微生物遺傳育種論文格式及要點(diǎn)(PPT最后)完整版本.ppt

高通量篩選技術(shù)Highthroughputscreening 王陶 2013年4月 高通量篩選最初是伴隨組合化學(xué)而產(chǎn)生的一種藥物篩選方式 1990年末 組合化學(xué)的出現(xiàn)改變了人類獲取新化合物的方式 人們可以通過較少的步驟 在短時間內(nèi)同時合成大量化合物 在這樣的背景下高通量篩選的技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生 高通量篩選技術(shù)可以在短時間內(nèi)對大量候選化合物完成篩選 經(jīng)過近十年的發(fā)展 已經(jīng)成為比較成熟的技術(shù) 不僅僅應(yīng)用于對組合化學(xué)庫的化合物篩選 還更多地應(yīng)用于對現(xiàn)有化合物庫的篩選 目前世界各大藥物生產(chǎn)商都建立有自己的化合物庫和高通量篩選機(jī)構(gòu) 對有潛力形成藥物的化合物進(jìn)行篦梳式的篩選 我國藥物高通量篩選起步較晚 且不規(guī)范 僅有十多年的研究歷史 1996年中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院引進(jìn)國內(nèi)第一臺Bionek2000型實(shí)驗(yàn)自動化工作站 1998年又引進(jìn)全國第一臺Topcount微量閃爍計(jì)數(shù)器 使放射配基實(shí)驗(yàn) 放射免疫實(shí)驗(yàn)等技術(shù)微量化 自動化 上海藥物研究所 北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院分別成立了藥物篩選專門機(jī)構(gòu) 開始從事大規(guī)模篩選工作 西安交通大學(xué)藥學(xué)院賀浪沖教授首創(chuàng)的細(xì)胞膜色譜 CMC 為化合物的體外高通量篩選提供了高選擇性 高特異性 高效率的篩選手段 CMC已成功用于鈣離子拮抗劑受體配體結(jié)合反應(yīng)的研究 目前正在進(jìn)行心血管化學(xué)合成藥物的高通量篩選和中藥有效部位及有效成分的尋找 今年將建立CMC自動化篩選體系 促進(jìn)我國藥物高通量篩選技術(shù)的全面發(fā)展 概念 高通量篩選 Highthroughputscreening HTS 技術(shù)是指以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ) 以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體 以自動化操作系統(tǒng)執(zhí)行試驗(yàn)過程 以靈敏快速的檢測儀器采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù) 以計(jì)算機(jī)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理 同一時間對數(shù)以千萬樣品檢測 并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫支持整體運(yùn)轉(zhuǎn)的技術(shù)體系 高通量細(xì)胞篩選技術(shù) high throughputcell basedscreeningtechnology 是以高通量方式研究基因功能最有效的方法之一 通常 基因功能的初步篩選在96孔或384孔板上進(jìn)行 通過基因轉(zhuǎn)染將候選基因?qū)爰?xì)胞 或直接將基因表達(dá)產(chǎn)物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中 是20世紀(jì)80年代后期發(fā)展起來的一種篩選新技術(shù) 它集計(jì)算機(jī)控制 自動化操作 高靈敏度檢測 數(shù)據(jù)結(jié)果自動采集和處理于一體 實(shí)現(xiàn)了篩選的快速 微量 靈敏和大規(guī)律 日篩選量達(dá)到數(shù)萬甚至數(shù)十萬樣品次 是篩選技術(shù)和方法的一大進(jìn)步 篩選測定方法基于要研究的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)問題 例如 要研究抗血管生成活性 選用內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生長 分化 遷移和粘附等分析測定 研究免疫調(diào)節(jié)活性 可選擇淋巴細(xì)胞或造血細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生長和分化的分析測定 研究神經(jīng)營養(yǎng)因子活性 可選用神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞存活 突起生長測定 除上述與細(xì)胞表型或形態(tài)學(xué)相關(guān)的檢測指標(biāo)外 細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 糖代謝 能量產(chǎn)生和代謝產(chǎn)物分析 metaboliccontrolanalysis 等代謝通路也是基因功能重要的研究內(nèi)容 結(jié)合抗體芯片技術(shù) 多路測定技術(shù) multiplexing 等新的檢測方法 高通量細(xì)胞篩選的應(yīng)用更為廣泛 另外 隨著熒光成像讀板儀 fluorescenceimageplatereader FLIPR 定量PCR 高通量熒光激活細(xì)胞分類器 HT FACS 等檢測方法和技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用 靈敏度和重現(xiàn)性這兩個高通量細(xì)胞篩選的關(guān)鍵問題也逐步得以解決 一 高通量篩選常用儀器設(shè)備 Whatman過濾型做孔板是種多孔形狀物體 便于快速和批量處理樣品 板上刻有號碼適合于各種微孔板配用儀器和白動控制裝置 Boekel微孔板振蕩器的特點(diǎn)獨(dú)立設(shè)定溫度 振蕩速度和混合時間 混勻器可以編程設(shè)定運(yùn)行一定時間或者瞬時混合3秒 內(nèi)置的蓋可以減少污染 樣品揮發(fā)或者噪音的危險(xiǎn) 多通道移液器 連續(xù)移液器 一次性吸取大量液體 然后每次按動按鈕 僅僅釋放小量等體積的液體 大量液體進(jìn)行等體積分裝 215全自動移液工作站 1 大容量 可自動處理12個96孔反應(yīng)板或480個試管的樣品 2 特別適合于HPLC或LC MS的樣品處理 3 使用709軟件 有易用的圖示管架編輯器 4 無論開口試管或密封試管都有很高精確度 5 Micro215進(jìn)樣量可低至0 5ul 6 多通道215自動樣品處理系統(tǒng)可同時處理8個樣品 多功能酶標(biāo)儀 多功能微孔板檢測儀 微孔板檢測設(shè)備之一 集成4大功能模塊 可進(jìn)行放射性 非放射性檢測 流式細(xì)胞儀 C6流式細(xì)胞儀系統(tǒng)是一種全功能 雙激光 六探測器的流式細(xì)胞儀分析系統(tǒng) C6流式細(xì)胞儀系統(tǒng)的探測器不但可靈敏的捕獲前散射光和旁散射光 還有四個可調(diào)光學(xué)濾光片的熒光探測器 CFlow操作軟件使搜集數(shù)據(jù)和分析變的簡單快速 高集成度 高度自動化的主機(jī) 以及優(yōu)良人機(jī)界面 操作簡便的CFlow軟件系統(tǒng) 高通量平行合成儀 高通量平行合成儀 液相芯片檢測儀 微孔過濾板 12通道藥物篩選儀 國家新藥篩選中心 條形碼技術(shù) 條形碼 barcode 是將寬度不等的多個黑條和空白 按照一定的編碼規(guī)則排列 用以表達(dá)一組信息的圖形標(biāo)識符 常見的條形碼是由反射率相差很大的黑條 簡稱條 和白條 簡稱空 排成的平行線圖案 條形碼可以標(biāo)出物品的生產(chǎn)國 制造廠家 商品名稱 生產(chǎn)日期 圖書分類號 郵件起止地點(diǎn) 類別 日期等許多信息 因而在商品流通 圖書管理 郵政管理 銀行系統(tǒng)等許多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng) SAS StatisticalAnalysisSystem 統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng) 是當(dāng)今國際最著名的數(shù)據(jù)分析軟件系統(tǒng) SAS 數(shù)據(jù)的輸入輸出和整理 描述性統(tǒng)計(jì) 假設(shè)檢驗(yàn) 圖形的制作 回歸分析 多元統(tǒng)計(jì)分析 方差分析 協(xié)方差分析和時間序列分析等 數(shù)據(jù)訪問 數(shù)據(jù)管理 數(shù)據(jù)呈現(xiàn) 數(shù)據(jù)分析SPSSEXCEL 二 高通量篩選技術(shù)常用方法 微孔板的使用和光學(xué)檢測法工程菌株的裂解報(bào)告基因流式細(xì)胞技術(shù)蛋白質(zhì)芯片 微孔板的使用和光學(xué)檢測法 化學(xué)發(fā)光指化學(xué)反應(yīng)過程中發(fā)射出來的光 又稱冷光 生物發(fā)光是化學(xué)發(fā)光的一種 專指由酶催化的化學(xué)反應(yīng)過程中發(fā)射出的光 化學(xué)和生物發(fā)光經(jīng)常被用于測定樣品中未知成分的量 并且在過去的十年里在基因表達(dá)和基因調(diào)控的研究中發(fā)揮著非常重要的作用 通過發(fā)射光的比率可以推出未知成分的濃度 因此測定化學(xué)反應(yīng)過程中的發(fā)射光是非常有用的 反應(yīng)過程中產(chǎn)生的光與發(fā)射光的量產(chǎn)率是直接相關(guān)的 相應(yīng)的 與發(fā)光物質(zhì)的濃度成比例 因此 反應(yīng)過程中的光可以相對反映出目標(biāo)樣品中發(fā)光物質(zhì)的量 化學(xué)發(fā)光儀使用范圍 ATP 三磷酸腺甙 檢驗(yàn) 熒光素酶檢驗(yàn) 免疫及proteomics 核酸 DNA及基因組 病毒研究 比如 SARS 禽流感病毒研究 臨床診斷研究 染色體分析 毒性試驗(yàn) 細(xì)胞活力試驗(yàn) 餐館衛(wèi)生檢測 環(huán)境檢測 工業(yè) 農(nóng)林業(yè) 畜牧業(yè) 養(yǎng)殖業(yè)等其它用途最廣泛的用途是對利用報(bào)告基因檢測目標(biāo)基因的表達(dá)以及檢測細(xì)胞內(nèi)ATP水平 報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 分子生物學(xué)家和細(xì)胞生物學(xué)家利用報(bào)告基因研究基因的表達(dá)和調(diào)控 將報(bào)告基因引入細(xì)胞DNA使之與某一特定分子事件相關(guān) 可以為這一分子事件帶來可測性 通常檢測的分子事件是基因功能 具有可測性的是發(fā)光 目前 市場上有許多發(fā)光報(bào)告基因出售 包括 螢火蟲熒光素酶 fireflyluciferase 半乳糖苷酶 B galactosidase 葡萄糖苷酸酶 B glucuronidase GUS 堿性磷酸酶 alkalinephosphatase 和人生長激素 humangrowthhormone hGH 高靈敏度 低成本 快速以及使用簡單使得發(fā)光檢測儀成為理想的基因表達(dá)研究工具 ATP水平測定 所有活細(xì)胞都含有ATP ATP可以從細(xì)胞中提取出來 用螢火蟲熒光素酶檢測 在這個發(fā)光反應(yīng)中 ATP是限制性反應(yīng)物 因此 到達(dá)發(fā)光檢測儀光電倍增管的光與樣品中ATP的含量成比例 相應(yīng)的與提取ATP所用的細(xì)胞數(shù)成比例 ATP發(fā)光檢測方法已經(jīng)使用了幾十年 微生物污染檢測 ATP的發(fā)光檢測方法可以檢測樣品中的所有微生物 因而被用于檢測水中的大腸桿菌含量 包括飲用水和用于oilfieldinjection coolingsystem以及紙加工過程的工業(yè)用水 ATP的發(fā)光檢測方法還可以用于藥品 化妝品 牛奶以及其它食品的微生物控制 三 高通量篩選的技術(shù)過程 1 樣品庫2 初篩和復(fù)篩3 活性化合物4 深入篩選5 獲得少量先導(dǎo)化合物6 確證篩選藥物藥理學(xué)研究7 侯選藥物8 臨床前研究 HTS篩選的基本步驟 第一步是選擇分子靶 選擇的依據(jù)是來源于國際醫(yī)學(xué)生物學(xué)的新成果 目前國際常用的分子靶有以下幾類 A 細(xì)胞膜受體 B 離子通道蛋白 C 酶蛋白 D 細(xì)胞核受體 E 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 第二步是建立穩(wěn)定表達(dá)分子靶的生物體系 靶是蛋白 克隆相對應(yīng)的蛋白 在大腸桿菌中表達(dá)和提純 靶是細(xì)胞受體 克隆出的基因轉(zhuǎn)化到載體細(xì)胞中 建立穩(wěn)定的細(xì)胞株 第三步建立簡便快速的大規(guī)模的生物檢測方法 根據(jù)靶的不同分為兩類 1 以蛋白等分子為基礎(chǔ) 2 以細(xì)胞為基礎(chǔ)酶蛋白 測定酶活性的變化 細(xì)胞膜受體 測定配體 受體的結(jié)合 細(xì)胞核受體 測定蛋白的表達(dá) 在建立大規(guī)模生物檢測方法的同時 要用組合化合物的方法合成大量不同結(jié)構(gòu)的化合物庫相配套 HTS藥物篩選靶點(diǎn)與檢測方法 1 分子靶點(diǎn)篩選模型 細(xì)胞信號通路篩選系統(tǒng)外界信號從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞內(nèi) 或者直接穿過細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核 最終影響某些基因的轉(zhuǎn)錄 在這個傳遞過程中 某些特殊的細(xì)胞或一些病理狀況下 可能是其中的一條或幾條通路起作用 藥物可以根據(jù)需要對這些通路進(jìn)行阻斷 使用信號通路篩選系統(tǒng) 可直接對藥物作用的分子機(jī)制有所了解 2 細(xì)胞膜表面受體篩選模型a G蛋白耦聯(lián)受體 受體與GTP結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白的耦聯(lián) 在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生cAMP 從而將外界信號跨膜傳遞到細(xì)胞內(nèi) 如趨化因子受體 受體阻斷劑等 b 催化受體 為單跨膜受體 分為胞外區(qū) 跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū) 當(dāng)細(xì)胞因子與胞外區(qū)結(jié)合后 引起多個受體單體的聚合 每個聚合體的受體單體可以是同一類型 也可以不同 如EPO G CSF GH受體2個同樣的單體 IL 1 GM CSF IL 6受體是2個不同的單體 TNF 是3個同樣的單體 IL 2是3個不同的受體 c 離子通道耦聯(lián)受體 細(xì)胞表面一些神經(jīng)遞質(zhì)的受體 自身是一些離子通道 或者與離子通道相耦聯(lián) 當(dāng)與配體結(jié)合時 受體構(gòu)象改變 通道開放 離子進(jìn)出細(xì)胞 引起電興奮 作業(yè) 第四章微生物雜交育種1 放線菌雜交方法有哪些 簡述每種方法的具體過程 第五章基因工程育種1 簡述基因體外定位誘變的方法 第六章高通量篩選技術(shù)1 簡述表面展示技術(shù)的方法 2 什么是報(bào)告基因 作為報(bào)告基因 在遺傳選擇和篩選檢測方面應(yīng)具備哪些條件 常見報(bào)告基因有哪些 本課程考核方式 寫一篇與微生物遺傳育種相關(guān)的綜述 字?jǐn)?shù)不低于4000字 期末成績 平時20 實(shí)驗(yàn)20 論文60 評分辦法 課程論文占60 其評分標(biāo)準(zhǔn)如下 1 選題新穎 熱點(diǎn)問題的研究 空白問題的探索 老問題的新視野 10分 2 結(jié)構(gòu)合理 行文流暢 邏輯嚴(yán)謹(jǐn) 學(xué)術(shù)語言規(guī)范 20分 3 觀點(diǎn)鮮明 資料翔實(shí) 立論深刻 有所創(chuàng)新 30分 4 注釋與參考文獻(xiàn) 文獻(xiàn)數(shù)量 種類 外文文獻(xiàn) 10分 5 規(guī)范程度 題目 內(nèi)容提要 關(guān)鍵詞 正文 注釋 參考文獻(xiàn) 20分 6 總結(jié)全文的主要論點(diǎn)和發(fā)展方向 指出目前研究中尚需解決的問題及研究成果的意義和價值 10分 7 字?jǐn)?shù)不少于4000字 每少100字扣1分 論文格式要求 1 題名 黑體 小三 居中 2 姓名 班級 學(xué)號 仿宋 小四 居中 3 摘要 對全文進(jìn)行概括 提出研究目的與意義 論文主要內(nèi)容 150字左右 五號 楷體 首行縮進(jìn)2字符 行距固定值20磅 摘要 二字加粗 4 關(guān)鍵詞 3 8個 五號 楷體 首行縮進(jìn)2字符 各關(guān)鍵詞之間加分號 最后一詞之后不加標(biāo)點(diǎn)符號 關(guān)鍵詞 三字加粗 5 正文五號宋體 全文所有西文字體均采用TimesNewRoman 首行縮進(jìn)2字符 行距固定值20磅 6 前言 簡要介紹研究背景 研究現(xiàn)狀 不要與摘要重復(fù) 7 正文標(biāo)題采用編碼格式 一級標(biāo)題加粗 示例如下 1空間誘發(fā)微生物突變的作用機(jī)制研究2微生物空間誘變的研究與進(jìn)展2 1空間誘變對微生物產(chǎn)酶活性的影響2 2空間誘變對微生物產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物活性的影響2 3 3問題和展望3 1 9 正文最后要有結(jié)語 或展望 對全文作總結(jié) 可指出目前研究中存在的問題 今后發(fā)展的方向 10 參考文獻(xiàn)格式按照國標(biāo)GB7714 2005 參考文獻(xiàn)著錄規(guī)則