五種電泳技術(shù)的比較.doc

精品文檔五種電泳技術(shù)的比較SDSPAGE 名詞解釋： 相對遷移率（Rf） 問答題: 1.簡述SDS-PAGE的基本原理。 2.影響SDS電泳的關(guān)鍵因素有哪些？ AGEv 名詞解釋1.遷移率2.電滲3.電泳v 問答題1.影響電泳遷移率的因素有哪些？2.試述瓊脂糖凝膠電泳分離脂蛋白的原理。CAME1.CAME的基本原理是什么？2.CAME分離血清蛋白電泳時應注意哪些問題？PAGE名詞解釋1.凝膠總濃度2.交聯(lián)度問答題1.與CAME相比，PAGE有哪些特點。2.試比較CAME與PAGE操作的區(qū)別。3.簡述不連續(xù)PAGE的原理。1.瓊脂糖凝膠電泳Agarose Gel Electrophoresisv Gel Electrophoresis ：由瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠及聚丙烯酰胺等物質(zhì)作支持體的電泳。v 特點（characteristic）：1.可以制成非常均勻的凝膠，帶電質(zhì)點在凝膠的孔中泳動。 2. 電泳操作方法簡便，電泳速度快。3. 分辨率高，重復性好，電泳圖譜清晰。4. 適用于生化，免疫等定性定量測定。（一）優(yōu)點（advantage)1.因不含硫酸根和羧基，幾乎消除了瓊脂的電滲。2.對蛋白質(zhì)吸附極微，故無拖尾現(xiàn)象。3.凝膠結(jié)構(gòu)均勻，孔徑較大，可用來分離酶的復合物、核酸、病毒 等大分子物質(zhì)。4.透明度較好，可直接或干燥成薄膜后進行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量測定。6.有熱可逆性。（二）缺點(disadvantage)1.機械強度差，易破碎，濃度不能太低。2.易被細菌污染，不易保存，臨用前配制。3.瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴散，電泳后必須立即固定染色。4.與PAGE相比，分子篩(molecular sieve)作用小，區(qū)帶少。 應用1. 適用于大分子的核酸、核蛋白等的分離、鑒定及純化2. 臨床生化檢驗中常用于LDH、CK等同工酶的分離與檢測3. 為不同類型的高脂蛋白血癥、冠心病等提供生化指標 影響遷移的因素v the size of the moleculev conformation of the molecule v the agarose concentration of a gelv Voltage百分濃度和分辨率限制v Most agarose gels are made with between 0.7% (good separation or resolution of large 510kb DNA fragments) and 2% (good resolution for small 0.21kb fragments) agarose dissolved in electrophoresis buffer. v Up to 3% can be used for separating very tiny fragments but a vertical polyacrylamide gel 聚丙烯酰胺is more appropriate in this case. v Low percentage gels are very weak and may break when you try to lift them. High percentage gels are often brittle and do not set evenly. 1% gels are common for many applications. 瓊脂糖凝膠分離血漿脂蛋白原理： 血清脂蛋白經(jīng)飽和蘇丹黑B預染后，以瓊脂糖凝膠為支持介質(zhì)，在pH8.6巴比妥緩沖液中電泳，根據(jù)各脂蛋白的組成、大小、形狀分離成不同區(qū)帶。v pH 8.6 pI ，各種脂蛋白均帶負電，電泳時由負極到正極；VLDL為圓形，受阻力小，LDL形態(tài)不規(guī)則，受阻力大，所以VLDL跑在前。加樣槽在負極，由負極到正極分別是CMLDLVLDLHDL2.醋酸纖維薄膜電泳Cellulose acetate membrane electrophoresis，CAME特點：低吸附作用，低電滲作用，樣本用量少，親水性1.Low sorption2.Low electroosmosis 3.Small sample4.Hydrophilic 電泳圖譜不齊點樣時血清點加不均勻薄膜局部干燥電泳時供給薄膜的液量不均勻或過少緩沖液變質(zhì)電泳時薄膜位置不正,與電流方向不平行 電泳圖譜分理不清點樣時血清點加不均勻薄膜局部干燥電泳時供給薄膜的液量不均勻或過少緩沖液變質(zhì)電泳時薄膜位置不正,與電流方向不平行 電泳速度慢 電流過低 供給薄膜的液量不足 緩沖液離子強度過高 薄膜中雜質(zhì) 白蛋白區(qū)帶中間部分不著色，染色不足染色時間不夠、點樣過多球蛋白向反方向移動電滲現(xiàn)象，可提高緩沖液液面或加大電流量以改進區(qū)帶一邊長一邊短呈扭曲現(xiàn)象薄膜未緊壓在電泳槽的濾紙橋上，使薄膜接觸不良而增大了電阻。 區(qū)帶拖尾或區(qū)帶過于緊密緩沖液離子強度0.05可出現(xiàn)區(qū)帶拖尾；離子強度0.075可出現(xiàn)區(qū)帶過于緊密。血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳Separate serum protein in cellulose acetate membrane electrophoresis原理 CAME是以醋纖膜（CAM）作支持物的一種區(qū)帶電泳技術(shù)。 將血清樣品點樣于醋纖膜上，在pH8.6的緩沖液中電泳時，血清蛋白質(zhì)均帶負電荷移向正極。由于血清中各蛋白組分等電點不同而致表面凈電荷量不等，加之分子大小和形狀各異，因而電泳遷移率不同，彼此得以分離。加樣：用加樣器蘸取血清約5ul，垂直印在CAM粗糙面，點樣區(qū)距離邊緣約1.5cm，電泳時點樣面朝下。加上槽蓋平衡5分鐘后再通電。電壓1015V/cm膜總寬。電泳4060分鐘，泳動距離約達3.54cm時即可斷電。由負極到正極可分為五條條帶 2 1 白蛋白3.聚丙烯酰胺凝膠電泳Polyacrylamide Gel Electrophoresis PAGE PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）單體和N，N-亞甲雙丙烯酰胺（N，N，N，N-methylene bisacrylamide，Bis）交聯(lián)劑通過自由基（ free radicals）聚合而成的一種多孔三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 過硫酸胺(NH4)2S2O8（Ammonium persulfate，AP）作為催化劑，四甲基乙二胺（-N,N,N,N-tetramethylethylene diamine , TEMED）為加速劑。 TEMED量多少都會影響催化作用，須在堿性條件下聚合 分子氧存在，聚合不完全，須去除分子氧，隔絕氧 升高溫度能提高聚合，降低溫度能延遲聚合PAG孔徑的大小主要由Acr和Bis這兩種單體的濃度決定?？梢愿鶕?jù)要分離物質(zhì)分子的大小，選擇合適的單體濃度。Acr/Bis：2040 完全透明且有彈性； 10 很脆，易碎，不透明； 100 糊狀不成形，易破碎常用的標準凝膠是指濃度為7.5%的凝膠交聯(lián)度CBis占單體與交聯(lián)劑總量的百分比。C=b/（a+b）100%電極槽緩沖液通常為pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液 分離原理1. 濃縮效應1）凝膠層的不連續(xù)性 兩層凝膠T與C不同孔徑不同 濃縮膠孔徑大，分離膠孔徑小，蛋白質(zhì)在大孔徑濃縮膠中移動，受阻力小，移動速度快。 2）緩沖液離子成分的不連續(xù)性甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3帶負電，朝正極移動，進入濃縮膠（pH6.7），甘氨酸解離度（a）很小，有效遷移率（M a）很低，移動速度較慢，稱為慢離子。HCl 是強電解質(zhì)，a=1，Cl-有效遷移率大，移動速度快，稱快離子。蛋白質(zhì)（pI6.0）帶負電荷，有效遷移率介于兩者之間。 3）pH值的不連續(xù)性 為了控制慢離子的解離度，從而控制其有效遷移率，必須使?jié)饪s膠與分離膠之間pH值有所區(qū)別。3.分子篩效應與電荷效應 進入分離膠后，Gly-成為快離子 分離膠只有電荷效應和分子篩效應，根據(jù)各蛋白質(zhì)所帶電荷不同、分子大小不同而分離PAGE特點1.具有分子篩效應，分辨率高2.樣品不易擴散，用量少，靈敏度可達10-6g3.化學性質(zhì)穩(wěn)定，分子結(jié)構(gòu)中富含酰胺基具有穩(wěn)定的親水基團4.凝膠不帶電荷，消除了電滲現(xiàn)象5.機械強度好，有彈性，在一定濃度范圍內(nèi)無色透明6.網(wǎng)孔可調(diào)節(jié) 4.SDSPAGE十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS,also called lauryl sulfate)是一種陰離子去污劑(anionic detergent )。 作用：破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其他物質(zhì)分子之間的非共價鍵，使蛋白質(zhì)變性(denature)而改變原有的構(gòu)象; 保證蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合而形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS復合物。原理（一）蛋白質(zhì)分子的解聚 樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小(molecular mass of polypeptides )，而電荷因素可以被忽略。1、SDS 陰離子去污劑(anionic detergent ) 變性劑(denaturant) 助溶性試劑 斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵(hydrogen bond) 分子去折疊 破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu)2、強還原劑 巰基乙醇（-mercaptoethanal） 二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT） 使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵(disulfide bond)斷裂。v SDS和還原劑的作用：（1）分子被解聚（2）氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負 電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。（3）蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負電荷大大超 過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除 了不同分子之間原有的電荷差異。去污劑的選擇無離子去污劑：Lubro W；Brij35， Tween Triton陽離子去污劑：cetyltrimethyl ammonium bromide （CTAB） cetylpyyridinium （CPC）陰離子去污劑：SDS deoxycholate電泳過程中的不正?，F(xiàn)象（1）“微笑”現(xiàn)象 指示劑前沿呈現(xiàn)兩邊向上的曲線形，說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好。2）“皺眉”現(xiàn)象 由于垂直電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全。（3）“拖尾”現(xiàn)象 樣品溶解不佳引起。（4）“紋理”現(xiàn)象由于樣品中的不溶顆粒引起的。（5）偏斜現(xiàn)象 電極放置不平行引起或加樣位置偏斜而引起（6）帶太寬 加樣量太多或加樣孔泄漏引起分子量測定1、相對遷移率（relative mobility ，Rf） Rf即用每個帶的遷移距離除以溴酚藍前沿的遷移距離得到的。 測量位置應在蛋白帶的中央。 蛋白帶遷移距離Rf= 溴酚藍遷移距離蛋白帶遷移距離 固定前的凝膠長度 Rf= X 干燥后的凝膠長度 溴酚藍遷移距離2、作圖 以已知蛋白質(zhì)分子量的常用對數(shù)值為縱坐標，Rf為橫坐標繪圖3、通過測定未知蛋白質(zhì)的Rf值，便可在標 準曲線上讀出他的分子量5.等電聚焦電泳Isoelectric Focusing Electrophoresis， IEFE 等電聚焦電泳(IEFE)是一種利用具有pH梯度的支持介質(zhì)分離等點電(PI)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。原理： 在電泳介質(zhì)中加入載體兩性電解質(zhì)，通電后，兩性電解質(zhì)會逐漸形成一個由正極到負極遞增的pH梯度，在此體系中，不同的蛋白質(zhì)移動并聚焦于與其等電點相當?shù)膒H位置。理想的載體兩性電解質(zhì)應具備的特征化學性質(zhì)穩(wěn)定；分子量要小以便與被分離大分子物質(zhì)分離；各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的緩沖能力梯度穩(wěn)定；兩性電解質(zhì)載體的數(shù)目要足夠多梯度平滑 ；對280nm的紫外光沒有或僅有很低的吸光度不影響測定。優(yōu)點： n 分辨率高（可達0.01pH單位）；n 靈敏