《酶工程》期末復習題整理.doc

第一章1.酶工程：是生物工程的重要組成部分，是隨著酶學研究迅速發(fā)展，特別是酶的推廣應用，使酶學和工程學相互滲透、結合、發(fā)展而成的一門新的技術科學，是酶學、微生物學的基本原理與化學工程有機結合而產(chǎn)生的邊緣科學技術。2.化學酶工程：指自然酶、化學修飾酶、固定化酶及化學人工酶的研究和應用3.生物酶工程：是酶學和以基因重組技術為主的現(xiàn)代分子生物學技術結合的產(chǎn)物， 亦稱高級酶工程。4.酶工程的組成部分？答：酶工程主要指自然酶和工程酶（經(jīng)化學修飾、基因工程、蛋白質工程改造的酶）在國民經(jīng)濟各個領域中的應用。內容包括：酶的產(chǎn)生；酶的分離純化；酶的改造；生物反應器。5.酶的結構特點？答：雖然少數(shù)有催化活性的RNA分子已經(jīng)鑒定，但幾乎所有的酶都是蛋白質，因而酶必然具有蛋白質四級結構形式。其中一級結構是指具有一定氨基酸順序的多肽鏈的共價骨架；二級結構為在一級結構中相近的氨基酸殘基間由氫鍵的相互作用而形成的帶有螺旋、折疊、轉角、卷曲等細微結構；三級結構系在二級結構基礎上進一步進行分子盤區(qū)以形成包括主側鏈的專一性三維排列；四級結構是指低聚蛋白中各折疊多肽鏈在空間的專一性三維排列。具有低聚蛋白結構的酶（寡聚酶）必須具有正確的四級結構才有活性。具有活性的酶都是球蛋白，即被廣泛折疊、結構緊密的多肽鏈，其氨基酸親水基團在外表，而疏水基團向內。6.酶活性中心：是酶結合底物和將底物轉化為產(chǎn)物的區(qū)域，通常是整個酶分子中相當小的一部分，它是由在線性多肽鏈中可能相隔很遠的氨基酸殘基形成的三維實體。7.酶作用機制有哪幾種學說？答：鎖和鑰匙模型、誘導契合模型8.酶催化活力的影響因素？答：底物濃度、酶濃度、溫度、pH等。9.酶的分離純化的初步分離純化的步驟？答：（一）材料的選擇和細胞抽提液的制備 1.材料的選擇：目的蛋白含量要高，而且容易獲得 2.細胞破碎方法及細胞抽提液的制備。為了確保可溶性細胞成分全部抽提出來，應當使用類似于生理條件下的緩沖液。動物組織和器官要盡可能除去結締組織和脂肪、切碎后放人搗碎機中。完全破碎酵母和細菌細胞。 3.膜蛋白的釋放:膜蛋白存在于細胞膜或有關細胞器的膜上。按其所在位置大體可分為外周蛋白和固有蛋白兩種類型 4.胞外酶的分離:胞外酶是在微生物發(fā)酵時分泌到發(fā)酵液中的。發(fā)酵后可通過離心或過濾將菌體從發(fā)酵液中分離棄去，所得發(fā)酵清液通常要適當濃縮，然后再作進一步純化。目前常用的濃縮方法是超濾法。（二）蛋白質的濃縮和脫鹽 濃縮方法主要有：沉淀法、吸附法、干膠吸附法、滲透濃縮法、超濾濃縮法（三）沉淀法分級蛋白質 1.鹽析法 2.有機溶劑法第二章1.固定化酶（p34）：所謂固定化酶，是指在一定空間內呈閉鎖狀態(tài)存在的酶，能連續(xù)地進行反應，反應后的酶可以回收重復使用。固定化細胞（p53）：固定化細胞就是被限制自由移動的細胞，即細胞受到物理化學等因素約束或限制在一定的空間界限內，但細胞仍保留催化活性并具有能被反復或連續(xù)使用的活力。偶聯(lián)率（p57）：偶聯(lián)率=(加入蛋白活力上清蛋白活力)/加入蛋白活力100相對活力（p57）：相對活力=固定化酶總活力/(加入酶的總活力上清中未偶聯(lián)酶活力) 100酶的半衰期（p58）：指在連續(xù)測定條件下，固定化酶（細胞）的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時間，以t1/2表示。（半衰期是衡量穩(wěn)定性的指標）活力回收（p57）：指固定化后固定化酶（或細胞）的總活力占用于固定化的游離酶（細胞）總活力的比例。2.固定化酶相比游離酶的優(yōu)缺點（p34）？答：與游離酶相比，固定化酶具有以下優(yōu)點:1.極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開2.可以在較長時間內進行反復分批反應和裝柱連續(xù)反應3.在大多數(shù)情況下能夠提高酶的穩(wěn)定性4.酶反應過程能夠加以嚴格控制5.產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留,簡化了提純工藝6.較游離酶更適合于多酶反應7.可以增加產(chǎn)物的收率提高產(chǎn)物的質量8.酶的使用效率提高成本降低。 同時，固定化酶也存在一些缺點:1.固定化時,酶活力有損失2.增加了生產(chǎn)的成本，工廠初始投資大3.只能用于可溶性底物，而且較適用于小分子底物，對大分子底物不適宜4.與完整菌體相比，不適用于多酶反應，特別是需要輔助因子的反應5.胞內酶必須經(jīng)過酶的分離過程。3.固定化酶的制備方法及各方法的優(yōu)缺點（p35-p42）？答：見p35-p424.固定化酶的制備原則（p34）？答：必須注意維持酶的催化活性及專一性。 為使固定化更有利于生產(chǎn)的自動化、連續(xù)化。其載體必須有一定的機械強度，不能因機械攪拌而破碎或脫落。 固定化酶應有最小的空間位阻，盡可能不妨礙酶與底物的接近，以提高產(chǎn)品的產(chǎn)量 酶與載體必須結合牢固，從而使固定化酶能回收貯藏，利于反復使用。 固定化酶應有最大的穩(wěn)定性，所選載體不與廢物、產(chǎn)物或反應液發(fā)生化學反應。 固定化酶成本要低，以利于工業(yè)使用 5.固定化酶的評價指標（p57）？答：固定化酶(細胞)的活力。固定化酶(細胞)的活力即固定化酶（細胞）催化某一特定化學反應的能力，其大小可用一定條件下它所催化的某一反應的反應初速率來表示偶聯(lián)效率及相對活力的測定。影響酶固有性質諸因素的綜合效應及固定化期間引起的酶失活，可用偶聯(lián)效率或相對活力來表示。固定化酶（細胞）的半衰期。固定化酶（細胞）的半衰期是指在連續(xù)測定條件下，固定化酶（細胞）的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時間，以t1/2表示。半衰期是衡量穩(wěn)定性的指標。第三章1.蛋白質的化學修飾：凡通過化學基團的引入或除去,使酶分子共價結構發(fā)生改變，從而改變酶的某種特性和功能的過程。 交聯(lián)劑（p85）：交聯(lián)劑是具有兩個反應活性部位的雙功能基團，可以在相隔較近的兩個氨基酸殘基之間，或酶與其他分子之間發(fā)生交聯(lián)反應。 交聯(lián)修飾：使用雙功能基團試劑將酶蛋白分子之間、亞基之間或分子內不同肽鏈部分間進行共價交聯(lián)。 固定化修飾：通過酶表面的酸性或堿性殘基，將酶共價連接到惰性載體上。2.怎么控制修飾反應的專一性（p75）？答：（1）試劑的選擇 用于修飾酶活性部位的氨基酸殘基的試劑應具備以下一些特征：選擇性地與一個氨基酸殘基反應；反應在酶蛋白不變性的條件下進行；標記的殘基在肽中穩(wěn)定；很易通過降解分離出來，進行鑒定；反應的程度能用簡單的技術測定。 （2）反應條件的選擇蛋白質與修飾劑作用所要求的反應條件，除允許修飾能順利進行外，還必須滿足如下要求：一是不造成蛋白質的不可逆變性，為了證明這一點，必須做對照試驗；二是有利于專一性修飾蛋白質，為此，反應條件應盡可能在保證蛋白質特定空間構象不變或少變的情況下進行。 （3）反應的專一性 利用蛋白質分子中某些基團的特殊性選擇不同的反應pH利用某些產(chǎn)物的不穩(wěn)定性親和標記差別標記利用蛋白質狀態(tài)的差異。3.修飾主要包括哪些內容（修飾哪些基團）（p79-p83）？答：羧基的化學修飾、氨基的化學修飾、精氨酸胍基的化學修飾、巰基的化學修飾、組氨酸咪唑基的化學修飾、色氨酸吲哚基的化學修飾、酪氨酸殘基和脂肪族羥基的化學修飾、甲硫氨酸甲硫基的化學修飾第四章1.蛋白質的穩(wěn)定性（p102）：蛋白質的穩(wěn)定性指的是蛋白質抵抗各種因素的影響、保持其生物活力的能力。 蛋白質工程：指用基因操縱技術高度專一性地改變目標蛋白質。2.酶蛋白穩(wěn)定的分子原因（p102-p103）？答：（1）金屬離子、底物、輔因子和其他低分子量配體的結合作用（2）蛋白質-蛋白質和蛋白質-脂的作用（3）鹽橋和氫鍵（4）二硫鍵（5）對氧化作用敏感的氨基酸含量較低（6）氨基酸殘基的堅實裝配（7）疏水相互作用 3.酶蛋白不可逆失活的原因？答：（1）蛋白水解酶和自溶作用（2）聚合作用（3）極端pH（4）氧化作用（5）表面活性劑和去污劑（6）變性劑（7）重金屬離子和巰基試劑（8）熱（9）機械力（10）冷卻和脫水（11）輻射作用4.穩(wěn)定的主要方法有哪些（p110-p114）？答：（1）固定化（2）非共價修飾：反相膠束添加劑蛋白質間非共價相連（3）化學修飾：可溶性大分子修飾酶小分子修飾酶（4）蛋白質工程（5）酶的失活和再活化 第五章1. 反相膠束（p111）：反相膠束是由兩性化合物在占優(yōu)勢的有機相中形成的。依溶劑和表面活性劑的組成，可在與水不混溶的溶劑中得到微乳化的反相膠束。 水活度（p146）：水活度（aw）定義為系統(tǒng)中水的逸度與純水逸度之比，水的逸度在理想條件下用水的蒸氣壓代替，因此aw可以用體系中的水的蒸氣壓與同樣條件下純水蒸氣壓之比表示：aw=wxw 必需水（p146）：最適水量是保證酶的極性部位水合、表現(xiàn)活力所必需的，即“必需水”。它直接影響酶的催化活性和選擇性。 化學修飾酶：酶蛋白分子的主鏈進行切割、剪切、以及在側鏈上進行化學修飾，使其結構、性質改變后的酶 印記酶：p1522.非水相的催化與水相催化相比的優(yōu)點（p125）？答：（1）增強難溶于水的反應物的溶解度（2）在有機介質中改變反應平衡（3）酶制劑易于回收再利用（4）在有機溶劑中可增強酶的穩(wěn)定性（5）在有機溶劑中可改變酶的選擇性（6）不會或很少發(fā)生微生物污染。3.非水介質有哪些（p126-p129）？答：（1）水-有機溶劑單相系統(tǒng)（2）水-有機溶劑兩相系統(tǒng)（3）含有表面活性劑的乳液或微乳液系統(tǒng)（4）微水有機溶劑單相系統(tǒng)（5）無溶劑或少溶劑反應系統(tǒng)（6）超臨界流體系統(tǒng)（7）離子液體（8）氣相反應介質4.非水介質中的選擇催化有何特點（p133-p135）？答：（1）底物特異性。酶在有機溶劑中對底物的化學結構和立體結構均有嚴格的選擇性（2）對映體選擇性：酶識別外消旋化合物中某種構象對映體的能力（3）位置選擇性。有機溶劑中的酶催化還具有位置選擇性，即酶能夠選擇性地催化底物中某個區(qū)域的基團發(fā)生反應（4）化學鍵選擇性。5.有機溶劑的影響體現(xiàn)在哪些方面（p141-p143）？答：（1）有機溶劑對酶的結合水的影響（2）有機溶劑對酶的影響：有機溶劑對酶的動態(tài)的影響、溶劑對酶結構的影響、溶劑對酶活性中心的影響、酶活力和溶劑屬性的定量關系模型（3）溶劑對底物和產(chǎn)物的影響（4）溶劑對酶活性和選擇性的調節(jié)和控制第六章1.表面分子印記（p196）：在大孔硅膠表面，應用通常的分子印記法可產(chǎn)生具有分子識別能力的微孔聚合薄層。類似這樣在某些載體表面產(chǎn)生分子印記空腔或進行表面修飾產(chǎn)生印記結合部位的過程稱為表面分子印記。 生物印記（p198）：是分子印記的一種形式，它是指以天然的生物材料（如蛋白質和糖類物質）為骨架，在其上進行分子印記而產(chǎn)生對印記分子具有特異性識別空腔的過程。 模擬酶（p178）：一般說來，它的研究就是吸收酶中那些起主導作用的因素，利用有機化學、生物化學等方法設計和合成一些較天然酶簡單的非蛋白質分子或蛋白質分子，以這些分子作為模型來模擬酶對其作用底物的結合和催化過程。也就是說，人工模擬酶是在分子水平上模擬酶活性部位的形狀、大小及其微環(huán)境等結構特征，以及酶的作用機理和立體化學等特征的一門科學。 肽酶（p189）：肽酶就是模擬天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。 半合成酶（p190）：它是以天然蛋白質或酶為母體，用化學或生物學方法引進適當?shù)幕钚圆课换虼呋鶊F，或改變其結構從而形成一種新的“人工酶”。 分子印記（p193）：如果以一種分子充當模板，其周圍用聚合物交聯(lián)，當模板分子除去后，此聚合物就留下了與此分子相匹配的空穴。如果構建合適，這種聚合物就像“鎖”一樣對鑰匙具有選擇性識別作用，這種技術被稱為分子印記。2.模擬酶的種類（按屬性分）(P179)？答：主-客體酶模型、膠束酶模型、肽酶、半合成酶、分子印記酶模型、抗體酶以及雜化酶和進化酶等。3.制備分子印跡聚合物包括哪些步驟（p195）？答：選定印記分子和單體，讓他們之間充分作用在印記分子周圍發(fā)生聚合反應將印記分子從聚合物中抽提出去。于是，此聚合物就產(chǎn)生了恰似印記分子的空間，并對印記分子產(chǎn)生識別能力。第七章1.抗體酶（p210）：也叫催化抗體，它本質上是一類具有催化活力的免疫球蛋白，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。2.抗體酶的制備方法有哪些（p211-p214）？答：（1）穩(wěn)定過渡態(tài)法（2）抗體與半抗原互補法（3）熵阱法（4）多底物類似物法（5）抗體結合部位修飾法（6）蛋白質工程法（7）抗體庫法。3.抗體酶活性部位修飾有哪兩種方法（p214-p215）？答：（1）定點突變。定點突變即蛋白質工程法，用此法可精確改變蛋白質肽鏈上的任一氨基酸殘基，因此，可用來闡明某一氨基酸殘基在抗體結合和催化中的作用（2）化學修飾法。修飾抗體酶，可以改善抗體酶的性質，如提高其活力、改變專一性等。第八章1.核酶（p226）：具有催化功能的RNA 脫氧核酶（p226）:人工合成的具有催化功能的DNA2.根據(jù)催化功能，核酶分為哪幾類(P226-P227)？答：（1）剪切型核酶。這類核酶主要催化自身或異體RNA的切割，相當于核酸內切酶的作用。目前發(fā)現(xiàn)的剪切型核酶包括：錘頭型核酶 發(fā)卡型核酶HDVRNaseP （2）剪接型核酶。這類核酶主要催化mRNA前體的修飾加工，切除內含子，并完成片段的拼接，主要包括類內含子和類內含子。3.影響核酶活性的因素？答：（1）pH值對活性的影響（2）二價金屬陽離子對活性的影響：Mg2+，Mn2+（3）抗生素對活性的影響：大多數(shù)為抑制效應（4）變性劑對活性的影響（5）溫度對活性的影響4.核酶、脫氧核酶體外篩選方法有哪幾種（p230-p231）？答：（1）SELEX技術。從隨機寡核苷酸文庫中篩選出與靶分子特異結合序列的組合化學技術，隨機寡核苷酸的多種空間結構是篩選基礎（2）動態(tài)組合篩選法。動態(tài)組合化學法利用可逆化學法應，使組合庫中的結構單元進行動態(tài)結合和交換，能夠有靶向性地為生物大分子設計、合成和篩選其特異性配體。5.核酶導入細胞有哪兩種方式（p237）？答：（1）外生性導入，即把預先合成的核酶直接引入到細胞內（2）內生性導入，這種方法是將編碼核酶的基因由載體帶入細胞內，然后再轉錄產(chǎn)生核酶。第九章1.進化酶：利用基因工程、蛋白質工程的原理和計算機技術，対天然酶分子進行改造或構建新的非天然酶。 酶分子的合理設計（p243）：是利用各種生物化學、晶體學、光譜學等方法獲得有關酶分子的結構、特性和功能的信息，并搞清結構與功能之間的關系，然后以此為依據(jù)，采用改變(修飾)酶分子中個別氨基酸殘基的方法對酶分子進行改造，產(chǎn)生具有新性狀的酶分子，因而該方案稱為酶分子的合理設計，如化學修飾、定點突變等。 酶分子的非合理設計（p243）：在事先不了解酶分子三維結構信息和催化機制，對酶的結構與功能的相關性知之甚少的情況下，人為地創(chuàng)造特定的進化條件，在體外模擬漫長的自然進化過程 (隨機突變、基因重組、定向選擇或篩選)，使基因發(fā)生多種變異，最后定向選擇或篩選出所需性質或功能的突變體酶，該策略稱為酶分子的非合理設計，如定向分子進化 、雜合進化等。2.定向進化多樣化的基本方法有哪些？內容是什么？（p245-p249）答：（1）易錯PCR：是指利用Taq DNA聚合酶不具有3 5校正功能的特點，在特定條件下對待進化酶基因進行PCR擴增時，以較低的頻率向目的基因中隨機引入突變的一種技術。（2）DNA改組：DNA改組又稱為有性PCR。是將一組密切相關的序列片段化，再通過重組創(chuàng)造新基因的方法。（3）族改組：將DNA改組用于