趙曉妮細(xì)胞培養(yǎng)論文.doc

動(dòng)物胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)摘要：1885年，W Rou嘗試使組織離體培養(yǎng)，被認(rèn)為是組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的萌芽；1907年Harrison和1912年Carrel開始把組織培養(yǎng)作為一種方法，用于研究離體動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)，標(biāo)志著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（Cell culture technology）的誕生。此后，隨著抗生素、培養(yǎng)基、培養(yǎng)裝置以及工藝方法的不斷改進(jìn)，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)（Animal cell culture）的研究和應(yīng)用逐步增多和深入，發(fā)展至今已成為在生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法。利用細(xì)胞培養(yǎng)開展體外試驗(yàn)，成為了闡釋生命現(xiàn)象、發(fā)病機(jī)理和篩選藥物的重要手段；利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合細(xì)胞融合（Cell fusion）、細(xì)胞雜交（Cell hybridization）以及轉(zhuǎn)基因（Trans-gene）技術(shù)進(jìn)行基因重組、組織構(gòu)建是遺傳和組織工程的重要工具；利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有醫(yī)用價(jià)值的酶、生長因子、疫苗和單克隆抗體等，已成為醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要部分。1干細(xì)胞最早出現(xiàn)于19世紀(jì)的文獻(xiàn)中。1896年，Wilson在一篇論述細(xì)胞生物學(xué)的文獻(xiàn)中首次使用干細(xì)胞這一概念，專門用于描述寄生蟲（線蟲、蠕蟲）生殖系的祖細(xì)胞。1897年，Boveri等在進(jìn)行絲蟲研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過連續(xù)的卵裂之后，只有一個(gè)細(xì)胞保留了全部的染色體，這一細(xì)胞包含有成體生殖細(xì)胞的全部成分。但到目前為止，干細(xì)胞仍然是一個(gè)廣義的概念，但現(xiàn)代干細(xì)胞的概念與早期干細(xì)胞相比，已經(jīng)賦予了新的內(nèi)涵，認(rèn)為干細(xì)胞的最基本特征是具有自我更新能力和分化為成熟細(xì)胞的潛能。1962年Edwards首先觀察到兔胚泡ES細(xì)胞的分化現(xiàn)象。之后，科學(xué)工作者對ES細(xì)胞進(jìn)行了深入的研究，取得了諸多突破性的進(jìn)展。2003年，韓國和美國科學(xué)家聯(lián)手，利用體細(xì)胞克隆技術(shù)獲得人類克隆胚胎干細(xì)胞，這一技術(shù)的成功表明可以用任何人的自體細(xì)胞培育ES細(xì)胞，從而使ES細(xì)胞向臨床應(yīng)用邁進(jìn)了一大步。2004年，日本科學(xué)家在體外將小鼠的ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化為精子和卵子細(xì)胞，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)ES細(xì)胞具有向生殖細(xì)胞分化的潛能。最近還有科學(xué)家利用孤雌繁殖法（卵細(xì)胞體外激活培養(yǎng)）培養(yǎng)出早期胚胎，預(yù)示人類的自然生殖面臨新的課題。3關(guān)鍵詞：胚胎干細(xì)胞；來源；特點(diǎn)；培養(yǎng)；保存；復(fù)蘇；前沿；進(jìn)展1、胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）的生物學(xué)特性 3 1.1 ES細(xì)胞的來源 ES細(xì)胞是來源于特定解剖部位的細(xì)胞，包括：胚胎瘤干細(xì)胞、由著床前胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離建系而來的胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞（由早期胚胎原始生殖嵴細(xì)胞分離建系而來）。1.2 ES細(xì)胞的基本特點(diǎn)4 具有經(jīng)培養(yǎng)不定期地分化并產(chǎn)生特化細(xì)胞的能力，具有以下特點(diǎn)：有多向分化潛能和受精卵的某些特性，可以分化為胎兒和成體內(nèi)各種類型的組織細(xì)胞；可在體外培養(yǎng)的條件下建立穩(wěn)定的細(xì)胞系，可長期增殖培養(yǎng)、凍存并保持高度未分化狀態(tài)和發(fā)育潛能性；將ES細(xì)胞與8-16階段的胚胎共培養(yǎng)后，植入假孕母體子宮，可發(fā)育成嵌合動(dòng)物，其遺傳特性可進(jìn)入胚系，遺傳給下一代；對組織損傷產(chǎn)生反應(yīng)，可遷徙、增殖分化并參與修復(fù)過程。體外ES細(xì)胞具有培養(yǎng)細(xì)胞的特征，最大特點(diǎn)是可對它進(jìn)行遺傳改造、核轉(zhuǎn)移和凍存等而不失去潛能性。1.3 ES細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn) ES細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與早期胚胎細(xì)胞具有相似性，細(xì)胞相對較小，細(xì)胞核明顯，核質(zhì)比較高，染色質(zhì)比較分散，有一個(gè)或多個(gè)核仁，胞質(zhì)內(nèi)除游離核糖體外，其他細(xì)胞器很少；細(xì)胞呈多層集落狀生長，緊密堆積在一起，無明顯的界限，形似鳥巢。人和靈長類動(dòng)物的ES細(xì)胞形成的細(xì)胞集落相對扁平、松散，容易被胰蛋白酶消化成單細(xì)胞。而小鼠的ES細(xì)胞和人的EG細(xì)胞形成的集落一般呈緊密的球形，不易被常規(guī)的消化方法消化成單個(gè)細(xì)胞。 1.4 ES細(xì)胞的分子生物學(xué)標(biāo)志 堿性磷酸酶、胚胎階段特異性表面抗原（SSEA）、端粒酶、Oct-4/Oct-3、干細(xì)胞因子和生殖細(xì)胞核因子等。2、干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)條件與設(shè)備5 干細(xì)胞制備培養(yǎng)技術(shù)是一種無菌操作技術(shù)，要求實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和條件必須保證無微生物污染，不受其他有害因素的影響，并且是符合操作全過程質(zhì)量控制可追溯性的要求，才能成為臨床生物治療應(yīng)用技術(shù)平臺(tái)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室設(shè)立必須符合國家藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范和GMP要求，應(yīng)當(dāng)遵循科學(xué)、安全、規(guī)范、有效、經(jīng)濟(jì)、符合倫理的原則。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室還必須配備符合現(xiàn)代工藝要求和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的硬件設(shè)備。 干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)硬件設(shè)備主要有細(xì)胞采集儀，細(xì)胞分離儀，生物安全柜和凈化工作臺(tái)，低溫細(xì)胞離心儀，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，細(xì)胞質(zhì)量和活力分析儀，流式細(xì)胞儀，倒置顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡，深低溫生物冰箱和普通冰箱，程序降溫儀和液氮罐，管道熱合儀及制冰機(jī)等。3、ES細(xì)胞的制備（以小鼠為例）53.1內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分離與培養(yǎng) 內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分離方法有兩種：顯微分離法和免疫外科法。顯微分離法是在顯微鏡直視下機(jī)械地進(jìn)行分離出內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。免疫外科法的原理是：大分子如免疫球蛋白不能通過囊胚滋養(yǎng)外胚層進(jìn)入囊胚腔，因此利用，免疫介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，可選擇地破壞滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，二囊胚腔內(nèi)的細(xì)胞-細(xì)胞團(tuán)則不受影響。主要介紹免疫方法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。材料與試劑：兔抗鼠血清、豚鼠血清、0.5%鏈霉蛋白酶、ES細(xì)胞培養(yǎng)液、高糖DMED、FCS、1%非必需氨基酸、129Sv孕鼠。操作方法：分離的過程均在石蠟油覆蓋的30ul液滴中進(jìn)行；孵育條件為37、5%CO2；抗體和豚鼠血清均用DMEM培養(yǎng)液稀釋。 將見栓3.5d的129Sv孕鼠脫頸處死，剖開腹部，取下子宮角，用37預(yù)熱的含血清培養(yǎng)液沖出胚胎。0.5%鏈霉蛋白酶消化約5分鐘以去除透明帶。然后將胚胎移入含10%FCS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)3小時(shí)。用免疫溶解法去除外滋養(yǎng)細(xì)胞，過程如下：將胚胎移入1:10稀釋的抗鼠血清液滴中孵育30分鐘；DMEM液滴洗3-5次，每次5分鐘；再在1:10稀釋的豚鼠血清液滴中孵育15-30分鐘；DMEM液滴清洗；然后用尖端直徑為30-40um的細(xì)吸管輕輕吹打，分出細(xì)胞團(tuán)，接種到飼養(yǎng)細(xì)胞上，在37、5%CO2、95%濕度條件下培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液。3.2 ES樣細(xì)胞擴(kuò)增 內(nèi)細(xì)胞團(tuán)經(jīng)過培養(yǎng)后會(huì)出現(xiàn)典型的干細(xì)胞的集落，將典型的集落用機(jī)械法取下，0.05%胰酶消化，打散成單細(xì)胞，接種至新飼養(yǎng)細(xì)胞上，每天更換培養(yǎng)液，從而得到多個(gè)干細(xì)胞集落。建立細(xì)胞系，傳代、凍存。 4、干細(xì)胞的保存與復(fù)蘇 5 4.1 冷凍保存設(shè)備 Cryologic 程序降溫儀、液氮罐、冷凍保存液（滲透性冷凍保護(hù)液、非滲透性冷凍保護(hù)液）。4.2 冷凍保存方法 在醫(yī)學(xué)和研究領(lǐng)域多采用細(xì)胞外冷凍法，即使在溫度相當(dāng)?shù)偷那闆r下細(xì)胞也不會(huì)致命。冷凍保存細(xì)胞的技術(shù)已廣泛用于臨床，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的關(guān)鍵步驟，10%DMSO-196液氮冷凍保存細(xì)胞是最經(jīng)典的方法。傳統(tǒng)的慢速冷存法對于可消化為單細(xì)胞的小鼠胚胎干細(xì)胞系保存是有效的，但對人類胚胎干細(xì)胞效果較差。按照冷凍保護(hù)液在凍結(jié)后是否形成冰晶來劃分，干細(xì)胞凍存方法可分為非玻璃化和玻璃化凍存兩種。4.3 干細(xì)胞復(fù)蘇方法 干細(xì)胞復(fù)蘇一般采用快速融化法，以避免慢速融化水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細(xì)胞。 注意：自液氮或干冰中取出冷凍管后，首先要檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時(shí)蓋子易松掉或注意冷凍袋有否破裂并采取相應(yīng)應(yīng)急措施。每批次冷凍和復(fù)蘇的干細(xì)胞存活率可能會(huì)不相同，為避免這個(gè)問題，每次干細(xì)胞凍存最好分兩批以上進(jìn)行。臨床應(yīng)用或再次培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)采用細(xì)胞活力儀檢測細(xì)胞存活率。5、干細(xì)胞研究前沿與展望5.1 ES細(xì)胞研究與應(yīng)用 干細(xì)胞研究是21世紀(jì)生命科學(xué)領(lǐng)域的一大熱門課題?；氐搅钊瞬毮康?998年，幾乎同時(shí)，威斯康星大學(xué)的Thomson等和霍普金斯大學(xué)的Gearhart等分別報(bào)告說，他們利用不同的方法成功地使人類胚胎干細(xì)胞在體外生長和增殖，由此獲得了具有無限增殖和分化潛力的人胚胎干細(xì)胞。5.1.1胚胎干細(xì)胞的分離建系與體外培養(yǎng)8 有關(guān)人胚胎干細(xì)胞的建系方法有多種，研究最多的是從胚胎的囊胚期內(nèi)細(xì)胞群中直接分離胚胎干細(xì)胞。另一種建系方法則是從終止妊娠的胎兒組織中分離出胚胎干細(xì)胞。5.1.2 誘導(dǎo)分化與發(fā)育6 胚胎干細(xì)胞是最早期的未分化細(xì)胞。當(dāng)處于合適的培養(yǎng)條件下，胚胎干細(xì)胞可以分化形成多種細(xì)胞類型。正是由于具有這種在體外培養(yǎng)條件下保持未分化狀態(tài)的增殖能力及分化為多種細(xì)胞類型的潛能，是胚胎干細(xì)胞成為一種研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞分化、組織形成過程的基本體系，也成為臨床移植治療的新的細(xì)胞來源。然而，目前科學(xué)家對胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的機(jī)制尚不完全清楚，即還不明白胚胎干細(xì)胞接受誰的“命令”，此時(shí)分化為造血干細(xì)胞，二彼時(shí)又分化為神經(jīng)干細(xì)胞或別的什么干細(xì)胞。這是干細(xì)胞工程進(jìn)一步研究與應(yīng)用面臨的最大困擾，也限制了胚胎干細(xì)胞的臨床應(yīng)用。因此，干細(xì)胞研究的主要問題之一就是要弄清胚胎干細(xì)胞發(fā)育分化為的調(diào)控機(jī)制，從而在體外培養(yǎng)擴(kuò)增胚胎干細(xì)胞并進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化。近年來，科學(xué)家們利用胚胎干細(xì)胞建立了不同的體外分化模型，并建立各種基因改變的胚胎干細(xì)胞系，以求發(fā)現(xiàn)某些基因或因子在胚胎發(fā)育早期對不同類型細(xì)胞或組織分化的調(diào)控作用。胚胎干細(xì)胞體外分化體系已被成功地用于確定一些細(xì)胞活性因子，為在細(xì)胞水平上分析基因功能提供了強(qiáng)有力的模型系統(tǒng)。5.1.3 遠(yuǎn)大的潛力與挑戰(zhàn)世界范圍內(nèi)的干細(xì)胞研究熱潮，可以說是由1998年人胚胎干細(xì)胞的成功建立而帶動(dòng)的。胚胎干細(xì)胞最偉大的用途首先是作為科學(xué)研究的工具。當(dāng)然，此項(xiàng)進(jìn)展也使科學(xué)家們看到了干細(xì)胞生物工程的曙光。胚胎干細(xì)胞在臨床醫(yī)療等領(lǐng)域也顯示了誘人的應(yīng)用前景。有諸多理由可說明胚胎干細(xì)胞對科學(xué)和人類健康發(fā)展的重要性。最基本的是人胚胎細(xì)胞系的建立及人胚胎干細(xì)胞研究可以幫助我們理解人類發(fā)育過程中的復(fù)雜事件，使人深刻認(rèn)識(shí)數(shù)十年來困擾著胚胎學(xué)家的一些基本問題，促進(jìn)對人胚胎發(fā)育細(xì)節(jié)的基礎(chǔ)研究。胚胎干細(xì)胞系可分化為多種細(xì)胞類型，又是能在培養(yǎng)基中不斷自我更新的細(xì)胞來源，它發(fā)展為胚體后的生物系統(tǒng)，可模擬體內(nèi)細(xì)胞與組織間復(fù)雜的相互作用，這在藥物研究領(lǐng)域具有廣泛的用途。胚胎干細(xì)胞有望在短期內(nèi)就能體現(xiàn)的優(yōu)勢在于藥物篩選中。目前，在候選藥物對各種細(xì)胞的藥理作用和毒性試驗(yàn)中，胚胎干細(xì)胞提供了新藥的藥理、藥效、毒理及藥代等研究的細(xì)胞水平的研究手段，大大減少了藥物檢測所需動(dòng)物的數(shù)量，降低了成本。另外，由于胚胎干細(xì)胞類似于早期胚胎的細(xì)胞，它們有可能用來揭示哪些藥物會(huì)干擾胎兒發(fā)育和引起出生缺陷。胚胎干細(xì)胞最誘人的前景和用途是生產(chǎn)組織和細(xì)胞，用于“細(xì)胞療法”，為細(xì)胞移植提供無免疫原性的材料。任何涉及喪失正常細(xì)胞的疾病都可以通過移植由胚胎干細(xì)胞分化而來的特異組織細(xì)胞來治療，如用神經(jīng)細(xì)胞治療神經(jīng)退變性疾病。5.1.4胚胎干細(xì)胞研究面臨的難題及倫理學(xué)爭議7 胚胎干細(xì)胞研究仍面臨許多技術(shù)難題，包括：如何維持體外擴(kuò)增時(shí)不分化？分化細(xì)胞的增殖是一個(gè)瓶頸問題，如何獲得組織工程所需要的種子細(xì)胞的數(shù)量，很值得研究。而如何得到純化的分化細(xì)胞也有很多工作要做。如何定向誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化？由胚胎干細(xì)胞在體外發(fā)育成一完整的器官尤其是像心、肝、腎、肺等大型精細(xì)復(fù)雜的器官，并真正用于器官克隆與移植仍需有技術(shù)上得突破。 除以上所面臨的難題外，有胚胎干細(xì)胞研究所引發(fā)的涉及倫理、社會(huì)、法律、醫(yī)學(xué)、神學(xué)和道德的爭議和大辯論也不能不引起重視。胚胎干細(xì)胞最終能否得以應(yīng)用在很大程度上將取決于倫理學(xué)與法律問題的解決與否。這些問題有一下幾個(gè)方面：胚胎干細(xì)胞的來源是否合乎法律及道德？將人胚胎干細(xì)胞嵌入家畜胚胎中創(chuàng)立嵌合體來獲得移植用人體器官是否道德？目前克隆技術(shù)尚不完善，沒有保障且不安全。任何分化細(xì)胞都有形成腫瘤或無控制地生長的特性。胚胎干細(xì)胞的安全性如何？5.2干細(xì)胞與組織工程9 完美地修復(fù)或替代因疾病、戰(zhàn)傷、意外事故或遺傳因素造成的組織、肢體或器官的傷殘一直是人類的“夢想”。而最新的研究結(jié)果表明，利用組織工程和干細(xì)胞等現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)技術(shù)，有可能使這一“夢想”成為現(xiàn)實(shí)。 目前組織工程、干細(xì)胞研究已經(jīng)成為21世紀(jì)生命科學(xué)研究的焦點(diǎn)。組織工程研究涉及種子細(xì)胞、支架材料以及組織構(gòu)建等眾多研究領(lǐng)域，干細(xì)胞研究則有望解決組織工程研究中的種子細(xì)胞來源問題。前者屬于生物高技術(shù)領(lǐng)域中的一門新興學(xué)科，而后者屬于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究范疇，兩者之間緊密聯(lián)系，但又各有側(cè)重。5.3干細(xì)胞與基因治療10 自從基因治療進(jìn)入臨床試驗(yàn)后，有關(guān)的基礎(chǔ)研究已取得很大進(jìn)展，為了使目的基因能在患者體內(nèi)長期或永久地表達(dá)，并且表達(dá)具有靶向性，必須選擇一種適合的靶細(xì)胞。干細(xì)胞因?yàn)榫哂凶晕腋禄蜃晕覐?fù)制的能力而成為基因治療理想的靶細(xì)胞。 總結(jié)：無論是從科學(xué)研究還是臨床應(yīng)用角度都有必要盡快加強(qiáng)國產(chǎn)化胚胎干細(xì)胞的建系與定向誘導(dǎo)分化研究。重要的研究領(lǐng)域可歸納為幾點(diǎn)：建立及完善維持胚胎干細(xì)胞的體外增殖與定向誘導(dǎo)分化的體系；研究轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)核胚胎干細(xì)胞的增殖與分化及其調(diào)控機(jī)制；誘導(dǎo)分化細(xì)胞性能的分析與鑒定；探索克服移植排斥等的技術(shù)與方法。設(shè)想在不久的將來，干細(xì)胞治療疾病的新技術(shù)將被應(yīng)用到臨床，造福于人類。參考文獻(xiàn)：1裴雪濤，等，干細(xì)胞生物學(xué)，北京；科學(xué)出版社，2003.7。2楊曉鳳、張素芬、郭子寬，干細(xì)胞應(yīng)用新技術(shù)，北京；軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2010.7。3王延華、羊惠君，干細(xì)胞理論與技術(shù)，北京；科學(xué)出版社，2005.3。4王佃亮，干細(xì)胞組織工程技術(shù)，北京；科學(xué)出版社，2