蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)及發(fā)展文獻(xiàn)綜述.doc

蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)及發(fā)展文獻(xiàn)綜述蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)及發(fā)展文獻(xiàn)綜述 張粒 植物學(xué) 21107016 1 概念及相關(guān)內(nèi)容 1994年澳大利亞Macquaie大學(xué)的Wilkins和Williams等在意大利的一次科學(xué)會議上首次提出了蛋白質(zhì)組proteome這個概念該英文詞匯由蛋白質(zhì)的“prote”和基因組的“ome”拼接而成并且最初定義為“一個基因組所表達(dá)的蛋白質(zhì)”1。然而這個定義并沒有考慮到蛋白質(zhì)組是動態(tài)的而且產(chǎn)生蛋白的細(xì)胞、組織或生物體容易受它們所處環(huán)境的影響。目前認(rèn)為蛋白質(zhì)組是一個已知的細(xì)胞在某一特定時刻的包括所有亞型和修飾的全部蛋白質(zhì)2。蛋白質(zhì)組學(xué)就是從整體角度分析細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系提示蛋白質(zhì)的功能與細(xì)胞的活動規(guī)律。 2 蛋白質(zhì)組學(xué)的分類 蛋白質(zhì)組學(xué)從其研究目標(biāo)方面可分為表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)。前者主要研 究細(xì)胞或組織在不同條件或狀態(tài)下蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能這將有助于識別各種特異蛋白3目前蛋白質(zhì)組學(xué)的研究在這方面開展的最為廣泛其運(yùn)用技術(shù)主要是雙相凝膠電泳Two-dimensional gel electrophoresis2DE技術(shù)以及圖像分析系統(tǒng) 當(dāng)對感興趣的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析時可能用到質(zhì)譜。由于蛋白質(zhì)發(fā)生修飾后其電泳特性將發(fā)生改變這些技術(shù)可以直接測定蛋白質(zhì)的含量并有助于發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)翻譯后的修飾如糖基化和磷酸化等4 。 結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)的目標(biāo)是識別蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并研究蛋白質(zhì)間的相互作用。近年來酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白質(zhì)相互作用時常用的方法同時研究者也將此方法不斷改進(jìn)5。有研究者最近發(fā)現(xiàn)在研究蛋白質(zhì)相互作用時通過純化蛋白復(fù)合物并用質(zhì)譜進(jìn)行識別是很有價值的4。 3 蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù) 目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究在表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究最為廣泛其分析通常有三個步驟第一步運(yùn)用蛋白質(zhì)分離技術(shù)分離樣品中的蛋白質(zhì)第二步應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)或N末端測序鑒定分離到的蛋白質(zhì)第三步應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)存儲、處理、比較獲得的數(shù)據(jù)。 3.1 蛋白質(zhì)分離技術(shù) 這類技術(shù)主要是電泳其中應(yīng)用最多的是雙向電泳技術(shù)其他還有SDS-PAGE、毛細(xì)吸管電泳等。除了電泳外還有液相色譜通常使用高效液相色譜HPLC和二維液相色譜2D-LC。 另外還有用于蛋白純化、除雜的層析技術(shù)、超離技術(shù)等。 3.1.1雙相凝膠電泳 雙相凝膠電泳two-dimensional gel electrophoresis2DE這是最經(jīng)典、最成熟的蛋白質(zhì)組分離技術(shù)產(chǎn)生于20世紀(jì)70年代中葉但主要的技術(shù)進(jìn)步如實驗的重復(fù)性、可操作性蛋白質(zhì)的溶解性、特異性等是在近lO年取得的。它根據(jù)蛋白質(zhì)不同的特點分兩相分離蛋白質(zhì)。第一相是等電聚焦IEF電泳根據(jù)蛋白質(zhì)等電點的不同進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)是兩性分子根據(jù)其周圍環(huán)境pH可以帶正電荷、負(fù)電荷或靜電荷為零。等電點pI是蛋白質(zhì)所帶靜電荷為零時的pH周圍pH小于其pI時蛋白質(zhì)帶正電荷大于其pI時蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷。IEF時蛋白質(zhì)處于一個pH梯度中在電場的作用下蛋白質(zhì)將移向其靜電荷為零的點靜電荷為正的蛋白將移向負(fù)極靜電荷為負(fù)的將移向正極直到到達(dá)其等電點如果蛋白質(zhì)在其等電點附近擴(kuò)散那么它將帶上電荷重新移回等電點。這就是IEF的聚焦效應(yīng)它可以在等電點附近濃集蛋白從而分離電荷差別極微的蛋白。 pH梯度的形成最初是在一個細(xì)的包含兩性電解質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠管中進(jìn)行。在電流的作用下兩性電解質(zhì)可形成一個pH梯度。但由于兩性電解質(zhì)形成的pH梯度不穩(wěn)定、易漂移、重復(fù)性差80年代以后研究人員研制了固定pH梯度的膠條IPG。此種膠條的形成需要一些能與丙烯酰胺單體結(jié)合的分子每個含有一種酸性或堿性緩沖基團(tuán)。制作時將一種含有不同酸性基團(tuán)的此分子溶液和一種含有不同堿性基團(tuán)的此分子溶液混合兩種溶液中均含有丙烯酰胺單體和催化劑不同分子的濃度決定pH的范圍。聚合時丙烯酰胺成分與雙丙烯酰胺聚合形成聚丙烯酰胺凝膠。 第二相是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量不同進(jìn)行分離。此相是在包含SDS的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行。SDS是一種陰離子去污劑它能纏繞在多肽骨架上使蛋白質(zhì)帶負(fù)電所帶電荷與蛋白質(zhì)的分子量成正比在SDS聚丙烯酰胺凝膠中蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)與它在膠中移動的距離基本成線性關(guān)系。SDS-PAGE裝置有水平和垂直兩種形式垂直裝置可同時跑多塊膠如Amersham pharmacia Biotech的Ettan DALT II 系統(tǒng)可同時跑12塊膠提高了操作的平行性。 經(jīng)過2DE以后二維平面上每一個點一般代表了一種蛋白這樣成千種不同的蛋白即可被分離有關(guān)蛋白質(zhì)的等電點、分子量及每種蛋白的數(shù)量信息也可以得到。 蛋白質(zhì)組學(xué)分析對2DE后的染色技術(shù)要求很高除了標(biāo)準(zhǔn)的敏感性要求外還要求染色技術(shù)的線性和均一性6。目前有多種染色方法如考馬斯亮藍(lán)染色、銀染色、及熒光染色等。銀染比考馬斯亮藍(lán)染色靈敏度高已有學(xué)者對這兩種方法進(jìn)行了比較如PhillipCash等在 檢測肺炎鏈球菌紅霉素敏感株和抵抗株表達(dá)的蛋白時用考馬斯亮藍(lán)G-250染色發(fā)現(xiàn)了200多種蛋白PI 4-7分子量15000-110000在相同的PI和分子量范圍下用銀染檢測到360多種蛋白7。但是銀染的線性效果并不是很好并且對質(zhì)譜分析干擾大?？捡R斯亮藍(lán)染色線性、均一性較高 對質(zhì)譜干擾較小 但其敏感性較低。較理想的是熒光染色Thierrry Rabilloud等比較了兩種熒光劑RuBps和Sypro Ruby的效果發(fā)現(xiàn)其敏感性、線性都很好對質(zhì)譜干擾小6但其成本較高。實驗時可以根據(jù)不同的目的選用不同的方法。 2DE圖像所產(chǎn)生的大量蛋白質(zhì)點是單純用肉眼分析無法完成。目前有多種圖像分析軟件可用于膠的圖像分析如MelanieII BioRad PD Quest BioRad Phoretix 2D Full又稱2D Image Master Elite Amersham Pharmacia Biotech 等這些軟件可以完成蛋白質(zhì)點的識別、匹配等具有很強(qiáng)的分析功能但其缺點是需要很多的圖像手工校對一般分析一個圖像需要8-10h。 2DE是目前唯一的一種能溶解大量蛋白質(zhì)并進(jìn)行定量的方法具有高通量、重復(fù)性好、敏感性較高等優(yōu)點8。它能同時分離和定量數(shù)千種甚至上萬種蛋白8。它的分辨率極高等電聚焦相可以區(qū)分PI相差0.1的蛋白質(zhì)SDS-PAGE相可以區(qū)分分子量相差1kD的蛋白質(zhì)9。 其缺點是由于蛋白表達(dá)水平的差異較大一些低豐度的蛋白不易檢測810。另外某些基因的表達(dá)產(chǎn)物在2D膠中呈多點或不同基因的表達(dá)產(chǎn)物共點使2D膠數(shù)據(jù)的比較、定量更加復(fù)雜8。2DE分離的蛋白數(shù)量受諸多因素影響疏水性的膜蛋白往往是藥物設(shè)計最好的靶點很難用此法分離同時染色技術(shù)的靈敏度和線性范圍不足以呈現(xiàn)所有分離的蛋白質(zhì)。目前人們采用多種方法來減少這些缺點如通過增加上樣量分離低豐度蛋白應(yīng)用窄范圍固定pH梯度膠條、蛋白層析等技術(shù)提高分離的蛋白數(shù)目應(yīng)用熒光染色提高檢測靈敏度等。 3.1.2雙向熒光差異電泳 雙向熒光差異電泳twodimensional difference gel electrophoresis2DDlGE 2DDIGE分析系統(tǒng)是在傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合了多重?zé)晒夥治龅姆椒ㄔ谕粔K膠上共同分離多個分別由不同熒光標(biāo)記的樣品并第一次引入了內(nèi)標(biāo)的概念極大地提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和重復(fù)性。在DIGE技術(shù)中每個蛋白點都有它自己的內(nèi)標(biāo)且軟件自動根據(jù)每個蛋白點的內(nèi)標(biāo)對其表達(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn)這樣可以很好地去除樣品的假陽性差異點。DIGE技術(shù)可檢測到表達(dá)差異小于10的蛋白統(tǒng)計學(xué)可信度達(dá)到95以上。利用Ettan DIGE技術(shù)還可以對微量少到5g樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。2D-DIGE的具體操作過程與常規(guī)2DE的步驟相似所不同的就是在樣品制備時在每份樣品中預(yù)先分別加入不同的熒光染料并且需要制作一個供其他樣品比較的內(nèi)參另外在電泳后的凝膠顯色時需要在特殊的熒光檢測 儀中進(jìn)行。 3.1.3液相色譜 高效液相色譜因具有分離效率高、分析速度快、檢測靈敏度高和應(yīng)用范圍廣等特點廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實踐中。高效液相色譜是利用高壓輸液泵驅(qū)使帶有樣品的流動相通過裝填固定相的色譜柱利用固液相之間的分配機(jī)理對混合物樣品溶液進(jìn)行分離的方法。例如對奶粉中三聚氰胺的檢測11。二維或多維液相色譜是將分離機(jī)理不同而又相互獨立的兩支色譜柱串聯(lián)起來構(gòu)成的分離系統(tǒng)。樣品經(jīng)過第一維的色譜柱進(jìn)入接口中通過濃縮、捕集或切割后被切換進(jìn)入第二維色譜柱及檢測器。二維液相色譜通常采用兩種不同的分離機(jī)理分析樣品即利用樣品的不同特性把復(fù)雜混合物如肽分成單一組分這些特性包括分子尺寸、等電點、親水性、電荷、特殊分子間作用親和等。在一維分離系統(tǒng)中不能完全分離的組分可能在二維系統(tǒng)中得到更好的分離分離能力、分辨率得到極大的提高。完全正交的二維液相色譜峰容量是兩種一維分離模式單獨運(yùn)行時峰容量的乘積。 3.2目的蛋白點的篩選 對目的蛋白的篩選通常與雙向電泳連用主要用來分析凝膠中分離出的蛋白質(zhì)樣品采用的主要技術(shù)手段通常是Western印跡和差異蛋白比較分析。Western印跡主要是將雙向電泳后的凝膠不經(jīng)過染色而直接轉(zhuǎn)印到固相支持物如NC膜、PVDF膜等上再在膜上進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)從而篩選出與免疫功能相關(guān)的蛋白差異蛋白比較分析則是先對凝膠進(jìn)行染色然后應(yīng)用軟件如Image Master、PDQuest等對存在差異的2組凝膠進(jìn)行比較從而找出差異的蛋白。在比較時通常要求每個被分析的樣品重復(fù)3次然后先做組內(nèi)比較再做組間比較。 3.3蛋白質(zhì)鑒定技術(shù) 對2DE所產(chǎn)生的上千個蛋白用傳統(tǒng)的方法如Edman降解法等進(jìn)行分析將是一個很艱巨的任務(wù)。質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展解決了這一難題。 3.3.1一級質(zhì)譜 質(zhì)譜技術(shù)的高速發(fā)展目前可以快速、高效地對目的蛋白進(jìn)行鑒定且樣品用量少通常達(dá)到微克級。除此之外質(zhì)譜技術(shù)還可以對蛋白質(zhì)翻譯后修飾進(jìn)行分析。根據(jù)離子源的不同質(zhì)譜主要包括基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜MALDITOFMS、電噴射離子井飛行時間質(zhì)譜ESITOFMS。常用的質(zhì)譜分析儀除了飛行時間TOF外還有四級桿Q、離子井而在串聯(lián)質(zhì)譜中通常使用的是QTOF或TOFTOF等。 2種離子源都可以使肽段、蛋白、藥物的代謝產(chǎn)物、寡核苷酸等其他碳水化合物離子化進(jìn)而被質(zhì)譜儀分析。通常的質(zhì)譜儀一般由樣品槽、離子源、分析儀和檢測器組成。 由于單一地依靠蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量并不能對目的蛋白進(jìn)行理想的鑒定因此須事先用蛋白酶如胰蛋白酶將檢測樣品酶解成不同長度的肽段。在MALDITOF質(zhì)譜中還需要向樣品中加入基質(zhì)以促使樣品離子化離子化的確切基質(zhì)目前還不清楚然后在離子源的作用激光激發(fā)下使樣品變?yōu)闅庀嚯x子。這些被激發(fā)的氣相離子進(jìn)入質(zhì)量分析儀根據(jù)其荷質(zhì)比而把肽段進(jìn)行區(qū)分。質(zhì)譜的整個過程都是在真空條件下進(jìn)行的。ESI則不需要基質(zhì)輔助而是使用具有一定能量的電子直接作用于樣品分子使其電離。 3.3.2二級質(zhì)譜 二級質(zhì)譜同時將2個上述質(zhì)譜連接在一起構(gòu)成的串聯(lián)質(zhì)譜可以更精確、更靈敏地分析蛋白樣品。二級質(zhì)譜的使用使得質(zhì)譜不僅可檢測肽段的相對分子質(zhì)量還可以檢測它的氨基酸序列。利用質(zhì)譜儀的第一個分析儀對蛋白樣品進(jìn)行初步檢測從樣品混合中選擇特定的肽段再將這個特定的肽段與惰性氣體如氮氣、氬氣等碰撞從而將肽段進(jìn)一步離解。在被選擇的肽段與惰性氣體發(fā)生能量碰撞時支持蛋白主鏈構(gòu)象的化學(xué)鍵受到破壞碰撞后的結(jié)果再被第二級質(zhì)譜分析儀分析。串聯(lián)質(zhì)譜又叫碎片譜或MSMS譜。在二級質(zhì)譜中可以將差別只有1個氨基酸的相鄰肽段區(qū)分開。因此通過分析臨近峰的相對分子質(zhì)量可以檢測肽段的氨基酸序列舊。 3.3.3肽質(zhì)量指紋圖譜 肽質(zhì)量指紋圖譜peptide InasfingerprintingPMF 當(dāng)被離子化的肽段經(jīng)過質(zhì)譜儀時這些肽段因其相對分子質(zhì)量的不同而被分離因此產(chǎn)生了含有不同峰值的肽質(zhì)量指紋圖譜。蛋白質(zhì)鑒定便是通過對PMF的分析實現(xiàn)的即將所得到的PMF與已知數(shù)據(jù)庫中一個蛋白的理論期望蛋白酶肽段進(jìn)行比較可以得到一個匹配程度得分當(dāng)這個得分高于理論計算的得分時便認(rèn)為該蛋白是理論中的蛋白。這些已知數(shù)據(jù)庫在互聯(lián)網(wǎng)上有很多其中NCBI和EBI的數(shù)據(jù)庫是最大的而且是免費(fèi)的。在搜索這些數(shù)據(jù)庫時需要使用搜索軟件如Mascot、PepSea、PeptideSearch等其中Mascot是最常用的軟件。最近開發(fā)了一個新的程序Paragon該程序克服了Mascot被動的、概率的、估計的搜索模式所帶來的缺點被認(rèn)為是Mascot的替代者舊。 質(zhì)譜技術(shù)能清楚地鑒定蛋白質(zhì)并能準(zhǔn)確地測量肽和蛋白質(zhì)的分子量、氨基酸序列及翻譯后的修飾。目前MS/MS是唯一能夠迅速測序N末端封閉或共價修飾肽段的方法12。質(zhì)譜技術(shù)很靈活能與多種蛋白分離、捕獲技術(shù)聯(lián)用對普通的緩沖液成分相對耐受12能快速鑒定大量蛋白質(zhì)點而且很靈敏10在一些情況下僅需10-15 fmol的蛋白10139 這在只能得到極少量蛋白的情況下鑒別蛋白是很有用的。在實際工作中可將幾種技術(shù)結(jié)合應(yīng)用如串聯(lián)質(zhì) 譜與Edeman微測序技術(shù)相結(jié)合12MALDI質(zhì)譜與納米電子噴射質(zhì)譜相結(jié)合14這些技術(shù)相互互補(bǔ)為分析2DE所分離的大量蛋白質(zhì)提供了有效的手段。 質(zhì)譜技術(shù)是一項強(qiáng)大的分離分析技術(shù)但它只能分離氣體狀態(tài)的帶電分子而且一次只能分析帶正電或帶負(fù)電的分析物。質(zhì)譜分析很難區(qū)分兩種同源性極高的蛋白。由于質(zhì)譜分析只是描述蛋白的少量多肽因此可能把刪節(jié)的蛋白當(dāng)成是原來的蛋白。通常只適用于象酵母等基因組序列已知的個體。 3.4酵母雙雜交技術(shù) 酵母雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的modular 即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成 其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域DNA binding domain 簡稱為DB和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域activation domain 簡稱為AD 它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。 單獨的DB雖然能和啟動子結(jié)合 但是不能激活轉(zhuǎn)錄而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白具有激活轉(zhuǎn)錄的功能。DB與AB分別能與多肽X和Y結(jié)合由DB和AD形成的融合蛋白現(xiàn)在一般分別稱之為“誘餌”bait和“獵物”或靶蛋白prey or target protein。 如果在X和Y之間存在相互作用 那么分別位于這兩個融合蛋白上的DB和AD就能形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子 從而激活相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。這個被激活的、能顯示“誘餌”和“獵物”相互作用的基因稱之為報道基因reporter gene。 通過對報道基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測 反過來可判別作為“誘餌”和“獵物”的兩個蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用15。用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用通常會存在假陽性或假陰性的問題已有許多學(xué)者對此系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)并且將其擴(kuò)展到檢測DNA-蛋白質(zhì)RNA-蛋白質(zhì)小分子-蛋白質(zhì)之間的相互作用上16。 3.5蛋白質(zhì)樣品的生物信息學(xué)分析 分子生物學(xué)的發(fā)展把生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)追溯到核酸和蛋白質(zhì)兩大類生物大分子它們構(gòu)成了生物數(shù)據(jù)的主要部分。關(guān)于這些生物大分子的結(jié)構(gòu)、相互作用和功能的研究也產(chǎn)生著大量數(shù)據(jù)。 3.5.1蛋白功能的預(yù)測 蛋白功能的預(yù)測可以通過3條途徑實現(xiàn)。首先通過與已知蛋白質(zhì)序列相比較來檢測蛋白的功能。此外蛋白質(zhì)的一些其他性質(zhì)可以直接由序列分析得到。比較常用的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫是SwissProt、P1R和NCBI的Blast其次可以通過蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)的預(yù)測。蛋白質(zhì) 的一些功能特征可以通過蛋白序列直接推算出來通過組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸的物理和化學(xué)性質(zhì)分析已知或未知蛋白質(zhì)的性質(zhì)如等電點相對分子質(zhì)量、疏水性、跨膜螺旋、卷曲螺旋及信號肽等。除了上述2種方法外還可以與保守的基序和圖形數(shù)據(jù)庫比較判斷功能。對于那些與數(shù)據(jù)庫中已知功能蛋白質(zhì)無同源性的序列或找到同源性的蛋白質(zhì)功能為未知時我們可與保守的基序比較來判斷其功能。基序數(shù)據(jù)庫中最為常用的是網(wǎng)站Prosite。 3.5.2蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測 雖然有時蛋白質(zhì)的序列相似但是卻執(zhí)行著不同的功能或同源基因編碼的蛋白質(zhì)雖然序列差別很大但是對于生物體來說執(zhí)行的卻是同樣的功能。這主要是因為蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)揮了作用。在PDB等數(shù)據(jù)庫中可以檢索到一些蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的同源性。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的基本依據(jù)是每一段相鄰的氨基酸殘基具有形成一定二級結(jié)構(gòu)的傾向。因此進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測需要通過統(tǒng)計和分析發(fā)現(xiàn)這些傾向或者規(guī)律。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的方法有3種。一是由已知結(jié)構(gòu)統(tǒng)計各種氨基酸殘基形成二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象趨勢其中最常用的是Chou和Fasman法二是基于氨基酸的物理化學(xué)性質(zhì)包括堆積性、疏水性、電荷性、氫鍵形成能力等三是通過序列比對由已知三維結(jié)構(gòu)的同源蛋白推斷未知蛋白的二級結(jié)構(gòu)。一般對于螺旋預(yù)測精度較好對折疊差些而對除螺旋和折疊等之外的無規(guī)則二級結(jié)構(gòu)則效果很差。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測是最復(fù)雜和最困難的預(yù)測技術(shù)。序列差異較大的蛋白質(zhì)序列也可能折疊成類似的三維構(gòu)象。由于蛋白質(zhì)的折疊過程并不十分清晰從理論上解決蛋白質(zhì)折疊的問題還有待進(jìn)一步的科學(xué)發(fā)展但也有一些有一定作用的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測方法如與已知結(jié)構(gòu)的序列比較、同源模建、threading算法和折疊識別方法。 盡管生物信息學(xué)發(fā)展迅猛但是它仍然不能承載所有的研究信息。雖然通過在生物數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站內(nèi)檢索可以得到一定的分析結(jié)果但這個分析結(jié)果可能并不完整比如細(xì)菌中的有些蛋白不僅對于機(jī)體來說發(fā)揮正常代謝的功能而且該蛋白還具有一定的致病性而后者基本上無法通過生物信息學(xué)網(wǎng)站分析得到這就需要閱讀大量的文獻(xiàn)以獲得更完整的信息。 4 蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用 蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用為醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等研究領(lǐng)域提供了新的思路并且?guī)砹溯^為豐碩的結(jié)果。目前在原核生物、真核生物以及多細(xì)胞生物體研究中都有廣泛應(yīng)用。如對霍亂弧菌17以及大腸桿菌18在不同酸堿條件下蛋白表達(dá)的變化的研究表明這些病原菌會隨環(huán)境的改變而調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)以使其達(dá)到最大的致病能力。在真核生物研究方面Michel Perrot等用2DE及質(zhì)譜、免疫雜交、微量測序等方法分離和鑒定了釀酒酵母的401種蛋白309種以 前曾報道過剩余的92種是新發(fā)現(xiàn)的從而拓展了酵母參考圖譜為研究細(xì)胞功能、酵母翻譯因子靶點提供了條件10。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)還可能實現(xiàn)癌癥的早期診斷120l。在致病微生物方面同樣碩果累累。蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用可以實現(xiàn)高通量、高效率地對樣品進(jìn)行分析并可以同時得到多個重要的研究結(jié)果。 5 存在的不足 盡管蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用前景廣闊、研究成果豐碩但仍然存在許多不足。如2DE的靈敏度雖然已達(dá)fmol水平但仍難將細(xì)胞組織內(nèi)多種痕量調(diào)控蛋白分離顯示出來而此類蛋白對于基礎(chǔ)與應(yīng)用研究都極為重要甚至比高含量結(jié)構(gòu)蛋白更為重要。此外現(xiàn)有質(zhì)譜技術(shù)雖然在蛋白質(zhì)組成分的鑒定中高效、靈敏、特異但儀器價格十分昂貴因此技術(shù)推廣受到很大的限制。還有現(xiàn)今的蛋白質(zhì)組研究仍局限于對已完成基因組計劃的理論預(yù)測的蛋白質(zhì)組進(jìn)行實證分析閉。未來的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)該擺脫基因組學(xué)的束縛在真正意義上實現(xiàn)蛋白質(zhì)的體外合成、體外加工與修飾以及簡單方便的蛋白測序與鑒定等。 6 展望 目前有約60種微