生化復習題 (1).doc

生化習題考試時間：6月11日（周三）晚上18：30-20：30 地點：禧強樓-203題型：名詞解釋10個，共20分。簡答題6個，共30分。論述題5個，共50分。一、糖蛋白和蛋白聚糖1、糖鏈的一、二、三、四級結構的概念（1） 一級結構：單糖殘基的組成、排列順序、相鄰單糖殘基的連接方式、異頭物的構型及糖鏈有無分支、分支的位置和長短等。（2） 二級結構：多糖骨架鏈間以氫鍵結合所形成的各種聚合體,關系到多糖分子中主鏈的構象,不涉及側鏈的空間排布;（3） 三級結構：多糖鏈一級結構的重復順序,由于糖殘基中的羥基、羧基、氨基以及硫酸基之間的非共價相互作用,導致有序的二級結構空間形成有規(guī)則而粗大的構象;（4） 四級結構：多糖鏈間非共價鍵結合形成的聚集體。2、 糖蛋白、蛋白聚糖、O-連糖蛋白、N-連糖蛋白、糖組學等概念（1） 糖蛋白 Glycoproteins: 由寡糖鏈和多肽或蛋白質以共價鍵連接而成的結合蛋白。糖含量1%80%。寡糖鏈不多于15個單糖殘基。（2） 蛋白聚糖 proteoglycan : 含大量糖胺聚糖并與多肽骨架連接的高分子物質。糖含量95%（3） 連接糖蛋白：糖蛋白糖鏈與蛋白部分的絲/蘇氨酸殘基的羥基相連，稱為O-連接糖蛋白。（4） N-連接糖蛋白：糖蛋白的糖鏈與蛋白部分的Asn-X-Ser序列的天氡酰胺氮以共價鍵連接稱N-連接糖蛋白。（N-連接糖蛋白的糖基化位點為Asn-X-Ser/Thr）（5） 糖組學(糖蛋白) Glycomics ：涉及單個個體的全部糖蛋白結構分析，確定編碼糖蛋白的基因和蛋白質糖基化的機制。3、 糖蛋白中糖鏈的生物學功能分子間：細胞-細胞間識別、粘附和結合病原體, 趨靶于組織。分子內：蛋白質的正確折疊、細胞內定位、生物活性、溶解度、抗原性、生物半壽期、蛋白酶敏感性等；介導專一的“識別”和“調控”生物過程。 糖鏈在糖蛋白新生肽鏈折疊和締合中的作用：1) 去糖基化的蛋白不能正確折疊維持亞基正常構象； 1-抗胰蛋白酶(不能折疊) 皰疹口炎病毒（VSV）的G蛋白(不能形成正確二硫鍵) 流感病毒紅細胞凝集素（HA,一種糖蛋白）用糖鏈合成抑制劑衣霉素后，肽鏈部分正常合成，糖鏈部分不能合成，糖蛋白不能正常折疊，不能形成三聚體，不能被分泌到胞外。 2) 寡聚蛋白中的糖鏈能影響亞基的締合亞基間通過糖鏈相互識別而發(fā)生締合。運鐵蛋白受體二聚體跨膜糖蛋白，6條糖鏈，Asn251去糖基化，不能形成二聚體，影響受體的轉運和功能,而且在細胞內迅速被蛋白酶水解。糖鏈影響糖蛋白的穩(wěn)定性1) 極性糖鏈有助于蛋白質的溶解2) 真核細胞中表達的糖蛋白在原核細胞內聚集成包涵體糖鏈對糖蛋白分揀、投送和分泌的作用1) 去糖鏈的免疫球蛋白不能分泌到胞外；2) N-聚糖中的甘露糖-6-磷酸結構是糖蛋白分揀到溶酶體中的標志，用衣霉素處理細胞阻止N-糖化，可使很多定位于細胞膜上的糖蛋白減少。糖鏈參與分子識別和細胞間識別（識別功能）1） 糖鏈與精卵識別 透明帶糖蛋白ZP-3上的O-GalNAc卵子凝集素受體精子 花粉表面糖蛋白柱頭表面受體2） 糖鏈和細胞粘著 多細胞生物中細胞有相互識別聚集成細胞群的能力細胞粘著 細胞外基質(ECM)：糖蛋白（層粘連蛋白 laminin、膠原Collagen、纖粘連蛋白 Fibronectin ）、氨基聚糖及蛋白聚糖 膜內在蛋白：整聯蛋白、鈣粘著蛋白等3） 糖鏈與血漿中老蛋白的清除(5)糖鏈與糖蛋白的生物活性1） 糖鏈與酶活性-葡萄糖苷酶去糖鏈影響； 酵母羧肽酶去糖鏈無影響2） 糖鏈與激素活性腺垂體促激素類：促卵泡激素、促黃體激素、促甲狀腺激素等糖鏈末端結構不同，與受體親和力不同。腎臟紅細胞生成素（4條N糖鏈，二、三、四天線）四天線越多，體內活性越高。3） 糖鏈與IgG活性IgG缺外鏈Gal自身抗原被免疫系統識別產生自身抗體自身抗體與缺外鏈Gal 的IgG生成免疫復合物關節(jié)內炎癥(6)糖類和血型物質(7)毒素受體功能、細胞內運輸功能、開關與調節(jié)功能4、 蛋白聚糖中常見的糖胺聚糖的種類(糖胺聚糖：由己糖醛酸或半乳糖與氨基己糖構成的二糖單位重復幾十到幾百次組成的線性糖鏈。)體內重要的糖胺聚糖（6種）：1 透明質酸(hyaluronic acid, HA)2 硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)3 硫酸皮膚素CS(dermatin sulfate, DS)4 硫酸角質素(keratan sulfate, KS)5 硫酸乙酰肝素/肝素(heparan sulfate, HS/heparin, Hep)5、 蛋白聚糖的生物學功能構成細胞外基質：在基質中蛋白聚糖和彈性蛋白、膠原蛋白以特殊方式連接，構成基質的特殊結構。這與細胞的粘附、遷移、增殖和分化等有關。其它功能：抗凝血（肝素）參與細胞識別結合與分化（細胞表面的硫酸素）維持軟骨機械性能（硫酸軟骨素）等二、蛋白質空間結構1、 蛋白質的生物學功能1 酶的催化功能2 結構功能：collagen （膠原蛋白）、elastin （彈性蛋白）、keratin （角蛋白）、fibroin （蠶絲蛋白）、proteoglycan （蛋白聚糖）3 運輸功能：Transport within or between different cells or tissues（不同細胞或組織之內/之間的運輸）Transport into or out of cells（運輸進入或出去細胞）4 儲藏功能：ovalbumin（卵清白蛋白）、casein（酪蛋白）、zein（玉米蛋白）、ferritin（鐵蛋白）5 actin（肌動蛋白）、myosin（肌球蛋白）、tubulin（微管蛋白）。（肌球蛋白和肌動蛋白是包含在肌肉絲狀蛋白分子。在鈣離子（底部）的存在，肌球蛋白和肌動蛋白會滑過對方，形成跨橋梁，從而收縮肌肉。）6 調節(jié)功能：To regulate the ability of other proteins（調節(jié)其他蛋白質的活性） 激素：insulin ( 胰島素) 、somatotropin (生長激素)、thyrotropin (促甲狀腺素）To regulate the gene expression（調節(jié)基因表達）Positively（正調節(jié)）：AP1 Negatively（負調節(jié)）：NF1、 lac repressor (乳糖抑制體) 防御功能：脊椎動物利用抗體防御（也就是中和抗原） 2、 蛋白質各級空間結構的概念及這些空間結構的關系一級結構：蛋白質多肽鏈的氨基酸殘基的排列順序。二級結構：指肽鏈的主鏈在空間的排列，或規(guī)則的幾何走向、旋轉及折疊。（轉角、折疊片 、螺旋、自由回轉 ）。超二級結構(supersecondary structure)：是指蛋白質若干相鄰的二級結構單元組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則的，在空間上能辨認的二級結構組合體。（，）結構域（domain）：多肽鏈在二級結構或超二級結構基礎上形成三級結構的局部折疊區(qū)，它是相對獨立的緊密球狀實體，具有部分生物功能的結構。反平行螺旋結構域反平行折疊片結構域平行或混合型折疊片結構域富含金屬或二硫鍵結構域。三級結構(Tertiary Structure)：在二級結構基礎上，肽鏈不同區(qū)段的側鏈基團相互作用,在空間進一步盤繞、折疊形成包括主鏈和側鏈構象在內的三維結構。四級結構：一些特定三級結構的肽鏈通過非共價鍵而形成的大分子體系的組合方式。3、 蛋白質一級結構測定的基本步驟1 測定蛋白質分子中多肽鏈的數目： 根據蛋白質N-端或C-端殘基的摩爾數和蛋白質相對分子質量確定蛋白質分子中的多肽鏈數目。 單體蛋白質只含一條多肽鏈，則蛋白質的摩爾數與末端殘基的摩爾數相等； 如果蛋白質分子是由多條多肽鏈組成，則末端殘基的摩爾數是蛋白質的摩爾數的倍數。2 肽鏈的拆分： 非共價鍵連接：尿素或鹽酸胍處理 通過-S-S-交聯：尿素或鹽酸胍存在下，過量的-巰基乙醇處理3 測定每條多肽鏈中氨基酸組成： 水解（酸，堿水解，特殊基團的保護）， 衍生（熒光胺, 茚三酮，PTC-aa法等）， 色譜（離子交換層析，HPLC,氣相層析） 4 分析多肽鏈的N-末端和C-末端：建立兩個重要的氨基酸序列參考點。1） N末端分析：sanger反應；丹磺酰氯（DNS）法；Edman反應，(PITC法)N端標記； 雙標記法（DABITC/PITC）易于操作，批量處理4-N,N/-二甲氨基偶氮苯-4-異硫氰酸苯酯/異硫氰酸苯酯2） C末端分析： 肼解法 還原法羧肽酶法5 肽鏈的部分降解和肽段的分離 降解：酶解法、化學法 肽段分離：凝膠過濾、凝膠電泳、離子交換柱層析、HPLC等測定每個肽段的氨基酸順序：改進Edman降解法，用熒光基團或有色基團標記PITC，提高測定靈敏度（DABITC/PITC）質譜法(mass spectrography)：氣質聯用（GCMS），液質聯用（HPLC和質譜）確定肽段在多肽鏈中的次序：利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序(片段重疊法)。確定原多肽鏈中二硫鍵的位置4、 獲得蛋白質一級結構的方法有哪些，各有何優(yōu)缺點1 質譜分析方式 (分析2D得到的蛋白) 缺點：蛋白的基團越大，質譜檢測的準確率越低。因此，在質譜檢測之前，須將蛋白消化成小分子的多肽，以提高質譜檢測的準確率。質譜測序現在仍很難被應用于未知蛋白的序列測定。優(yōu)點：可用于蛋白質的純度鑒定；分子量測定；肽鏈氨基酸排序；肽（質譜）分析；二硫鍵數目和位置、乙酰化、糖基化、磷酸化以及非共價結合等。2 蛋白質N-末端序列 (Edman降解 ) 確定新的蛋白質，通過DNA重組技術構建寡核苷酸探針；根據免疫學機理制備抗多肽的抗體 N末端15個序列的測定，很大程度上排除了蛋白質混淆的可能性 3 分子克隆技術和快速DNA序列分析手段 測序速度較慢(50AA/天)；樣品用量較大(nmol級或幾十pmol級)；對樣品純度要求很高；對于修飾氨基酸殘基往往會錯誤識別，而對末端保護的肽鏈則無法測序.5、 測定蛋白質三維空間結構的方法有哪些？1 X-衍射技（80-85%）：X-射線在晶體上散射2 核磁共振技術（NMR）（15-20%）3 電鏡三維重構、各種光譜技術4 顯微技術和計算機模擬6、 多肽鏈折疊的空間限制因素 一個具有生物活性的蛋白質多肽鏈在一定條件下往往只有一種或很少的幾種構象。肽鍵帶有雙鍵的性質，主鏈上1/3的鍵不能自由旋轉。不是任意二面角（，）所決定的肽鏈構象都是立體化學所允許的。二個肽平面旋轉時受到-C原子上側鏈R基空間位阻（大小、親水性、電荷相吸或排斥等）的影響。7、 球狀蛋白質的結構特點球狀蛋白質分子含多種二級結構元件球狀蛋白質三維結構具有明顯的折疊層次球狀蛋白質分子是緊密球狀或橢球狀實體疏水側鏈分子內部，親水側鏈分子表面（水溶性蛋白）球狀蛋白質分子表面有一個空穴（裂溝、凹槽），常為活性部位8、 脂類錨定蛋白的特點和分類1 特點： 許多情況下通過脂錨鉤與膜連接來調節(jié)蛋白活性 具有瞬時性，能可逆地與蛋白質連接和脫離。為蛋白質對膜的親和性提供了一個 轉換裝置，參與膜外信號的轉導 非跨膜的整合蛋白：脂類錨定蛋白共價結合于疏水碳鏈2 分類：（共價結合的疏水碳鏈） N-豆蔻酰錨定蛋白(cAMP依賴蛋白、G蛋白) 硫醚異戊二酰錨定蛋白（Rho蛋白） S-脂肪?；^定蛋白（病毒表面糖蛋白、轉鐵蛋白受體） GPI（糖基磷脂酰肌醇）錨定蛋白三、蛋白質分離純化1、 蛋白質分離純化的基本原則根據蛋白質的溶解性、分子大小、電荷、特殊的親和力的差異進行分離純化。1 利用溶解度差別分離 鹽析常用的鹽為硫酸銨(溫度、pH、蛋白質濃度)：高濃度的中性鹽可以中和蛋白質表面電荷、奪取蛋白質周圍的水化膜，破壞蛋白質在水溶液中的穩(wěn)定性，從而將蛋白質從溶液中析出。 低溫有機溶劑沉淀法(甲醇、乙醇、丙酮) 等電點沉淀法(適用于在等電點pH穩(wěn)定的蛋白質)2 根據分子大小不同分離 透析法Dialysis：蛋白質分子不能透過半透膜，而使其與小分子化合物（無機鹽、單糖、雙糖、氨基酸、小肽以及表面活性劑等）分離。 超過濾法：是利用壓力或離心力，強行使水和其他小分子溶質通過半透膜，而蛋白質留在半透膜上，以達到濃縮和脫鹽的目的 凝膠過濾法 密度梯度離心法（density gradient）3 利用蛋白質所帶電荷分離 離子交換層析：利用物質的電荷與層析載體（離子交換劑）電荷之間的相互作用而達到分離純化的目的，屬于吸附層析。 電泳技術：帶電粒子在電場中向與自身電荷相反的電極移動的現象稱為電泳。 （聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、等電聚焦、雙向電泳）親和層析法：利用生物大分子和其他物質(配基)進行特異性又可逆的結合這一性質，對這些生物大分子物質進行層析分離的方法。疏水層析和反向層析：疏水層析：蛋白質具有親水與疏水兩重性，如果在層析基質上接上疏水的基團，就能在一定條件下與某些蛋白質的疏水基團相互作用，使之吸附，而達到分離純化的目的。反向層析(反相色譜,reverse phase chromatography)是液相色譜分析中最常用的技術。 四、泛素介導的蛋白降解1、泛素介導的蛋白質降解過程如何進行？需要哪些物質的參與，它們各自的作用是什么泛素的活化：泛素甘氨酸端的羧基連接到泛素活化酶E1的巰基，這個步驟需要以ATP 作為能量，最終形成一個泛素和泛素活化酶E1之間的硫酯鍵。E1將活化后的泛素通過交酯化過程交給泛素結合酶E2。 泛素連接酶E3將結合E2的泛素連接到目標蛋白質上并釋放E2，形成特定的泛素化的蛋白質。4 泛素化的蛋白質被特定的蛋白酶體識別并結合，最終在蛋白酶的催化下蛋白質分解為短肽或氨基酸。需要的物質及其作用：E1泛素激活酶：E2泛素結合酶：E3泛素連接酶：在底物的特異性選擇降解過程中作最為關鍵成員。HECT結構域能接受從E2轉移而來的泛素分子形成E3-Ub復合物。環(huán)指結構域它們起著將底物蛋白與E2-Ub靠近的作用，從而使得E2-Ub復合物上的泛素能高效地轉移到底物蛋白上。DUB脫泛素酶：泛素C-末端水解酶-多聚泛素基因表達產物的C-末端額外短肽的去除，以及泛素延伸蛋白中泛素單體與核糖體蛋白的分離。泛素特異性加工酶-從泛素上除去蛋白。五、蛋白質的變性、復性及蛋白質折疊1、蛋白質變性的概念、變性蛋白的特點、變性的化學本質蛋白質變性的概念：由于外界因素的作用，使天然蛋白質分子的構象發(fā)生了異常變化，從而導致生物活性的喪失以及物理、化學性質的異常變化 ，這種現象稱為蛋白質的變性(denaturation)。變性蛋白的特點：生物活性喪失抗原性改變理化性質改變：溶解度下降（沉淀）、結晶能力喪失、特性粘度增加、擴散速度下降等生化性質改變：易被蛋白質水解。變性的化學本質：天然蛋白質分子從緊密有序的結構松散無序結構的過程。涉及構象變化，二硫鍵的斷裂及側鏈基團的化學修飾2、蛋白質折疊的學說1 經典的蛋白質折疊自組裝學說由Anfinsen等根據對RNase復性研究的經典實驗提出來的經典的“熱力學假說”認為，天然蛋白質多肽鏈采取的構象是在一定環(huán)境條件下熱力學上最穩(wěn)定的結果，采取天然構象的多肽鏈和它所處的一定環(huán)境條件（如溶液組分、PH、溫度、離子強度等）整個系統的總自由能最低，所以處于變性狀態(tài)的多肽鏈在一定的環(huán)境條件下能夠自發(fā)折疊成天然構象。許多蛋白（特別是一些小蛋白）在體外可以可逆的進行變性、復性，使“熱力學假說”得到了廣泛的支持。2 Ellis的“輔助性組裝學說”體內蛋白質的折疊往往需要有其他輔助因子的參與，并伴隨有ATP的水解。因此，Ellis于1987年提出了蛋白質折疊的“輔助性組裝學說”。這表明蛋白質的折疊不僅僅是一個熱力學的過程，顯然也受到動力學的控制?！拜o助性組裝學說”認為，蛋白質多肽鏈的正確折疊和組裝并非都能自發(fā)完成，在相當多的情況下是需要其他蛋白質分子的幫助，這類幫助蛋白包括分子伴侶與折疊酶。新的觀點在實質上并不和Anfinsen理論相矛盾，屬于蛋白質折疊途徑或折疊的識別和組裝問題上的認識的完善，為揭示生理或病理條件下蛋白質的折疊機理提供了新的研究思路，因而具有重要的理論意義和潛在的應用價值。3、蛋白質折疊需要哪些助折疊蛋白，它們各自的作用是什么輔助蛋白：1 分子伴侶（molecular chaperons）：一類相互之間沒有關系的蛋白質，他們的功能是幫助含多肽結構的其他物質在體內進行正確的非共價的組裝，但不是組裝完成的結構在發(fā)揮其正常的生物功能的組成部分。2 折疊酶（Foldase）： 蛋白質二硫鍵異構酶（protein disulfide isomerase PDI）：催化巰基的氧化、二硫鍵還原、二硫鍵之間的交換、脯氨酸羥化酶的亞基、甘油三酯轉移蛋白復合物的小亞基、糖基化位點結合蛋白。 肽基脯氨酸順反異構酶（peptidyl proly cistrans isomerase PPI ）：催化脯氨酸亞氨基的肽鍵異構化為順式。六、酶1、酶的概念、酶活性部分的概念、酶活性部位的特點、酶活性部位的研究方法酶的概念：酶是一類具有高效率、高度專一性、活性可調節(jié)的高分子生物催化劑。酶活性部分的概念：即活性中心。是酶分子的一小部分，是酶分子中與底物結合并催化反應的場所。酶活性部位的特點：總體積很小，占整個酶分子體積的1%-2%?；钚圆课皇且粋€小的空間區(qū)域?；钚圆课慌c底物的形狀不是正好互補?；钚圆课晃挥诿阜肿颖砻娴囊粋€裂縫(crevice) 。E與S結合成ES主要靠次級鍵。酶活性部位具有柔性或可運動性。酶活性部位的研究方法：化學修飾法X-射線衍射法動力學參數測定法基因定點突變法等2、酶降低活化自由能的因素1 鄰近和定向效應2 酶使底物分子中的敏感鍵產生“變形”（或張力）3 共價催化形成共價中間物4 酸堿催化5 活性中心部位的疏水環(huán)境效應3、米氏方程及Km、Kcat的含義米氏常數Km：酶促反應速度n為最大酶促反應速度值一半時的底物濃度。v = 1/2 Vmax, Km = SKcat轉換率：表示酶被底物飽和時每個酶分子在單位時間內能使底物轉化為產物的最大分子數催化常數。4、酶抑制作用的分類及相關的概念不可逆抑制作用：1）專一不可逆抑制：作用于酶的一類或幾類基團，這些基團中包含了必需基團，作用后引起酶的失活。2）非專一不可逆抑制：a）Ks型不可逆抑制劑親和標記試劑 具有和底物相似的基團，可以和相應酶的結合基團結合，同時還帶有一個活潑的基團，可以和酶活性部位的其他功能基團起反應，對后者進行化學修飾，從而抑制酶的活性。b）kcat型不可逆抑制劑被酶激活的不可逆抑制劑（酶的自殺性底物）I 以潛伏態(tài)存在，在無酶的情況下不反應必需通過它的靶酶專一被激活反應中，酶激活了這種無活力的潛伏態(tài)不可逆抑制劑，自身的活力則完全喪失自殺性底物可逆抑制作用：1）竟爭性抑制：抑制劑的化學結構類似過渡態(tài)底物，則對酶的親和力就會遠大于底物，從而引起酶的強烈抑制。2）非竟爭性抑制：非競爭性抑制劑存在時，Vmax值減小，Km值不變。3） 反竟爭性抑制：E只有與S結合后才能與I結合，形成不能分解的ESI三元中間產物，導致酶促反應被抑制I的存在加強了E、S的結合； 反競爭性抑制劑存在時，Km和Vmax值均減小5、酶活性的調節(jié)方式別構調節(jié)酶原激活可逆共價修飾調節(jié)七、RNA研究1、 RNA的分類及相應的概念RNA的分類：1 編碼蛋白mRNA（只包括mRNA的編碼區(qū)）2 非編碼蛋白RNA（持家RNA調控RNA）持家RNA：在生命活動過程中，長期恒定表達，其功能是維持基本生命所必需的。調控RNA：表達有時空特異性，常常是短暫表達；在生物的不同層面上調控：如不同的發(fā)育分化階段、不同性別、不同組織與細胞系、不同生理狀態(tài)調控；常與生物的適應性反應及應急性反應有關。2、 RNA的功能RNA在遺傳信息的翻譯中起著決定的作用：mRNA：信使(messenger)和模板(template) tRNA：轉運(transfer)和信息轉換(adaptor)rRNA ：裝配 (assembler)和催化(catalyst)RNA具有重要的催化功能（核酶）：.分子內催化：RNA合成后的加工（自我切割、拼接、環(huán)化） .分子間催化(核酶復合物) ：核糖核蛋白復合物R