用于鋅離子檢測和成像的比例探針和近紅外分子探針.doc

用于鋅離子檢測和成像的比例探針和近紅外分子探針摘 要：由于Zn2+在生理功能中起著重要作用，生物樣品中Zn2+的檢測和成像引起了大家極大的興趣。但是只有分子探針與Zn2+特異結(jié)合后引起的發(fā)射光譜變化，這一研究才成為可能。與Zn2+結(jié)合后，能“開啟”發(fā)光或者熒光發(fā)射光譜移動的分子，是用于體內(nèi)成像的理想的分子。在這篇文章中，我們特別關(guān)注了比例探針和近紅外探針。因此，在化學(xué)傳感器或分子探針領(lǐng)域，設(shè)計能在近紅外區(qū)域比例感應(yīng)或成像的熒光分子，引起了化學(xué)家的關(guān)注。這篇重點綜述的目的是闡明這一領(lǐng)域的最新發(fā)展，并強調(diào)了為未來應(yīng)用而進行進一步研究的重要性。關(guān) 鍵 詞：化學(xué)傳感器，熒光探針，分子探針，比例傳感器，鋅1. 引言鋅是人體內(nèi)存在的第二大豐富的過渡金屬離子，它在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外功能中扮演多個角色。已查明大量的蛋白質(zhì)和酶含有Zn2+。據(jù)報道，Zn2+與許多神經(jīng)紊亂疾病有關(guān)，如帕金森病和癲癇病等。此外，鋅在胰島素分泌和凋亡的過程中起著關(guān)鍵的作用。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，非洲和亞洲超過40%的兒童成長過程中的發(fā)育不良與飲食中鋅的含量過低有關(guān)。鋅離子缺乏的狀況一直延續(xù)到今天并在很大范圍內(nèi)擴展，而且難以檢測是因為缺乏合理的鋅的生化標(biāo)記物。除了生長發(fā)育，包括免疫、內(nèi)分泌和胃腸道系統(tǒng)在內(nèi)的許多的身體機能都受到鋅離子的影響。為了廣泛的研究生物學(xué)中鋅的多樣化的生理功能，就需要靈敏的和無創(chuàng)的技術(shù)來實現(xiàn)實時探測和成像。生物細(xì)胞內(nèi)Zn2+的相對濃度在1nM到1mM范圍，在許多細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中只有1nM而在人類大腦中神經(jīng)元突觸囊泡內(nèi)則達(dá)到1mM。雖然細(xì)胞中鋅的總濃度較高，但不與蛋白質(zhì)強烈結(jié)合的游離鋅的濃度極低。因此很難用傳統(tǒng)的方法測定的游離鋅的濃度。這些問題使化學(xué)家優(yōu)先考慮開發(fā)選擇性和高效率的鋅離子探針，即所謂的鋅離子化學(xué)傳感器最的問題。由于鋅對于大部分的分析技術(shù)是不可見的，所以熒光技術(shù)是一個很好的選擇。這種方法利用能識別Zn2+的探針分子，探針分子與Zn2+結(jié)合后發(fā)出特定波長的光，于是就可以用熒光顯微鏡跟蹤活細(xì)胞內(nèi)的鋅離子。熒光分子探針由熒光團以及與其相連的螯合劑或是帶或不帶空間基團的離子載體組成。當(dāng)探針分子與分析物結(jié)合后會使熒光強度或波長發(fā)生變化，于是就產(chǎn)生了信號輸出（Figure 1）。熒光信號傳導(dǎo)機理通過熒光的變化過程發(fā)生的，如電荷轉(zhuǎn)移，電子轉(zhuǎn)移，能量轉(zhuǎn)移，激發(fā)物的形成，或構(gòu)象的變化。在這些機理中，光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）因為能顯著的影響熒光發(fā)射光譜而被廣泛用于化學(xué)傳感器的設(shè)計。2. PET：優(yōu)先選擇的信號傳導(dǎo)機理許多熒光傳感器是基于PET原理作為信號傳導(dǎo)的過程來設(shè)計的。由于電子轉(zhuǎn)移，熒光分子在初始狀態(tài)時不發(fā)熒光。金屬離子與受體結(jié)合后降低了供體向熒光團電子轉(zhuǎn)移的效率，由PET引起的熒光猝滅就較難發(fā)生甚至是完全中斷。因此，熒光團的原始熒光就會恢復(fù)。這個熒光信號是高度靈敏的，可選擇性的用于檢測特定分析物。按照這個原理設(shè)計的傳感器最有名的是CHEF（螯合作用增強型熒光）型傳感器。一種理想的Zn2+化學(xué)傳感器應(yīng)具有良好的化學(xué)和光穩(wěn)定性，熒光選擇性，快速感光性，對pH值不敏感，快速靶向性和良好的水溶性。對于生物應(yīng)用，激發(fā)波長應(yīng)在可見光區(qū)域?；跓晒鈭F的化學(xué)傳感器領(lǐng)域的最新進展大大促進了用于鋅離子檢測的各種熒光探針的發(fā)展。其中大部分探針是基于作為熒光團的喹啉（1），丹磺酰氯（2），蒽（3），和熒光素（4）的衍生物。其中，基于熒光素的探針由于其可見光吸收，水溶性好，對生物組織的滲透性好而被廣泛的研究。3. 二-（2-吡啶甲基）胺：鋅離子的最佳配體與Zn2+特異性結(jié)合離子團僅限于某些基團如喹啉，二-（2-吡啶甲基）胺（或二-2-氨甲基吡啶DPA），線性的和環(huán)狀的多胺，以及有些生物配合物如鋅指域等。在這些離子載體中，DPA是使用最廣泛的結(jié)合Zn2+的配體。DPA胺基的氮原子是PET過程中的一個良好的電子供體?；贒PA的傳感器5是一個典型的用于檢測質(zhì)子和Zn2+的PET傳感器。與金屬離子結(jié)合后，探針的電子轉(zhuǎn)移過程中斷，熒光量子產(chǎn)率增加。熒光素衍生物6和7有在可見光區(qū)域吸收的優(yōu)點，這有利于在這些頻率范圍內(nèi)的激發(fā)。只有熒光素的陰離子形式發(fā)出熒光強烈，這意味著pKa值是影響pH依賴型探針性能的一個很重要的因素。連有拉電子基團的熒光分子在廣泛的pH值范圍內(nèi)呈現(xiàn)更好的性能。6和7是基于DPA的傳感器，與鋅結(jié)合后熒光增強。近來，報道了幾種屬于ZnAF2（8）和Zinpyr-1（9和10）家族的用于Zn2+檢測的新的傳感器。ZnAF2型分子是基于PET的原理設(shè)計的，適合于生物應(yīng)用。雖然這些第二代探針與第一代基于紫外的探針相比，對Zn2+具有較高的親和力，且亮度更亮，但仍存在一些問題如易于合成，靈敏度，選擇性，與生物樣品的相容性，和穩(wěn)定性仍需要加以改善。最近的一些綜述討論了用于生物樣品中Zn2+檢測和成像的探針的優(yōu)缺點。在此，我們著重討論比例及近紅外（NIR）Zn2+探針設(shè)計和應(yīng)用的最新進展。4. 比例鋅離子探針目前研究的Zn2+特異性傳感器是基于比例傳導(dǎo)。當(dāng)結(jié)合的分析物改變了發(fā)色團的電子特性而導(dǎo)致光在不同的波長吸收或發(fā)射時會有比例的行為發(fā)生。因此，一個熒光比例傳感器對分析物的響應(yīng)是通過最大發(fā)射位移來實現(xiàn)的，可能會伴隨強度的變化，也可能不會。發(fā)射波長必須足夠大才能區(qū)分共存的結(jié)合Zn2+和未結(jié)合Zn2+的探針，從而來測量這兩個物種的最大發(fā)射波長的比例。結(jié)合已知的傳感器的結(jié)合常數(shù)，就可以測量未知鋅離子的濃度。比例信號是內(nèi)參比，結(jié)合與未結(jié)合的傳感器的信號比不受光源和光漂白的影響。Maruyama等利用分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）的原理，將作為電子供體的DPA和作為電子受體的苯并呋喃衍生物連接起來，設(shè)計了Zn2+比例探針。探針11（ZnAF-R1）和探針12（ZnAF- R2）與Zn2+絡(luò)合后，最大激發(fā)波長藍(lán)移，而發(fā)射波長保持不變。在水溶液中，傳感器12比11水溶性好，熒光量子產(chǎn)率高，正如圖巨噬細(xì)胞中Zn2+熒光比例成像所闡明的那樣，它更適合于生物應(yīng)用。由于12不能滲透細(xì)胞膜，更親脂的乙酯衍生物（ZnAFR2 EE）用來穿透細(xì)胞，在胞漿中酯酶的作用下水解成12（Figure 2）。Lim，BrMckner及其同事報道了一種用香豆素衍生物做的Zn2+比例傳感器13（Scheme 1）。香豆素的內(nèi)酯的氧原子是一個潛在的供電原子，參與螯合Zn2+，因此可使生色團的電子特性發(fā)生變化。雖然有各種金屬離子可以與它結(jié)合，但是它們競爭不過Zn2+，因此13是一個適合于生物體系的Zn2+探針（Figure 3）。Woodroofe和Lippard對Zn2+探針的發(fā)展做出了重大貢獻。他們把DPA的螯合基團與不同的的生色團連接，合成了一系列比例鋅離子探針。一個有趣的例子是探針含有兩個與coumazin-1（15）相連的新型熒光基團，其中一個是作為傳感前體的沒有熒光且對鋅離子不敏感的香豆素衍生物，以及一個與其相連的對鋅離子敏感的熒光素衍生物。這兩個熒光團通過酯鍵相連后，熒光消失。該非熒光化合物進入細(xì)胞后被酯酶水解(Scheme 2)，而分解成對Zn2+敏感的熒光素部分與香豆素部分，這兩部分就都有熒光了。Coumazin-1能夠滲透細(xì)胞，是一個潛在的能用于生物體內(nèi)Zn2+比例成像的熒光分子(Figure 4)。當(dāng)它進入細(xì)胞后，酯鍵會被酯酶分解，熒光團產(chǎn)生活性。兩個熒光團都有特征的激發(fā)和發(fā)射性質(zhì)，因此能用于比例法檢測。用445nm激發(fā)香豆素，測量488nm的發(fā)射光強度能提供酯鍵裂解的傳感器的信息。用505nm激發(fā)熒光素部分測量534nm的熒光發(fā)射強度則能給出胞內(nèi)存在的游離鋅離子的信息。沒有Zn2+時，兩個波長下熒光強度的比例I534/I488是0.5，Zn2+飽和后能夠達(dá)到4.0。Lippard和他的同事之后報道了基于Zn2+誘導(dǎo)產(chǎn)生的phenoxynaphthoquinone naphthoxyquinone互變異構(gòu)的鋅離子的比例傳感器平衡（Scheme 3）。Zn2+調(diào)節(jié) 18的結(jié)構(gòu)提高了傳感器的整體強度，將光譜峰值移至指示變化的phenoxynaphthoquinone異構(gòu)體的位置。由于18不能滲透細(xì)胞膜，它的一個沒有熒光的二乙酯的衍生物就被用來在哺乳動物的活細(xì)胞內(nèi)對鋅離子進行比例熒光成像。這種基于seminaphtho熒光素的探針是用單波長激發(fā)雙波長發(fā)射的比例法來測量由Zn2+引發(fā)的類似熒光素和苯并熒光素的互變異構(gòu)體。相對與生物體內(nèi)其他金屬離子，這個探針對Zn2+有很好的選擇性(Figure 5)。由于激發(fā)光與發(fā)射光都是長波可見光，探針對細(xì)胞和組織的傷害很小，并且能夠避免物種細(xì)胞內(nèi)本底熒光的干擾。最近Taki等人報道了一種基于苯并惡唑的熒光傳感器（Zinbo-5），它可以用于雙光子顯微鏡下，細(xì)胞內(nèi)Zn2+的熒光比例成像。Zinbo-5（19）是細(xì)胞滲透性的，與游離Zn2+結(jié)合后，熒光量子產(chǎn)率發(fā)生很大的變化。該分子與Zn2+結(jié)合后在407nm（=0.02）處的特征譜帶紅移至443nm（=0.10）(Figure 6)。除Zn2+，Cd2+外，所有其他的過渡金屬離子都會猝滅Zinbo-5的熒光。無論是高濃度還是低濃度的堿金屬或堿土金屬離子都不會影響Zinbo-5的熒光。這表明Zinbo-5在生物學(xué)及顯微學(xué)領(lǐng)域都可能有廣泛的應(yīng)用。Zinbo-5對Zn2+的親和力比DPA高的多，因此這就表明苯酚上的氧原子和和苯并惡唑上的氮原子可能是鰲合金屬離子的第三和第四配體。在老鼠的纖維原細(xì)胞中的成像證明19能夠用于哺乳動物細(xì)胞的雙光子激發(fā)熒光(TPE)顯微成像（Figure 7）。這種發(fā)射光比例成像顯示出Zinbo-5在可靠記錄細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度的變化方面的實用性。Squaraine染料是一種可以用來設(shè)計檢測與生物學(xué)相關(guān)的陽離子的分子探針的性能非常優(yōu)異的生色團。Dilek和Akkaya合成了squaraine染料20，它與Zn2+結(jié)合后在同一信號輸入下能產(chǎn)生三種狀態(tài)的熒光響應(yīng)信號(Figure 8)。Ojida等用一個連有DPA的氧雜蒽酮的衍生物21與Zn2+探針的絡(luò)合物在中性水溶液中用于磷酸根離子的比例傳感，這是一個少有的例子。在含甲醇的水溶液中，用Zn2+滴定這個配體，光譜會逐漸變化。加入等量的Zn2+后使328nm處的吸收下降，同時在376nm處有新的吸收(Figure 9)。加入兩倍的Zn2+后，397nm的吸收增強，335nm的吸收變?nèi)?，都?76nm為等吸點。這些變化是因為結(jié)合兩個鋅離子后導(dǎo)致氧雜蒽酮生色團電子性質(zhì)的變化。最初只結(jié)合鋅的探針22再與磷酸根結(jié)合后會引起激發(fā)波長成比例變化，這種變化是配位形式重排的造成的結(jié)果（Scheme 4）。最近，Mei和Bentley報道了一種鋅離子的比例熒光傳感器24，它是基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）的原理制成的。圖10表示了加入不同量的Zn2+后24的熒光光譜的變化。24的聯(lián)吡啶部位與Zn2+結(jié)合后使供電子能力減弱，導(dǎo)致發(fā)射光譜藍(lán)移。4.1 基于連吡咯的比例熒光探針成像端基為二乙烯基芳香體系是已知的用于合成光電高分子及低能帶間隙高分子的強熒光物質(zhì)。將聯(lián)吡啶基團引入這個體系就合成了分子25 a-c，它們是優(yōu)良的特異性檢測Zn2+的比例探針。盡管這些探針能與許多生物學(xué)中重要的金屬離子結(jié)合，但只有和Zn2+結(jié)合后熒光才會增強，因此能夠選擇性的測定Zn2+。同樣在不同過渡金屬離子中，只有Zn2+的絡(luò)合物才表現(xiàn)出熒光發(fā)射（Figure 11）。25c與Cu2+的絡(luò)合物不發(fā)熒光，加入Zn2+后，產(chǎn)生相當(dāng)于直接和Zn2+絡(luò)合的熒光發(fā)射，這表明25c探針優(yōu)先與Zn2+絡(luò)合。因此，在生理pH范圍內(nèi)，在有其他競爭性陽離子存在的情況下，所報道的熒光探針仍能用于Zn2+的比例傳感，并且發(fā)射波長紅移至可見光區(qū)域。探針與Zn2+結(jié)合前后熒光顏色的顯著差異是用于成像的一個優(yōu)勢。 5. 近紅外熒光探針吸收和發(fā)射在近紅外區(qū)域的分子，經(jīng)過適當(dāng)?shù)墓δ芑梢杂糜谔囟ǚ治鑫锏膫鞲泻统上?，尤其是在生物活體內(nèi)成像。近紅外發(fā)射的低背景噪音和低散射光譜提高了信噪比，從而有利于高靈敏度的檢測。近紅外發(fā)射分子探針由于低吸收和低散射而具有在活體內(nèi)成像和亞細(xì)胞檢測的優(yōu)勢。650-900nm的近紅外區(qū)非常理想，因為它對生物樣品有良好的穿透力同時可避免樣品背景熒光的干擾。已經(jīng)合成了幾種近紅外熒光探針并用于了生物成像。但用于檢測Zn2+近紅外探針仍然是罕見的。在不同的近紅外染料中，菁染料已被廣泛應(yīng)用于生物樣品的熒光成像。大多數(shù)近紅外染料存在的主要問題是光穩(wěn)定性低，熒光量子產(chǎn)率低。據(jù)報道，氨基取代的三碳菁染料26具有較大斯托克斯的位移和強的熒光強度，這對于在生理條件下一個特定的分析物的檢測具有一定的優(yōu)勢。最近，Nagano和他的同事合成了一系列碳菁類染料27，是能夠用于檢測Zn2+的比例近紅外探針。具體的例子如Scheme 5所示。連有dipicolylethylenediamine基團的生色團一般是作為金屬離子螯合劑。這個分子有很大的摩爾消光系數(shù)（7.010-4M-1cm-1）和大的斯托克斯位移。與Zn2+的結(jié)合后形成1:1的絡(luò)合物，氨基對生色團的在電子供電能力下降，溶液的顏色也從藍(lán)色變?yōu)樗{(lán)綠色的（深藍(lán)綠色）（Scheme 5）。ESI-MS和吸收和發(fā)射光譜的變化可證明1:1的絡(luò)合物的形成。高濃度的Zn2+存在時，最大吸收波長會發(fā)生44nm的紅移，從而表明該分子是一種檢測Zn2+的比例探針（Figure 13）。分子27的金屬離子選擇性見Figure 14。雖然金屬離子如CO2+和Cu2+影響熒光的發(fā)射，但由于這些離子在活體內(nèi)濃度極低，所以影響不大。這些氨基取代的碳菁染料的熒光變化適用于各種生物分子或酶的雙波長檢測。Tang等報道了另一個三碳菁染料的變體在近紅外區(qū)域的發(fā)射 34 。這個探針（29）可以用tricarbocyanine與2,2-dipicolylamine一步反應(yīng)方便的制備。化合物29在乙腈中的吸收波長為606 nm和發(fā)射波長為800nm，斯托克斯位移為194 nm。與Zn2+結(jié)合后，熒光探針的熒光發(fā)射強度增加，而其