（課件）免疫自動化儀器分析

免疫自動化儀器分析 醫(yī)學檢驗系劉利東 概論 早期免疫分析通過觀察沉淀物形成 凝集及溶血現(xiàn)象發(fā)生來分析 如免疫擴散 免疫電泳 血凝試驗 補體結(jié)合等上世紀50年代末60年代初 利用AG AB復合物形成使?jié)岫雀淖?再用比濁計來比濁 但因其敏感性差未被接受70年代初 開始有自動檢測系統(tǒng) 但因其用的是激光為光源 固定波長 靈敏度較低 而且時間一般要2 3小時 概論 70年代未 速率比濁計的出現(xiàn) 使抗原抗體結(jié)合的反應在幾十秒內(nèi)出結(jié)果 可以說是免疫化學測定的革命的發(fā)展隨著標記技術的發(fā)展 免疫化學可以納入臨床化學檢驗范疇如今 自動化免疫分析系統(tǒng)更加飛速發(fā)展自動化免疫分析的基礎是抗原抗體的結(jié)合 具有高特異性 手段多是利用標記技術而將檢測信號放大 具有高靈敏度 自動化免疫儀器種類 應用技術 免疫比濁分析技術化學發(fā)光 電發(fā)光分析技術熒光免疫分析技術放射免疫分析技術酶免疫分析技術流式細胞術 免疫比濁 利用抗原抗體結(jié)合后溶液的濁度變化而檢測的一種方法此法準確快速 已成為免疫診斷技術中重要的檢測手段比濁法與比色法 散射免疫比濁分析法 基本原理 抗原抗體復合物對一定波長的光產(chǎn)生折射 偏轉(zhuǎn) 偏轉(zhuǎn)角度及散射光強度與復合物粒子的大小和量有關 圖 Rayleigh散射 圖 Mile散射Heidelberger曲線 定時散射比濁分析 基本原理 免疫沉淀反應和散射比濁分析結(jié)合之技術 反應分兩個階段 預反應階段和反應階段 圖 保證抗原不過量的方法 確保反應體系抗體過量對抗原過量進行閾值限定 預反應階段5ul樣本 抗原過剩區(qū) 閾值 信號 反應階段45ul樣本 7 5秒 2分鐘 6分鐘 2 4分鐘 定時散射比濁反應曲線圖 抗原不過量抗原過量 速率散射比濁分析 基本原理 抗原抗體結(jié)合反應的一種動態(tài)測定法 適時檢測抗原抗體復合物形成的散射光信號最快反應時間 圖 抗原過量檢測 圖 抗原濃度遞增 散射光峰值 峰值信號與抗原抗體反應之間的關系圖 A B C D F G H I 反應時間 秒 0 60 85 散射率 抗體過量 抗原過量 第二峰值信號 抗原量檢測速率峰值信號產(chǎn)生 免疫透射比濁 基本原理 檢測信號是通過溶液的光 測量角度與正前方夾角為0 圖 保持抗體過量 形成可溶性AG AB復合物 使介質(zhì)濁度發(fā)生改變 實驗要求 選擇親和力高的抗體 抗原抗體復合物要大 數(shù)量要多 反應時間充分 單色器 透射比濁計 散射比濁計 散射比濁和透射比濁的區(qū)別示意圖 透射光散射光 散射光 膠乳濁度測定法 基本原理是 將抗體吸附在大小適中 均勻一致的膠乳顆粒上 當遇到相應抗原時 則使膠乳顆粒發(fā)生凝集 單個膠乳顆粒在入射光波之內(nèi)不阻礙光線透過 兩個或兩個以上膠乳顆粒凝聚時則使透過光減少 這種減少的程度與膠乳顆粒凝聚的程度呈正比 當然也與待測抗原量呈正比 圖 光波 膠乳濁度測定法原理 d d 2d 影響免疫比濁的因素 抗原抗體比例抗體純度和效價增聚劑 PEG 自動免疫濁度分析儀的要求 校準程序 使儀器處于正常的工作狀態(tài)定標程序 保證檢測結(jié)果的準確性自動控制 保證實施實驗條件中的抗原抗體反應體系要求自動系統(tǒng) 障礙的檢測和預警 自動化免疫儀器種類 應用技術 免疫比濁分析技術化學發(fā)光 電發(fā)光分析技術熒光免疫分析技術放射免疫分析技術酶免疫分析技術流式細胞術 化學發(fā)光自動免疫分析 化學發(fā)光是指在化學反應過程中產(chǎn)生光的發(fā)射現(xiàn)象基本原理 標記在抗原或抗體上的發(fā)光物質(zhì)在堿性介質(zhì)中氧化時產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的中間體 中間體回基態(tài)時產(chǎn)生輻射 多余的能量為發(fā)射光子 產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象 再對光信號進行接收轉(zhuǎn)化 可得檢測物濃度發(fā)光物質(zhì)須具備 氧化致發(fā)光 光量子產(chǎn)額高 理化性能好 化學發(fā)光自動免疫分析類型 化學發(fā)光免疫分析 CLIA 是一種用發(fā)光劑直接標記抗體的一類免疫分析法 用來標記的發(fā)光物必須能參與發(fā)光反應 標記和偶聯(lián)后能穩(wěn)定 理化性質(zhì)和免疫特性不改變 多用吖啶酯類和苯酚類化合物 化學發(fā)光自動免疫分析類型 化學發(fā)光酶免疫分析 CLEIA 以催化反應的酶為標記物 抗原抗體結(jié)合后 其中的酶可對發(fā)光體系產(chǎn)生催化作用 產(chǎn)生發(fā)光效應 發(fā)光信號與抗原抗體的量成正比 多用的發(fā)光體系是HRP 魯米諾 化學發(fā)光自動免疫分析類型 微粒子化學發(fā)光免疫分析 ECIA 也是一種酶免疫分析 用磁珠作為固相載體 增加反應體積和分離效率 標記的酶多為ALP 化學發(fā)光自動免疫分析類型 電化學發(fā)光免疫分析 ECLIA 一種在電極表面由電化學引發(fā)的特異性化學發(fā)光反應 實際上包括了電化學和化學發(fā)光二個過程 其中應用了 親和素 生物素 放大系統(tǒng) 使檢測的靈敏度大大提高以雙抗體夾心法為例之圖示 圖 ECLIA體系結(jié)構圖 ECLIA檢測流程圖一 雙抗體夾心的形成 ECLIA檢測流程圖二 生物素與親和素結(jié)合 ECLIA檢測流程圖三 磁珠吸引吸附于電極表面 ECLIA檢測流程圖四 電極充電啟動電化學反應 ECLIA檢測流程圖五 撤消磁場沖洗磁珠 化學發(fā)光自動免疫分析 化學發(fā)光免疫分析是免疫技術 發(fā)光技術和計算機系統(tǒng)的結(jié)合 具有特異性強 靈敏度高 pg ml 精密度好 準確度好等特點 越來越多的人體微量指標應用這種方法來檢測 已漸漸代替了RIA 自動化免疫儀器種類 應用技術 免疫比濁分析技術化學發(fā)光 電發(fā)光分析技術熒光免疫分析技術放射免疫分析技術酶免疫分析技術流式細胞術 熒光免疫自動化 利用熒光物質(zhì)標記抗原抗體的一種檢測方法由免疫反應 熒光及計算機技術聯(lián)合應用的技術主要有時間分辨熒光免疫測定和熒光偏振免疫測定 熒光免疫自動化 時間分辨熒光免疫測定 TRFIA AG AB結(jié)合 某些熒光物質(zhì)發(fā)長壽命熒光 時間分辨技術利用長壽命熒光物質(zhì) 鑭氏元素銪螯合物 標記抗原或抗體 測定過程中 可利用延遲時間來消除非特異性的熒光干擾 圖 光強度 激發(fā) 短壽命熒光 長壽命熒光 延遲時間 測量時間 銪螯合物的激發(fā) 發(fā)射光譜 熒光免疫自動化 TRFIA設計中的一些注意事項 Stakes位移 圖 解離增強 熒光免疫自動化 熒光偏振免疫測定 以小分子物質(zhì)與大分子物質(zhì)的旋轉(zhuǎn)差異而使它們對偏振光的吸收不同為依據(jù)檢測小分子藥物熒光酶免疫分析 標記酶參與反應 波長 300400500600700 Stakes 吸光度 Stakes位移示意圖 激發(fā)光 熒光 自動化免疫儀器種類 應用技術 免疫比濁分析技術化學發(fā)光 電發(fā)光分析技術熒光免疫分析技術放射免疫分析技術酶免疫分析技術流式細胞術 流式細胞儀 流式細胞儀 FCM 是以激光為光源 檢測生物學顆粒理化性質(zhì)的儀器生物學顆粒包括免疫復合物 DNA RNA 蛋白質(zhì) 病毒顆粒 脂質(zhì)體 細胞器 細胞 染色體 真核細胞等理化性質(zhì)則為細胞大小 形狀 胞漿顆粒 DNA含量 酶活性等 流式細胞儀 FCM綜合了激光技術 電子技術 流體力學 細胞化學及計算機技術 被稱為實驗室 CT FCM現(xiàn)正廣泛應用于細胞生物學 免疫學 腫瘤學 血液學 病理學 遺傳學 臨床檢驗學等 流式細胞儀基本原理 基本原理 單個經(jīng)熒光染料染色的細胞經(jīng)過激光激發(fā)后 發(fā)射的熒光在不同的角度進行測量 并對其信號進行綜合分析 圖 細胞分選原理 通過測量區(qū)的細胞若其參數(shù)符合實驗設計的條件 在經(jīng)過偏轉(zhuǎn)板時被充上相應的電荷并被偏轉(zhuǎn)收集 圖 液流系統(tǒng) 樣本和鞘流液組成 圖 光學系統(tǒng) 光源可為汞燈或激光信號接收系統(tǒng) 散射光和熒光的檢測 流式細胞儀基本組成 側(cè)向熒光信號 鞘流 前向散射光 流式細胞流動池示意圖 噴嘴 激光束 散射光的檢測 信號的產(chǎn)生及強度 圖 前向散射光 圖 側(cè)向散射光 圖 信號的產(chǎn)生 激光照射區(qū) 信號檢測曲線 細胞中熒光素今量與信號的關系 信號的產(chǎn)生 細胞中熒光素今量與信號的關系 信號的產(chǎn)生 激光器 激光器 激光探測器 大顆粒 小顆粒 前散射光示意圖 激光器 激光器 側(cè)向散射光探測器 復雜顆粒 簡單顆粒 側(cè)向散射光示意圖 熒光測量 熒光染料染色的細胞通過測量區(qū)時 細胞中特異性熒光物質(zhì)受激發(fā)產(chǎn)生熒光信號 后者強弱表示待測物質(zhì)的多少熒光的檢測系統(tǒng)由濾光片和檢測器組成 濾光片的作用是使激發(fā)光波長盡可能接近熒光染料的激發(fā)光譜峰值 濾除非熒光信號 提高熒光的檢測強度 流式細胞儀免疫分析的技術要求 儀器性能指標 熒光分辨率 熒光靈敏度 前向角散色光靈敏度 前向角散光分辨率 分析 分選速度 分選純度 分選收獲率檢測樣品要求要單細