小鼠部分組織的石蠟切片制作.doc

小鼠部分組織的石蠟切片制作一、實驗原理：利用脫水劑除去組織中的水分，再用透明劑二甲苯可以去除脫水劑酒精，而二甲苯可以溶解石蠟并將其導(dǎo)入到已脫水的組織細胞中，然后用熔化的石蠟對組織進行包埋，冷卻后即可將柔軟的組織包埋在石蠟中，使其具有一定硬度，且不改變其大小和形狀。用旋轉(zhuǎn)切片機可將其切為極薄的薄片，經(jīng)染色、脫水、裝片后在顯微鏡下可以清晰地觀察其組織結(jié)構(gòu)。二、材料與用具1材料：小鼠肝臟、脾臟等。2用具：溶蠟箱、蠟杯、不同熔點的石蠟、酒精燈等。三、實驗內(nèi)容與步驟1取材及固定取小鼠，采用拉頸處死或麻醉處死法將其殺死，取其脾臟和肝臟，切為邊長約為0.5cm的組織塊。用先用0.85的生理鹽水漂洗以洗去血液與污漬，如果是管狀組織則必須把管腔中污物洗凈，可用注射器自一端向管腔中注射生理鹽水?dāng)?shù)次，使其管腔沖洗干凈，切忌不可用刀或其他器具刮之。由動物身上切取的組織必須是新鮮的，材料越新鮮越好，一般不應(yīng)超過死后24 hr。如果是管狀器官或是其中有分泌之消化液，則死后應(yīng)迅速采取，以免組織自溶或上皮剝落。取下的材料馬上進行固定，采用FAA固定液，固定液的用量與組織塊體積之比一般在20:1，固定時間2 hr以上，超過24hr時可繼續(xù)浸泡或轉(zhuǎn)入70%酒精中保存。不應(yīng)使組織塊貼于容器壁上，應(yīng)記錄固定液的名稱，材料的種類，動物品種及開始固定的時間。2沖洗固定后的組織塊在進行脫水前用70%酒精洗去固定液。3脫水和硬化經(jīng)過固定后的組織在水洗后要進行脫水，脫水的目的將組織內(nèi)的水分用酒精或其他溶劑置換出來，使組織逐漸變硬，便于油類或其他透明及浸入，為熔化的石蠟浸滲到組織中創(chuàng)造條件。常用的脫水劑是不同濃度的酒精，因為酒精與水有很大的親和力，酒精濃度可以逐漸升高，置換出組織中的水。脫水必須充分，脫水不充分會影響透明和浸蠟。脫水過程要逐級上升，不能操之過急，跳級脫水會引起組織塊強烈的收縮變形。脫水所用的酒精濃度及過程如下：305070809095100()100()組織塊在各級較低濃酒精（小于70）中脫水的時間應(yīng)視組織塊的大小而定，大小不超過0.5立方厘米的組織塊脫水時間為612 hr，在高濃度酒精中（大于70）脫水時間為3 hr左右。組織塊在無水酒精中需經(jīng)過兩次處理，以保證脫凈水分。由于無水酒精有使組織變脆的缺點，故在無水酒精中脫水的時間不宜過長，一般應(yīng)在1530 min左右。在脫水瓶中酒精的量與組織塊之比約為50:1。簡化步驟如下：70%（一夜）80%（1 hr）90%（30分）95%（30分）100%（15分） 酒精+ 二甲苯（15分）二甲苯（3分） 石蠟+ 二甲苯（30分）石蠟（80分）4透明透明是石蠟切片法切片前必經(jīng)的一步。其目的在于用礦物油或植物油等透明劑置換出無水酒精，以便于熔化的石蠟浸滲到組織間隙中，故透明劑必須是能分別與石蠟和酒精相溶的。經(jīng)過透明劑處理的組織塊用肉眼對光觀察呈透明現(xiàn)象，所以這個過程稱為透明。常用的透明劑有二甲苯、苯、甲苯等，這些都是穿透力強易使組織變脆的透明劑，因此透明的時間宜短，一般在20 min即可。透明時組織塊由無水酒精中取出，先放入二甲苯和無水酒精等量混合的溶劑中1 hr左右，然后取出放入純二甲苯中20 min即可。5浸滲浸滲過程是使包埋組織用的物質(zhì)深入到所有的組織間隙中，然后再通過各種方法使這種物質(zhì)凝固，而將組織材料包埋其中。石蠟切片法和火棉膠切片法都需要浸滲過程。石蠟切片法是將加熱的石蠟滲到組織中而火棉膠切片法是使火棉膠滲到組織間隙中去。在浸滲前要先將選好的石蠟分別以容器裝好放在恒溫箱中，使其雜質(zhì)沉淀。石蠟最好選用軟蠟和硬蠟兩種，軟蠟熔點為4550之間，硬蠟熔點為5658之間，6062的硬蠟很少用。冬天室溫較低時多用軟蠟，夏天室溫較高時多用硬蠟。浸滲應(yīng)在自動恒溫箱中進行。組織塊在各個蠟杯中浸蠟的時間如下：軟蠟1 30min軟蠟2 30min硬蠟1 3060min硬蠟2 60120min這一時間不是固定不變的，應(yīng)視組織塊的種類及大小而相應(yīng)延長或縮短浸蠟時間。浸蠟的總時間一般為：0.5立方厘米的組織塊時間為68 hr；0.20.3立方厘米的組織塊時間為35 hr；0.10.2立方厘米的組織塊時間為23 hr。當(dāng)發(fā)現(xiàn)蠟杯中有灰塵或組織碎塊時應(yīng)使其沉淀或過濾后再使用。浸蠟不透包埋后會出現(xiàn)白色不透明部分，此時需要在浸蠟一次。6包埋包埋就是將已經(jīng)浸滲好的組織塊包埋于浸滲劑中，石蠟包埋法如下。浸蠟終了時，將預(yù)先預(yù)熱好的和第四杯石蠟相同熔點的石蠟倒入折好的蠟槽內(nèi)，然后從第四個蠟杯中取出組織塊，放入蠟槽內(nèi)，擺好位置，注意組織切面的擺放方向。放好組織后可以自然冷卻，也可以放入冷水中直接冷卻。7修塊和切片取已經(jīng)包埋好的蠟塊，將紙盒拆下，用加熱的刀片或解剖刀將其分成若干塊（每塊組織占一塊），用解剖刀將組織塊周圍多余的石蠟切去，注意不要切到組織。把有組織的蠟塊修成正方形或梯形。在進行塑型時一定要注意組織塊切面的方向。蠟塊塑好后將其粘在小木塊上。注意要粘牢。最后在木塊側(cè)面用鉛筆記上組織塊名稱、編號。切片時采用手搖連續(xù)切片機。使用切片機進行切片時，將蠟塊固定在切片機上，調(diào)好距離和所要求的切片厚度，然后用右手搖動手柄，即可進行切片了。一般來講生物切片的厚度在510微米。對于切下的切片不要用手去取，因為體溫可以使蠟片粘到手上，正確的做法是用毛筆或牙簽挑取，然后放在載玻片上進行展片和粘片。8展片和粘片切下的組織蠟片往往帶有皺褶，所以在染色前必須進行蠟片的展片和粘片，即把切好的蠟片平整的粘在載玻片上。展片的溫度因石蠟熔點的不同而的不同，一般的5658的石蠟切片的溫水進行展片，4852的石蠟切片用35的溫水進行展片。等到蠟片充分展平后，取一清潔載玻片，載玻片上涂一薄層蛋白甘油，然后在水中撈取蠟片，撈完后將蠟片擺正，放到格盤內(nèi)，置38溫箱中烘干，然后即可進行染色。展片和粘片比較簡單容易做，但是如果處理不好則無法進行染色，即使能染上色，組織切片內(nèi)部的結(jié)構(gòu)也往往被破壞。9染色和封固采用蘇木精伊紅對染法（HE）染色結(jié)果是細胞核為紫色，細胞質(zhì)為粉紅色；蘇木精伊紅染色法整個染色過程如下：取已經(jīng)干燥的切片，放于盛有二甲苯的染缸內(nèi)脫蠟10min左右，這個過程稱為脫蠟。脫完蠟后的切片即可進行染色，具體染色過程和時間如下：（1）100酒精洗去二甲苯25min。（2）95酒精25min。（3）90酒精25min。（4）80酒精25min。（5）70酒精25min。（6）50酒精25min。（7）蒸餾水洗25min。（8）蘇木精染液1020min。（9）普通水洗1min。（10）鹽酸酒精分色數(shù)秒半 min（70酒精100 mL鹽酸1 mL），分色到切片為帶粉紅色后立即取出。（11）自來水沖洗數(shù) hr。鏡檢切片呈清朗的藍色，細胞核非常明顯。（12）蒸餾水洗1min。（13）50酒精25min。（14）70酒精25min。（15）80酒精25min。（16）伊紅酒精溶液對比染色25min（95酒精0.5g伊紅）。（17）95酒精25min。（18）無水酒精3min。（19）無水酒精3min。（20）無水酒精加等量二甲苯2min。（21）二甲苯數(shù) min到透明為止。（22）自二甲苯中取出切片，放在格板內(nèi)，滴少量的樹膠于組織片中央。（23）取一蓋玻片，輕輕以蓋玻片的一邊接近載玻片，然后迅速放下蓋玻片，樹膠即迅速擴張到四周，校正好蓋玻片方向