屬 克雷伯菌屬 沙雷菌屬 變形桿菌屬某些種等 衛(wèi)生學意義評價檢樣衛(wèi)生質(zhì)量 推斷有無腸道致病菌污染 總大腸菌群 totalcoliform 37 培養(yǎng)生長的大腸菌群 糞大腸菌群 fecalcoliform 耐熱大腸菌群 44 45 能發(fā)酵乳糖的大腸菌群 方法 發(fā)酵法 濾膜法 紙片法 30 大腸菌群作為指示菌的一些新問題 大腸菌群 受損 對細菌計數(shù)的影響大腸埃希菌的致病性大腸菌群中某些細菌可以在外界繁殖大腸菌群的檢測范圍有限 水中大腸菌群 200cfu 100ml小腸結(jié)腸炎耶爾森菌陽性率6 4 水中大腸菌群 200cfu 100ml小腸結(jié)腸炎耶爾森菌陽性率8 9 31 2大腸埃希菌 Escherichaecoli 檢出意義最大鑒定方法較復雜藥品行業(yè)使用較多近年應(yīng)用較多 作為糞便污染指示菌 大腸埃希菌檢出意義最大 其次是耐熱大腸菌群 總大腸菌群再次 32 3 腸球菌 Enterococcus 糞鏈球菌 人及動物腸道正常菌群 在人糞數(shù)量僅次于大腸菌群細菌 動物糞便中所占比例高 對惡劣環(huán)境抵抗力較強 營養(yǎng)水體繁殖力低于大腸菌群 單獨檢查不能作為糞便污染的決定性指標 但可提供有價值的補充材料 判斷污染來源 方法 耐熱大腸菌群與腸球菌之比 4 1污染來源人耐熱大腸菌群與腸球菌之比 0 7污染來源動物耐熱大腸菌群與腸球菌之比4 1 0 7混合來源 33 4產(chǎn)氣莢膜梭菌 Costirdia G 有芽孢 還原亞硫酸鹽的厭氧桿菌 外界環(huán)境抵抗力較強 不適合作為主要指標 但可提供有價值的補充材料 特別適合水樣不能及時送檢 或在含有有毒物質(zhì) 氯 的環(huán)境中檢測是否有過糞便污染 產(chǎn)氣莢膜梭菌 大腸菌群 新近污染產(chǎn)氣莢膜梭菌 大腸菌群 陳舊污染 34 常見空氣污染指示菌 口腔和鼻腔的鏈球菌 無人居住的房屋空氣中沒有鏈球菌 房屋內(nèi)住人越多 鏈球菌的含量亦越高 一般用草綠色鏈球菌與溶血性鏈球菌合起來計算 35 三 不得檢出的致病菌 36 四 間接反映致病微生物存在的指示菌 腸道病毒指示微生物的條件 檢驗方法簡單操作安全在被人腸道病毒污染的環(huán)境中一定存在 數(shù)量等于或大于腸道病毒的數(shù)目對于消毒劑和外環(huán)境的抵抗力應(yīng)與腸道病毒一致或稍強 37 腸道病毒的指示微生物 38 第三節(jié)衛(wèi)生微生物研究和檢測的方法 一 樣品的處理 二 損傷菌的復蘇 三 選擇性增菌與分離 四 定量計數(shù)方法 五 分型鑒定的方法 六 其他分子生物學方法 39 混勻樣品 非常重要 液體 電動混勻 手搖混勻 敲打混勻固體 攪碎混勻 研磨混勻 勻漿混勻樣品濃縮沉淀法過濾法吸附沉淀法 一 樣品的處理 40 環(huán)境樣品微生物 在采樣送檢等過程中 受各種不利因素作用 可發(fā)生亞致死性損傷 用普通培養(yǎng)方法不容易培養(yǎng) 需預(yù)先進行復蘇 resuscitation 或修復 repair 才能培養(yǎng) 無選擇壓力的培養(yǎng)環(huán)境較低的培養(yǎng)溫度 二 損傷菌的復蘇 41 檢測的困難 微生物小 少 混合 選擇方法 抑制其它微生物生長 促進目標微生物生長物理方法 厭氧條件培養(yǎng)厭氧菌 光照條件培養(yǎng)藻類等化學方法 根據(jù)微生物的營養(yǎng)需求 加入特制的促進或抑制生長的物質(zhì) 三 對目的菌的選擇性增菌與分離 42 四 微生物定量計數(shù)法 43 一 傾注平板法10倍