紫外-可見分光光度法00.doc

第九章 紫外-可見分光光度法【學(xué)習(xí)目標(biāo)】 1.掌握紫外-可見光譜的基本概念、有機(jī)化合物中電子躍遷的基本類型、紫外-可見光譜的定性分析方法和定量分析方法；2.熟悉紫外-可見光譜儀的基本原理；3.了解無機(jī)化合物的紫外-可見吸收光譜。4.能使用紫外-可見光譜法進(jìn)行物質(zhì)的定性和定量分析。 紫外可見分光光度法（ultravioletvisible spectrophotometry）是根據(jù)物質(zhì)分子對(duì)波長為200800nm這一范圍的電磁波的吸收特性所建立起來的一種定性、定量和結(jié)構(gòu)分析方法。按所吸收光的波長區(qū)域不同，分為紫外分光光度法(60-400nm)和可見分光光度法(400-800nm)合稱為紫外一可見分光光度法。這種分子吸收光譜源于價(jià)電子或分子軌道上電子的電子能級(jí)間躍遷，廣泛用于無機(jī)和有機(jī)物質(zhì)的定量測定，輔助定性分析（如配合IR）。 第一節(jié) 紫外可見吸收光譜一、分子吸收光譜的產(chǎn)生分子由于受到紫外-可見光電磁輻射，分子間電子躍遷產(chǎn)生。通常，分子是處在基態(tài)振動(dòng)能級(jí)上。當(dāng)用紫外、可見光照射分子時(shí)，電子可以從基態(tài)激發(fā)到激發(fā)態(tài)的任一振動(dòng)（或不同的轉(zhuǎn)動(dòng)）能級(jí)上。因此，電子能及躍遷產(chǎn)生的吸收光譜，包括了大量譜線，并由于這些譜線的重疊而成為連續(xù)的吸收帶，這就是為什么分子的紫外、可見光普不是線狀光譜，而是帶狀光譜的原因。在分子中，除了電子相對(duì)于原子核的運(yùn)動(dòng)外，還有核間相對(duì)位移引起的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)。這三種運(yùn)動(dòng)能量都是量子化的，并對(duì)應(yīng)有一定能級(jí)。下圖為分子的能級(jí)示意圖。圖9-1 分子中電子能級(jí)、振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)示意圖 分子總能量：E分子 = E電子 + E振動(dòng) + E轉(zhuǎn)動(dòng)當(dāng)用頻率為的電磁波照射分子，而該分子的較高能級(jí)與較低能級(jí)之差E恰好等于該電磁波的能量 時(shí)，即能量變化的大小和入射光頻率的關(guān)系為： E = （ 普朗克常數(shù)h=6.62410-34Js=4.13610-15eVs，頻率，s-1,）此時(shí)，在微觀上出現(xiàn)分子由較低能級(jí)躍遷到較高的能級(jí)；在宏觀上則透射光的強(qiáng)度變小。用一連續(xù)輻射的電磁波照射分子，將照射前后光強(qiáng)度的變化轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，并記錄下來，然后以波長為橫坐標(biāo)，以電信號(hào)（吸光度 A）為縱坐標(biāo)，就可以得到一張光強(qiáng)度變化對(duì)波長的關(guān)系曲線圖-紫外可見吸收光譜圖。 二、分子吸收光譜類型根據(jù)吸收電磁波的范圍不同，可將分子吸收光譜分為遠(yuǎn)紅外光譜、紅外光譜及紫外、可見光譜三類。 分子的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)差一般在0.0050.05eV。產(chǎn)生此能級(jí)的躍遷，需吸收波長約為250 25的遠(yuǎn)紅外光，因此，形成的光譜稱為轉(zhuǎn)動(dòng)光譜或遠(yuǎn)紅外光譜。 分子的振動(dòng)能級(jí)差一般在0.05 1 eV，需吸收波長約為25 1.25mm的紅外光才能產(chǎn)生躍遷。在分子振動(dòng)時(shí)同時(shí)有分子的轉(zhuǎn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)。這樣，分子振動(dòng)產(chǎn)生的吸收光譜中，包括轉(zhuǎn)動(dòng)光譜，故常稱為振-轉(zhuǎn)光譜。由于它吸收的能量處于紅外光區(qū)，故又稱紅外光譜。電子的躍遷能差約為1 20 eV，比分子振動(dòng)能級(jí)差要大幾十倍，所吸收光的波長約為12.5 0.06mm，主要在真空紫外到可見光區(qū)，對(duì)應(yīng)形成的光譜，稱為電子光譜或紫外、可見吸收光譜。 通常，分子是處在基態(tài)振動(dòng)能級(jí)上。當(dāng)用紫外、可見光照射分子時(shí)，電子可以從基態(tài)激發(fā)到激發(fā)態(tài)的任一振動(dòng)（或不同的轉(zhuǎn)動(dòng)）能級(jí)上。因此，電子能級(jí)躍遷產(chǎn)生的吸收光譜，包括了大量譜線，并由于這些譜線的重疊而成為連續(xù)的吸收帶，這就是為什么分子的紫外、可見光譜不是線狀光譜，而是帶狀光譜的原因。又因?yàn)榻^大多數(shù)的分子光譜分析，都是用液體樣品，加之儀器的分辨率有限，因而使記錄所得電子光譜的譜帶變寬。由于氧、氮、二氧化碳、水等在真空紫外區(qū)（60 200 nm）均有吸收，因此在測定這一范圍的光譜時(shí)，必須將光學(xué)系統(tǒng)抽成真空，然后充以一些惰性氣體，如氦、氖、氬等。鑒于真空紫外吸收光譜的研究需要昂貴的真空紫外分光光度計(jì)，故在實(shí)際應(yīng)用中受到一定的限制。我們通常所說的紫外可見分光光度法，實(shí)際上是指近紫外、可見分光光度法。3、 紫外-可見吸收光譜的特征及其表示方法紫外可見吸收光譜是由分子中的電子能級(jí)躍遷而產(chǎn)生的，位于可見紫外區(qū)，可用紫外可見光光度計(jì)進(jìn)行測定。將不同波長的的光一次通過一定濃度的被測物，并分別測定不同波長的吸光度，以波長作為橫坐標(biāo)，一吸光度作為縱坐標(biāo)所得的吸光度波長曲線，及吸收光譜（見圖9-2）。 圖9-2 不同濃度的KMnO4紫外吸收曲線 吸收光譜示意圖1-吸收峰；2-谷；3-肩峰；4-末端吸收 吸收光譜又稱吸收曲線，從9-2圖可以看出它的特征：曲線1處稱最大吸收峰，它所對(duì)應(yīng)的波長稱最大吸收波長（max)。在曲線2處有一個(gè)谷稱最小吸收，它所對(duì)應(yīng)的波長，稱最小吸收波長（min)。在1峰旁3處有一小峰，稱肩峰。在吸收曲線最短的一端，吸收較強(qiáng)但未形成峰形成峰部分，稱為末端吸收。吸收曲線的橫坐標(biāo)，一般用波長（或頻率）表示。一定的波長對(duì)應(yīng)一定的能量。不同物質(zhì)的分子由于結(jié)構(gòu)不同，發(fā)生越前時(shí)吸收光的能量也不相同，即吸收峰的位置也不同。所以吸收曲線在橫坐標(biāo)的位置可作為分子結(jié)構(gòu)的表征，是定型的主要依據(jù)。max是化合物中電子能級(jí)躍遷時(shí)吸收的特征波長，對(duì)鑒定化合物尤為重要；整個(gè)吸收光譜的形狀決定于物質(zhì)性質(zhì)，反應(yīng)分子內(nèi)部能級(jí)分布情況是物質(zhì)定性的依據(jù)。 四、紫外-可見分光光度法的特點(diǎn)1. 靈敏度高。由于相應(yīng)學(xué)科的發(fā)展，使新的有機(jī)顯色劑的合成和研究取得可喜的進(jìn)展，從而對(duì)元素測定的靈敏度大大提高了一步。特別是由于多元絡(luò)合物和各種表面活性劑的應(yīng)用研究，使許多元素的摩爾吸光系數(shù)由原來的幾萬提高到幾十萬。相對(duì)于其它痕量分析方法而言，光度法的精密度和準(zhǔn)確度一致公認(rèn)是比較高的。不但在實(shí)際工作中光度法被廣泛采用，在標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)的研制中，它更受重視，很多光度分析法已制定成為標(biāo)準(zhǔn)方法。2. 選擇性好。目前已有些元素只要利用控制適當(dāng)?shù)娘@色條件就可直接進(jìn)行光度法測定，如鈷、鈾、鎳、銅、銀、鐵等元素的測定，已有比較滿意的方法了。另外，在多組分共存的溶液中，可以畢竟分離而測定某種預(yù)定測組分。3. 通用性強(qiáng)，應(yīng)用廣泛。不僅可用于無機(jī)化合物的分析測定，更重要的是由于許多有機(jī)化合物在紫外光區(qū)具有特征的吸收光譜，因而用來進(jìn)行有機(jī)化合物的鑒定及其結(jié)構(gòu)分析。分析由于各種各樣的無機(jī)物和有機(jī)物在紫外可見區(qū)都有吸收，因此均可借此法加以測定。到目前為止，幾乎化學(xué)元素周期表上的所有元素（除少數(shù)放射性元素和惰性元素之外）均可采用此法。4. 設(shè)備和操作簡單，價(jià)格低廉，分析速度快。廣泛地應(yīng)用于化工、冶金、地質(zhì)、醫(yī)學(xué)、食品、制藥等部門及環(huán)境監(jiān)測系統(tǒng)。單在水質(zhì)分析中的應(yīng)用就很廣，目前能用直接法和間接法測定的金屬和非金屬元素就有七十多種。所涉及的水樣包括雨水、泉水、井水、飲用水、江水、湖水、河水、海水以及各種廢水等。光度法比較成熟，可測元素多，靈活性強(qiáng)。有些大型儀器不易解決的分析問題，光度法可以發(fā)揮作用。在有機(jī)分析中，紫外-可見光譜(UV-VIS)可作定量測定外，在定性分析和結(jié)構(gòu)分析方面，它可作為紅外光譜(IR)、核磁共振(NMR)、質(zhì)譜(MS)等方法的輔助手段。5. 準(zhǔn)確度較好。對(duì)于一般的分光光度法來說，其濃度測量的相對(duì)誤差在1-3%范圍內(nèi)，如采用示差分光度法測量，則誤差往往可減少到千分之幾。但僅適應(yīng)于微量成分的測定二不適應(yīng)于中、高含量的測定。6. 紫外-可見分光光度分析法的局限性。很多有機(jī)化合物在紫外光區(qū)沒有吸收或吸收不強(qiáng)烈。也有些有機(jī)化合物在紫外光區(qū)的吸收過于簡單，缺少驚喜結(jié)構(gòu)，因而不足用來作為鑒定的依據(jù)。但作為物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的一種手段，紫外-可見分光光度分析法應(yīng)具有一定的實(shí)用意義。在國際上發(fā)表的有關(guān)分析的論文總數(shù)中，光度法約占28%，我國約占所發(fā)表論文總數(shù)的33%。由于各種各樣的無機(jī)物和有機(jī)物在紫外-可見區(qū)域都有吸收，因此均可借此方法加以測定。到目前為止，幾乎周期表上的所有元素（除少數(shù)放射性元素和惰性氣體外）均可采用本法測定。在國際上，將1985-1989年分析儀器的世界銷售額按31大類進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，其中UV VIS分光光度計(jì)一直占有5-6%的份額，排名第五。由于光度計(jì)的價(jià)格相對(duì)比較低廉，故若以儀器銷售的臺(tái)數(shù)技術(shù)的話，則分光光度計(jì)將排在第二位。儀器的銷售情況可以從側(cè)面反映各類分析儀器在實(shí)際使用中的廣泛和頻繁程度。 紫外-可見分光光度法在藥物分析中的應(yīng)用歷來受到大家的廣泛關(guān)注和重視,世界各國都進(jìn)行這一領(lǐng)域的相關(guān)研究。據(jù)統(tǒng)計(jì),在藥物分析中，分光光度法占29.1%，色譜法占25.5%，熒光、化學(xué)發(fā)光法占2.4%，與光度法有關(guān)的方法共計(jì)占31.5%，由此可見，紫外-可見分光光度法是藥物分析最常用的方法之一。研究結(jié)果表明，紫外-可見光度法在藥物分析中的可靠性可以和色譜法相蓖美，但其設(shè)備簡單、操作方便、價(jià)格低廉、易于普及等特點(diǎn)是色譜法難于做到的。因此，可以相信，光度法在藥物分析中將大有作為。 紫外可見分光光度法在醫(yī)藥方面的應(yīng)用第二節(jié) 化合物紫外可見光譜的產(chǎn)生在紫外和可見光譜區(qū)范圍內(nèi)，有機(jī)化合物的吸收帶主要由ss*、pp*、ns*、np*及電荷遷移躍遷產(chǎn)生。無機(jī)化合物的吸收帶主要由電荷遷移和配位場躍遷（即dd躍遷和ff躍遷）產(chǎn)生。 由于電子躍遷的類型不同，實(shí)現(xiàn)躍遷需要的能量不同，因此吸收光的波長范圍也不相同。其中ss*躍遷所需能量最大，np*及配位場躍遷所需能量最小，因此，它們的吸收帶分別落在遠(yuǎn)紫外和可見光區(qū)。從圖中可知，pp*（電荷遷移）躍遷產(chǎn)生的譜帶強(qiáng)度最大，ss*、np*、ns*躍遷產(chǎn)生的譜帶強(qiáng)度次之，（配位躍遷的譜帶強(qiáng)度最?。?。一、有機(jī)化合物的紫外可見吸收光譜（一）、躍遷類型 基態(tài)有機(jī)化合物的價(jià)電子包括成鍵電子、成鍵電子和非鍵電子（以 n表示）。分子的空軌道包括反鍵s*軌道和反鍵p*軌道，因此，可能的躍遷為ss*、pp*、ns* np*等。 1. ss*躍遷 它需要的能量較高，一般發(fā)生在真空紫外光區(qū)。飽和烴中的CC鍵屬于這類躍遷，例如乙烷的最大吸收波長max為135nm。 2. ns*躍遷 實(shí)現(xiàn)這類躍遷所需要的能量較高，其吸收光譜落于遠(yuǎn)紫外光區(qū)和近紫外光區(qū)，如CH3OH和CH3NH2的ns*躍遷光譜分別為183nm和213nm。 3. pp*躍遷 它需要的能量低于*躍遷，吸收峰一般處于近紫外光區(qū)，在200 nm左右，其特征是摩爾吸光系數(shù)大，一般max104，為強(qiáng)吸收帶。如乙烯（蒸氣）的最大吸收波長max為162 nm。 4. np*躍遷 這類躍遷發(fā)生在近紫外光區(qū)。它是簡單的生色團(tuán)如羰基、硝基等中的孤對(duì)電子向反鍵軌道躍遷。其特點(diǎn)是譜帶強(qiáng)度弱，摩爾吸光系數(shù)小，通常小于100，屬于禁阻躍遷。 5. 電荷遷移躍遷 所謂電荷遷移躍遷是指用電磁輻射照射化合物時(shí)，電子從給予體向與接受體相聯(lián)系的軌道上躍遷。因此，電荷遷移躍遷實(shí)質(zhì)是一個(gè)內(nèi)氧化還原的過程，而相應(yīng)的吸收光譜稱為電荷遷移吸收光譜。例如某些取代芳烴可產(chǎn)生這種分子內(nèi)電荷遷移躍遷吸收帶。電荷遷移吸收帶的譜帶較寬，吸收強(qiáng)度較大，最大波長處的摩爾吸光系數(shù)max可大于104。 （二）、常用術(shù)語 1. 生色團(tuán) 從廣義來說，所謂生色團(tuán)，是指分子中可以吸收光子而產(chǎn)生電子躍遷的原子基團(tuán)。但是，人們通常將能吸收紫外、可見光的原子團(tuán)或結(jié)構(gòu)系統(tǒng)定義為生色團(tuán)。 2. 助色團(tuán) 助色團(tuán)是指帶有非鍵電子對(duì)的基團(tuán)，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它們本身不能吸收大于200nm的光，但是當(dāng)它們與生色團(tuán)相連時(shí)，會(huì)使生色團(tuán)的吸收峰向長波方向移動(dòng)，并且增加其吸光度。 3. 紅移與藍(lán)移（紫移）某些有機(jī)化合物經(jīng)取代反應(yīng)引入含有未共享電子對(duì)的基團(tuán)（ -OH、 -OR、 -NH2、-SH 、-Cl、-Br、-SR、- NR2 ）之后，吸收峰的波長將向長波方向移動(dòng)，這種效應(yīng)稱為紅移效應(yīng) 這種會(huì)使某化合物的最大吸收波長向長波方向移動(dòng)的基團(tuán)稱為向紅基團(tuán)。 在某些生色團(tuán)如羰基的碳原子一端引入一些取代基之后，吸收峰的波長會(huì)向短波方向移動(dòng)，這種效應(yīng)稱為藍(lán)移（紫移）效應(yīng)。這些會(huì)使某化合物的最大吸收波長向短波方向移動(dòng)的基團(tuán)（如-CH2、-CH2CH3、-OCOCH3）稱為向藍(lán)（紫）基團(tuán)。 (三) 有機(jī)化合物紫外-可見吸收光譜 1. 飽和烴及其取代衍生物 飽和烴類分子中只含有s鍵，因此只能產(chǎn)生ss*躍遷，即s電子從成鍵軌道（ s）躍遷到反鍵軌道（ s*）。飽和烴的最大吸收峰一般小于150nm，已超出紫外、可見分光光度計(jì)的測量范圍。 飽和烴的取代衍生物如鹵代烴，其鹵素原子上存在n電子，可產(chǎn)生ns*的躍遷。ns*的能量低于ss*。例如，CH3Cl、CH3Br和CH3I的ns*躍遷分別出現(xiàn)在173、204和258nm處。這些數(shù)據(jù)不僅說明氯、溴和碘原子引入甲烷后，其相應(yīng)的吸收波長發(fā)生了紅移，顯示了助色團(tuán)的助色作用。直接用烷烴和鹵代烴的紫外吸收光譜分析這些化合物的實(shí)用價(jià)值不大。但是它們是測定紫外和（或）可見吸收光譜的良好溶劑。 2. 不飽和烴及共軛烯烴 在不飽和烴類分子中，除含有s鍵外，還含有p鍵，它們可以產(chǎn)生ss*和pp*兩種躍遷。 ss*躍遷的能量小于pp*躍遷。例如，在乙烯分子中， pp*躍遷最大吸收波長為180nm。在不飽和烴類分子中，當(dāng)有兩個(gè)以上的雙鍵共軛時(shí)，隨著共軛系統(tǒng)的延長， pp*躍遷的吸收帶 將明顯向長波方向移動(dòng)，吸收強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。在共軛體系中，pp*躍遷產(chǎn)生的吸收帶又稱為K帶。 3. 羰基化合物 羰基化合物含有C=O基團(tuán)。 C=O基團(tuán)主要可產(chǎn)生pp*、ns*、np*三個(gè)吸收帶，np*吸收帶又稱R帶，落于近紫外或紫外光區(qū)。醛、酮、羧酸及羧酸的衍生物，如酯、酰胺等，都含有羰基。由于醛酮這類物質(zhì)與羧酸及羧酸的衍生物在結(jié)構(gòu)上的差異，因此它們np*吸收帶的光區(qū)稍有不同。 羧酸及羧酸的衍生物雖然也有np*吸收帶，但是， 羧酸及羧酸的衍生物的羰基上的碳原子直接連結(jié)含有未共用電子對(duì)的助色團(tuán)，如-OH、-Cl、-OR等，由于這些助色團(tuán)上的n電子與羰基雙鍵的電子產(chǎn)生np*共軛，導(dǎo)致p*軌道的能級(jí)有所提高，但這種共軛作用并不能改變n軌道的能級(jí)，因此實(shí)現(xiàn)np*躍遷所需的能量變大，使np*吸收帶藍(lán)移至210nm左右。 4. 苯及其衍生物 苯有三個(gè)吸收帶，它們都是由pp*躍遷引起的。E1帶出現(xiàn)在185nm（max= 68000）； E2帶出現(xiàn)在204nm（ max = 8800 ）；B帶出現(xiàn)在230270nm （max= 200）。在氣態(tài)或非極性溶劑中，苯及其許多同系物的B譜帶有許多的精細(xì)結(jié)構(gòu)，這是由于振動(dòng)躍遷在基態(tài)電子上的躍遷上的疊加而引起的。在極性溶劑中，這些精細(xì)結(jié)構(gòu)消失。當(dāng)苯環(huán)上有取代基時(shí)，苯的三個(gè)特征譜帶都會(huì)發(fā)生顯著的變化，其中影響較大的是E2帶和B譜帶。 5. 稠環(huán)芳烴及雜環(huán)化合物 稠環(huán)芳烴，如奈、蒽、芘等，均顯示苯的三個(gè)吸收帶，但是與苯本身相比較，這三個(gè)吸收帶均發(fā)生紅移，且強(qiáng)度增加。隨著苯環(huán)數(shù)目的增多，吸收波長紅移越多，吸收強(qiáng)度也相應(yīng)增加。當(dāng)芳環(huán)上的-CH基團(tuán)被氮原子取代后，則相應(yīng)的氮雜環(huán)化合物（如吡啶、喹啉）的吸收光譜，與相應(yīng)的碳化合物極為相似，即吡啶與苯相似，喹啉與奈相似。此外，由于引入含有n電子的N原子的，這類雜環(huán)化合物還可能產(chǎn)生np*吸收帶。常見有機(jī)化合物的生色團(tuán)的紫外吸收峰，見下表： 常見有機(jī)化合物的生色團(tuán)的紫外吸收峰化合物生色團(tuán)lmax/ nm化合物生色團(tuán)lmax/ nm烷烴-C-C-150共軛烯烴 (-C=C-)2210-230烯烴C=C170(-C=C-)3260炔烴-CC-170(-C=C-)5330酰R-C205苯 204醛R-C210255羧酸R-C200-210萘 220硝基化合物-NO270-280275亞硝基化合物-NO220-230314偶氮化合物 -N=N-285-400 二、無機(jī)化合物的紫外-可見吸收光譜 產(chǎn)生無機(jī)化合物紫外、可見吸收光譜的電子躍遷形式，一般分為兩大類：電荷遷移躍遷和配位場躍遷。 （一）電荷遷移躍遷無機(jī)配合物有電荷遷移躍遷產(chǎn)生的電荷遷移吸收光譜。在配合物的中心離子和配位體中，當(dāng)一個(gè)電子由配體的軌道躍遷到與中心離子相關(guān)的軌道上時(shí)，可產(chǎn)生電荷遷移吸收光譜。不少過度金屬離子與含生色團(tuán)的試劑反應(yīng)所生成的配合物以及許多水合無機(jī)離子，均可產(chǎn)生電荷遷移躍遷。此外，一些具有d10電子結(jié)構(gòu)的過度元素形成的鹵化物及硫化物，如AgBr、HgS等，也是由于這類躍遷而產(chǎn)生顏色。電荷遷移吸收光譜出現(xiàn)的波長位置，取決于電子給予體和電子接受體相應(yīng)電子軌道的能量差。 （二）配位場躍遷 配位場躍遷包括d - d 躍遷和f - f 躍遷。元素周期表中第四、五周期的過度金屬元素分別含有3d和4d軌道，鑭系和錒系元素分別含有4f和5f軌道。在配體的存在下，過度元素五個(gè)能量相等的d軌道和鑭系元素七個(gè)能量相等的f軌道分別分裂成幾組能量不等的d軌道和f軌道。當(dāng)它們的離子吸收光能后，低能態(tài)的d電子或f電子可以分別躍遷至高能態(tài)的d或f軌道，這兩類躍遷分別稱為d - d 躍遷和f - f 躍遷。由于這兩類躍遷必須在配體的配位場作用下才可能發(fā)生，因此又稱為配位場躍遷。三、影響紫外可見吸收光譜的影響譜帶位移包括藍(lán)移（或紫移，hypsochromic shift or blue shift)和紅移(bathochromic shift or red shift)。藍(lán)移（或紫移）指吸收峰向短波長移動(dòng)，紅移指吸收峰向長波長移動(dòng)。吸收峰強(qiáng)度變化包括增色效應(yīng)(hyperchromic effect)和減色效應(yīng)(hypochromic effect)。前者指吸收強(qiáng)度增加，后者指吸收強(qiáng)度減小。 試樣的化學(xué)環(huán)境對(duì)譜帶的波長位移及強(qiáng)度變化有著重要的影響，其中對(duì)譜帶位移產(chǎn)生較大影響的主要有酸度和溶劑效應(yīng)。 1.酸度的影響：由于酸度的變化會(huì)使有機(jī)化合物的存在形式發(fā)生變化，從而導(dǎo)致譜帶的位移，例如苯酚 隨著pH值的增高，譜帶就會(huì)紅移，吸收峰分別從211 nm和270 nm位移到236 nm和287nm。又如苯胺 隨著pH值的降低，譜帶會(huì)藍(lán)移，吸收峰分別從230 nm和280 nm處位移到203 nm和254 nm處。另外酸度的變化還會(huì)影響到絡(luò)合平衡，從而造成有色絡(luò)合物的組成發(fā)生變化，而使得吸收帶發(fā)生位移，例如Fe (III) 與磺基水楊酸的絡(luò)合物，在不同pH時(shí)會(huì)形成不同的絡(luò)合比，從而產(chǎn)生紫紅、橙紅、黃色等不同顏色的絡(luò)合物。2. 溶劑對(duì)紫外可見吸收光譜的影響 溶劑對(duì)紫外可見光譜的影響較為復(fù)雜。改變?nèi)軇┑臉O性，會(huì)引起吸收帶形狀的變化。例如，當(dāng)溶劑的極性由非極性改變到極性時(shí)，精細(xì)結(jié)構(gòu)消失，吸收帶變向平滑。改變?nèi)軇┑臉O性，還會(huì)使吸收帶的最大吸收波長發(fā)生變化。下表為溶劑對(duì)亞異丙酮紫外吸收光譜的影響。 名稱正己烷CHCl3 CH3OHH2Opp* max/nm 230238237243n p*max/nm329315309305 由上表可以看出，當(dāng)溶劑的極性增大時(shí)，由n p*躍遷產(chǎn)生的吸收帶發(fā)生藍(lán)移，而由pp* 躍遷產(chǎn)生的吸收帶發(fā)生紅移。因此，在測定紫外、可見吸收光譜時(shí)，應(yīng)注明在何種溶劑中測定。 由于溶劑對(duì)電子光譜圖影響很大，因此，在吸收光譜圖上或數(shù)據(jù)表中必須注明所用的溶劑。與已知化合物紫外光譜作對(duì)照時(shí)也應(yīng)注明所用的溶劑是否相同。在進(jìn)行紫外光譜法分析時(shí)，必須正確選擇溶劑。選擇溶劑時(shí)注意下列幾點(diǎn)： （1）溶劑應(yīng)能很好地溶解被測試樣，溶劑對(duì)溶質(zhì)應(yīng)該是惰性的。即所成溶液應(yīng)具有良好的化學(xué)和光化學(xué)穩(wěn)定性。 （2）在溶解度允許的范圍內(nèi)，盡量選擇極性較小的溶劑。（3） 溶劑在樣品的吸收光譜區(qū)應(yīng)無明顯吸收。 第三節(jié) 光的吸收定律朗伯-比耳定律 一、透射比和吸光度 當(dāng)一束平行光通過均勻的溶液介質(zhì)時(shí)，光的一部分被吸收，一部分被器皿反射。設(shè)入射光強(qiáng)度為I0，吸收光強(qiáng)度為Ia，透射光強(qiáng)度為It，反射光強(qiáng)度為Ir，則 在進(jìn)行吸收光譜分析中，被測溶液和參比溶液是分別放在同樣材料及厚度的兩個(gè)吸收池中，讓強(qiáng)度同為I0的單色光分別通過兩個(gè)吸收池，用參比池調(diào)節(jié)儀器的零吸收點(diǎn)，再測量被測量溶液的透射光強(qiáng)度，所以反射光的影響可以從參比溶液中消除，則上式可簡寫為 透射光強(qiáng)度(It)與入射光強(qiáng)度(I0)之比稱為透射比(亦稱透射率)，用T表示，則有: 溶液的T越大，表明它對(duì)光的吸收越弱；反之，T越小，表明它對(duì)光的吸收越強(qiáng)。為了更明確地表明溶液的吸光強(qiáng)弱與表達(dá)物理量的相應(yīng)關(guān)系，常用吸光度(A)表示物質(zhì)對(duì)光的吸收程度，其定義為: 則A值越大，表明物質(zhì)對(duì)光吸收越強(qiáng)。T及A都是表示物質(zhì)對(duì)光吸收程度的一種量度，透射比常以百分率表示，稱為百分透射比，T；吸光度A為一個(gè)無因次的量，兩者可通過上式互相換算。 二、朗伯-比耳定律 朗伯比耳定律(Lambert-Beer)是光吸收的基本定律，俗稱光吸收定律，是分光光度法定量分析的依據(jù)和基礎(chǔ)。當(dāng)入射光波長一定時(shí)，溶液的吸光度A是吸光物質(zhì)的濃度c及吸收介質(zhì)厚度l(吸收光程)的函數(shù)。朗伯和比耳分別于1760年和1852年研究了這三者的定量關(guān)系。朗伯的結(jié)論是，當(dāng)用適當(dāng)波長的單色光照射一固定濃度的均勻溶液時(shí)，A與l成正比，其數(shù)學(xué)式為: A = kl (此即稱為朗伯定律，k為比例系數(shù) ) 而比耳的結(jié)論是，當(dāng)用適當(dāng)波長的單色光照射一固定液層厚度的均勻溶液時(shí)，A與c成正比，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為: (此即稱為比耳定律，k稱為比例系數(shù)) 合并上述k的數(shù)值取決于吸光物質(zhì)的特性外，其單位及數(shù)值還與c和l所采用的單位有關(guān)。l通常采用cm為單位，并用b表示。所以k的單位取決c采用的單位。 當(dāng)c采用重量單位g/L時(shí)，吸收定律表達(dá)為: (a稱為吸光系數(shù)，單位為) 當(dāng)c采用摩爾濃度mol/L時(shí)，吸收定律表達(dá)為: (稱摩爾吸光系數(shù)，單位為) 當(dāng)一束平行光通過均勻的溶液介質(zhì)時(shí)，光的一部分被吸收，一部分被器皿反射。設(shè)入射光強(qiáng)度為I0，透射光強(qiáng)度為It，溶液的濃度為c，液層的寬度為b，根據(jù)朗伯比爾定律可知他們之間有下列關(guān)系，則圖9-3 輻射吸收示意圖A稱為吸光度（absorbance），吸收度或光密度（OD，optical density），a稱為吸收系數(shù)(absorotiviry)，是化合物分子的特性，它與濃度（c）和光透過介質(zhì)的厚度（b）無關(guān)。當(dāng)c為摩爾濃度，b以厘米為單位，a即以來表示，稱為摩爾吸光系數(shù)或摩爾消光系數(shù)（molar absorptivity）。 如何將朗伯-比耳(Lambert-Beer)定律用于紫外-可見分光光度法？課堂討論按朗伯-比耳Lambert-Beer定律可進(jìn)行定量測定。測量時(shí)盛溶液的吸收池厚度為b，若濃度c已知，測得吸光度A即可計(jì)算出值，即為化合物的物理常數(shù)。若已知值，則由測得的吸光度可計(jì)算溶液的濃度。由上述可見，當(dāng)測定一個(gè)化合物的吸收光譜時(shí)，被吸收光的波長和摩爾吸光系數(shù)的兩個(gè)重要的參數(shù)，前者表示吸收能量的大小，后者反映能級(jí)躍遷的幾率，屬于化合物的特性。3、 偏離光吸收定律的因素定量分析時(shí)通常也曾厚度是相同的，按照朗伯比爾定律，濃度與吸光度之間的關(guān)系應(yīng)該是一條通過直角坐標(biāo)原點(diǎn)的直線。但在實(shí)際工作中，往往會(huì)偏離線性二發(fā)生彎曲。若在彎曲部分進(jìn)行定量，將產(chǎn)生較大的測定誤差。1. 物理因素 朗伯比爾定律只對(duì)一定波長的單色光才能成立，但在實(shí)際工作中，即使質(zhì)量較好的分光光度計(jì)所得的入射光，榮然具有一定波長范圍的波帶寬度。在這種情況下，吸光度與濃度并不完全呈線性關(guān)系，因而導(dǎo)致朗伯比爾定律的偏離。所得入射光的波長范圍越窄，即“單色光”越純，則偏離越小入射光不存或雜散光等的影響；非吸收作用引起的對(duì)朗伯比爾定律的偏離，主要有散射效應(yīng)和熒光效應(yīng)，一般情況下熒光效應(yīng)對(duì)分光光度法產(chǎn)生影響較小。朗伯比爾定律只只適應(yīng)于十分均勻的吸收體系。當(dāng)待測液的體系不是很均勻時(shí)，入射光通過待測液后將產(chǎn)生光的散射而損失，導(dǎo)致吸收體系的透過率減小，造成實(shí)測吸光值增加。朗伯比爾定律是建立在均勻、非散射的溶液的基礎(chǔ)上的。如果戒指不均勻，呈交替、乳濁、懸浮狀態(tài)，則入射光除了被吸收外，還會(huì)有反射、散射的損失，因而實(shí)際測得的吸光度增大，導(dǎo)致對(duì)朗伯比爾定律的偏離；當(dāng)入射光透過待測液，若吸光物質(zhì)分子吸收輻射能后所產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)分子以發(fā)射輻射能的方式回到基態(tài)而發(fā)射熒光，結(jié)果必然使待測液的透光率相對(duì)增大，造成實(shí)測吸光值減小。2. 化學(xué)因素溶質(zhì)的理解、算效應(yīng)、溶劑作用等會(huì)引起朗伯比爾定律的偏離。其中有色化合物的離解是偏離朗伯比爾定律的主要化學(xué)因素。溶液稀釋時(shí)，上述平衡向右，理解度增大。（1） 離解作用。在可見光區(qū)域的分析中常常是將待測組分同某種試劑反應(yīng)成有色配合物來進(jìn)行測定的。有色配合物在水中不可避免的要發(fā)生離解，從而使得有色配合物的濃度要小于待測組分的濃度，導(dǎo)致對(duì)吸收定律的偏離。特別是對(duì)于稀溶液而言，更是如此。（2） 酸效應(yīng)。如果待測組分包括在一種酸堿平衡體系中，溶液的酸度將會(huì)使得待測組分的存在形式發(fā)生變化，二導(dǎo)致對(duì)吸光定律的偏離。（3） 溶劑作用。溶劑對(duì)吸收光譜的影響是比較大的，溶劑不同時(shí)，物質(zhì)的自首光譜也不同。4、 吸光度的加和性如果溶液中含有幾種有幾種彼此之間不相互作用的組分，他們對(duì)某一波長的光都產(chǎn)生吸收，那么該溶液對(duì)該波長總吸收等于溶液中幾種組分的吸光度之和，就也就是說吸光度具有加和性，也可表示為： A總=A1+A2+A3+An=1c1b+2c2b+3c3b+ncnb =（1c1+2c2+3c3+ncn)b 吸光度的加和性對(duì)多組分同時(shí)定量測定，校正干擾等都有很大用處。 第4節(jié) 紫外-可見分光光度計(jì) 1854年，杜包斯克（Duboscq）和奈斯勒（Nessler）等人將分光光度法應(yīng)用于定量分析化學(xué)領(lǐng)域，并且設(shè)計(jì)了第一臺(tái)比色計(jì)。到1918年，美國國家標(biāo)準(zhǔn)局制成了第一臺(tái)紫外可見分光光度計(jì)。此后，紫外可見分光光度計(jì)經(jīng)不斷改進(jìn)，又出現(xiàn)自動(dòng)記錄、自動(dòng)打印、數(shù)字顯示、微機(jī)控制等各類型的儀器，使光度法的靈敏度和準(zhǔn)確度也不斷提高，其應(yīng)用范圍也不斷擴(kuò)大。分光光度計(jì)自生產(chǎn)到目前為止，得到了很大的發(fā)展，類型也很多。國產(chǎn)分光光度計(jì)近十年來已有了很大的發(fā)展，各種檔次的分光光度計(jì)都已更新升級(jí)換代，可見光系列有：721、722、723等型號(hào)，紫外可見光系列有：751、752、753、UV-1800、UV-1801等型號(hào)，主要生產(chǎn)廠為上海分析儀器總廠等。 一、儀器部件介紹紫外-可見分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)是由五個(gè)部分組成：即光源、單色器、吸收池、檢測器和信號(hào)指示系統(tǒng)。其工作原理如圖9-4所示。光源單色器吸收池檢測器信號(hào)顯示、記錄裝置 圖9-4 分光光度計(jì)工作原理圖 1. 光源 對(duì)光源的基本要求是應(yīng)在儀器操作所需的光譜區(qū)域內(nèi)能夠發(fā)射連續(xù)輻射，有足夠的輻射強(qiáng)度和良好的穩(wěn)定性，而且輻射能量隨波長的變化應(yīng)盡可能小。分光光度計(jì)中常用的光源有熱輻射光源和氣體放電光源兩類。 熱輻射光源用于可見光區(qū)，如鎢絲燈和鹵鎢燈；氣體放電光源用于紫外光區(qū)，如氫燈和氘燈。鎢燈和碘鎢燈可使用的范圍在340 2500nm。這類光源的輻射能量與施加的外加電壓有關(guān)，在可見光區(qū)，輻射的能量與工作電壓4次方成正比。光電流與燈絲電壓的n次方（n1）成正比。因此必須嚴(yán)格控制燈絲電壓，儀器必須配有穩(wěn)壓裝置。在近紫外區(qū)測定時(shí)常用氫燈和氘燈。它們可在160 375 nm范圍內(nèi)產(chǎn)生連續(xù)光源。氘燈的燈管內(nèi)充有氫的同位素氘，它是紫外光區(qū)應(yīng)用最廣泛的一種光源，其光譜分布與氫燈類似，但光強(qiáng)度比相同功率的氫燈要大35倍。2. 單色器單色器是能從光源輻射的復(fù)合光中分出單色光的光學(xué)裝置，其主要功能：產(chǎn)生光譜純度高的波長且波長在紫外可見區(qū)域內(nèi)任意可調(diào)。單色器一般由入射狹縫、準(zhǔn)光器（透鏡或凹面反射鏡使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狹縫等幾部分組成。其核心部分是色散元件，起分光的作用。單色器的性能直接影響入射光的單色性，從而也影響到測定的靈敏度度、選擇性及校準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系等。 能起分光作用的色散元件主要是棱鏡和光柵。 棱鏡有玻璃和石英兩種材料。它們的色散原理是依據(jù)不同的波長光通過棱鏡時(shí)有不同的折射率而將不同波長的光分開。由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱鏡只能用于350 3200 nm的波長范圍，即只能用于可見光域內(nèi)。石英棱鏡可使用的波長范圍較寬，可從185 4000nm，即可用于紫外、可見和近紅外三個(gè)光域。 光柵是利用光的衍射與干涉作用制成的，它可用于紫外、可見及紅外光域，而且在整個(gè)波長區(qū)具有良好的、幾乎均勻一致的分辨能力。它具有色散波長范圍寬、分辨本領(lǐng)高、成本低、便于保存和易于制備等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是各級(jí)光譜會(huì)重疊而產(chǎn)生干擾。入射、出射狹縫，透鏡及準(zhǔn)光鏡等光學(xué)元件中狹縫在決定單色器性能上起重要作用。狹縫的大小直接影響單色光純度，但過小的狹縫又會(huì)減弱光強(qiáng)。3. 吸收池 吸收池用于盛放分析試樣，一般有石英和玻璃材料兩種。石英池適用于可見光區(qū)及紫外光區(qū)，玻璃吸收池只能用于可見光區(qū)。為減少光的損失，吸收池的光學(xué)面必須完全垂直于光束方向。在高精度的分析測定中（紫外區(qū)尤其重要），吸收池要挑選配對(duì)。因?yàn)槲粘夭牧系谋旧砦馓卣饕约拔粘氐墓獬涕L度的精度等對(duì)分析結(jié)果都有影響。紫外光譜儀吸收池恰好安排在光電轉(zhuǎn)換前。4. 檢測器 檢測器的功能是檢測信號(hào)、測量單色光透過溶液后光強(qiáng)度變化的一種裝置。常用的檢測器有光電池、光電管和光電倍增管等。 硒光電池對(duì)光的敏感范圍為300800nm，其中又以500 600nm最為靈敏。這種光電池的特點(diǎn)是能產(chǎn)生可直接推動(dòng)微安表或檢流計(jì)的光電流，但由于容易出現(xiàn)疲勞效應(yīng)而只能用于低檔的分光光度計(jì)中。 光電管在紫外-可見分光光度計(jì)上應(yīng)用較為廣泛。 光電倍增管是檢測微弱光最常用的光電元件，它的靈敏度比一般的光電管要高200倍，因此可使用較窄的單色器狹縫，從而對(duì)光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)有較好的分辨能力。5. 信號(hào)指示系統(tǒng) 它的作用是放大信號(hào)并以適當(dāng)方式指示或記錄下來。常用的信號(hào)指示裝置有直讀檢流計(jì)、電位調(diào)節(jié)指零裝置以及數(shù)字顯示或自動(dòng)記錄裝置等。很多型號(hào)的分光光度計(jì)裝配有微處理機(jī)，一方面可對(duì)分光光度計(jì)進(jìn)行操作控制，另一方面可進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。二、儀器的分類分光光度計(jì)可分為三種類型，即單光束分光光度計(jì)、雙光束分光光度計(jì)和雙波長分光光度計(jì)。 1. 單光束分光光度計(jì) 經(jīng)單色器分光后的一束平行光，輪流通過參比溶液和樣品溶液，以進(jìn)行吸光度的測定。這種簡易型分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)簡單，操作方便，維修容易，適用于常規(guī)分析。國產(chǎn)722型、751 型、724型、英國SP500型以及Backman DU-8型等均屬于此類光度計(jì)。圖6 單光束分光光度計(jì)原理圖 2. 雙光束分光光度計(jì) 經(jīng)單色器分光后經(jīng)反射鏡分解為強(qiáng)度相等的兩束光，一束通過參比池，一束通過樣品池。光度計(jì)能自動(dòng)比較兩束光的強(qiáng)度，此比值即為試樣的透射比，經(jīng)對(duì)數(shù)變換將它轉(zhuǎn)換成吸光度并作為波長的函數(shù)記錄下來。雙光束分光光度計(jì)一般都能自動(dòng)記錄吸收光譜曲線。由于兩束光同時(shí)分別通過參比池和樣品池，還能自動(dòng)消除光源強(qiáng)度變化所引起的誤差。這類儀器有國產(chǎn)710型、730型、740型等。圖6 單波長雙光束分光光度計(jì)原理圖 3. 雙波長分光光度計(jì)由同一光源發(fā)出的光被分成兩束，分別經(jīng)過兩個(gè)單色器，得到兩束不同波長（1和2）的單色光；利用切光器使兩束光以一定的頻率交替照射同一吸收池，然后經(jīng)過光電倍增管和電子控制系統(tǒng)，最后由顯示器顯示出兩個(gè)波長處的吸光度差值A(chǔ)A=A(1)-A(2)。對(duì)于多組分混合物、混濁試樣（如生物組織液）分析，以及存在背景干擾或共存組分吸收干擾的情況下，利用雙波長分光光度法，往往能提高方法的靈敏度和選擇性。利用雙波長分光光度計(jì)，能獲得導(dǎo)數(shù)光譜。 圖7 雙波長分光光度計(jì)光路示意圖 三、實(shí)驗(yàn)室常用儀器1. 721型可見分光光度計(jì)721型可見分光光度計(jì)是在72基礎(chǔ)上改進(jìn)而成的，他的結(jié)構(gòu)比72型合理，性能比72型亦有顯著提高，工作波段為360800nm，用鎢絲白熾燈作光源，棱鏡做單色器，采用自準(zhǔn)式光路，用CD-7型真空光電管作為光電轉(zhuǎn)換原件，以場效應(yīng)管作放大器，可測微弱的光電流變化，用微安表作為讀書器。儀器有較高的靈敏度。2. 722型可見分光光度計(jì)與721型可見分光光度計(jì)相比，722型可見分光光度計(jì)不再用指針指示讀數(shù)，變?yōu)閿?shù)字顯示的。對(duì)旋鈕進(jìn)行了改造。也可直接讀出濃度c。3. 751型紫外-可見分光光度計(jì)751型紫外可見分光光度計(jì)是一種波長范圍較寬（2001000nm）、精確度較高的分光光度計(jì)。不僅用于可見光區(qū)，也能用于紫外及近紅外光區(qū)的分析。由光源（鎢絲燈或氫燈）發(fā)出的光線由反射鏡反射，是光線經(jīng)狹縫的下半部和準(zhǔn)光鏡進(jìn)入單色器，經(jīng)棱鏡色散后，由準(zhǔn)光鏡將光聚焦與狹縫上半部而射出，經(jīng)液槽照射于光電管上。由此可見，次一起用同一狹縫作為如光和出光狹縫，他們始終具有相同的寬度。棱鏡和透鏡均用石英材料制成，反光鏡和準(zhǔn)光鏡表面鍍鋁。所以全部系統(tǒng)保證紫外光譜通過。波長范圍在200320nm范圍用氫燈作光源；波長在3201000nm范圍用鎢絲燈作光源。波長在200625nm用藍(lán)敏光電管接收透射光。波長在6251000nm用紅敏光電管接收透射光。吸光度和透光率刻在電位差計(jì)轉(zhuǎn)盤上，而電流計(jì)啟示零作用。4. 9200型紫外-可見分光光度計(jì) 性能優(yōu)良，適應(yīng)。數(shù)字顯示，觸摸顯示，觸摸式鍵，進(jìn)行濃度c直讀，可與打印機(jī)連接。5. 9600型紫外-可見分光光度計(jì)性能優(yōu)良，適應(yīng)。數(shù)字顯示，觸摸顯示，觸摸式鍵，可做多條濃度曲線，從而選擇后進(jìn)行濃度直讀，同時(shí)，也可與打印機(jī)連接。6. 1201型紫外-可見分光光度計(jì)用電腦來進(jìn)行控制儀器，我們需要做的工作就是放樣品?？梢赃M(jìn)行光譜掃描、定量、定性分析。對(duì)數(shù)據(jù)的而處理可以通過軟件來進(jìn)行。7. T6型紫外-可見分光光度計(jì) 雜散光低、穩(wěn)定性出色、軟件靈活升級(jí)；人性化的整體設(shè)計(jì)，可針對(duì)各行各業(yè)定制的測量軟件包；，電腦操作，方法簡單。8. UV-1801型紫外-可見分光光度計(jì) 波長范圍寬，5nm、2nm、1nm、三種光譜帶寬可滿足藥典的嚴(yán)格要求；手動(dòng)寬大四連池；測量方法豐富，具有波長掃描、時(shí)間掃描、多波長測定、多階導(dǎo)數(shù)測定（選）、雙波長（選）、三波長（選），DNA蛋白質(zhì)測量（選）等多種測量方法，可滿足不同測量的要求；同時(shí)，電腦操作，方法簡單。9. UV-1800型紫外-可見分光光度計(jì)優(yōu)良的光學(xué)性能、低雜散光、穩(wěn)定性高、噪音低；樣品室可拆卸不、光源室開放式。同時(shí)，用電腦來進(jìn)行控制儀器，我們需要做的工作就是放樣品?？梢赃M(jìn)行光譜掃描、定量、定性分析。對(duì)數(shù)據(jù)的而處理可以通過軟件來進(jìn)行 以上儀器可供物理、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等學(xué)科進(jìn)行科研或供化學(xué)工業(yè)、食品工業(yè)。制藥工業(yè)、冶金工業(yè)網(wǎng)、環(huán)境保護(hù)部門進(jìn)行各種無知己的定性、定量分析。 第5節(jié) 紫外-可見分光光度法分析條件的選擇 利用紫外可見分光光度法進(jìn)行分析，條件的選擇會(huì)直接影響到實(shí)驗(yàn)效果。所以選擇合適的實(shí)驗(yàn)條件是一項(xiàng)十分重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。一、溶劑選擇原則 （1）不與被測組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 （2）所選溶劑在測定波長范圍內(nèi)無明顯吸收。 （3）溶劑應(yīng)能很好地溶解被測試樣，溶劑對(duì)溶質(zhì)應(yīng)該是惰性的，即所成溶液應(yīng)具有良好的化學(xué)和光學(xué)穩(wěn)定性。 （4）在溶解允許的范圍內(nèi)，盡量選擇極性較小的溶劑。（見第二節(jié)） （5）被測組分在所選的溶劑中有較好的峰形。二、測量條件的選擇選擇適當(dāng)?shù)臏y量條件，是獲得準(zhǔn)確測定結(jié)果的重要途徑。選擇合適的測量條件，可以從下列幾個(gè)方面考慮。 1. 入射波長的選擇 通常是根據(jù)北側(cè)組分的吸收光譜，選擇最強(qiáng)吸收帶的最大吸收波長為入射波長。當(dāng)最強(qiáng)吸收峰的峰形比較尖銳時(shí)，往往選用吸收稍低，峰形稍平坦的次強(qiáng)峰進(jìn)行測定；或者是有干擾時(shí)，則選用靈敏度較低但能避免干擾的入射光，就能獲得滿意的測定結(jié)果。2.狹縫寬度的選擇為了選擇合適的狹縫寬度，應(yīng)以減少狹縫寬度時(shí)試樣的吸光度不再增加為準(zhǔn)。一般來說，狹縫寬度大約是試樣吸收峰半寬度的1/10。3. 吸光度測定范圍的選擇在不同吸光度范圍內(nèi)讀數(shù)會(huì)引起不同程度的誤差，為提高測定準(zhǔn)確度，硬選擇最適宜的吸光度范圍進(jìn)行測定。任何類型的分光光度計(jì)都有一定的誤差，但對(duì)于一臺(tái)分光光度計(jì)來說，透光率讀數(shù)誤差T是一常數(shù)（約為0.2%2%）。但透光率誤差并不能代表結(jié)果誤差，測定結(jié)果誤差常用c/c表示。 由朗伯比爾定律可知 A=-lgT=bc將上式微分整理可得 要使測定的相對(duì)誤差c/c最小，求導(dǎo)取極小得出：當(dāng)T=0.368（A=0.434）時(shí)，c/c最?。?.4%），假設(shè)T=0.5%，將其帶入上式，則可計(jì)算出不同透光率時(shí)濃度相對(duì)誤差c/c，如下表所示。不同透光率時(shí)濃度相對(duì)誤差見下表：T/%Ac/c/%T/%Ac/c/%950.02210.2400.3991.36900.0465.3300.5231.38800.0972.8200.6991.55700.1552.0101.0002.17600.2221.6331.5234.75500.3011.4421.6996.38 由上表可以看出濃度相對(duì)誤差的大小與透光率讀數(shù)范圍有關(guān)。當(dāng)所測吸光度在0.151.00的范圍內(nèi)時(shí)，濃度測量誤差為1.4%2.2%，測量的吸光度過低或過高，誤差都是非常的，因此普通分光光度計(jì)不適于高含量或極低含量物質(zhì)的測定，一般最適宜的測量范圍為0.20.8之間。實(shí)際工作中，可以通過調(diào)節(jié)北側(cè)溶液的濃度，使其在適宜的吸光度范圍。為此，可以從以下兩個(gè)方面考慮：計(jì)算而且控制試樣的稱出量，含量高時(shí)，少取樣或稀釋試液；含量低時(shí)，可多取樣或萃取富集；如果溶液已顯色，則可通過改變吸收池的厚度來調(diào)節(jié)吸光度的大小。4. 參壁溶液的選擇測定試樣溶液的吸光度，需先用殘壁溶液調(diào)節(jié)透光率為100%（或吸光度值為0），以消除其他成分及吸光吃和溶劑等對(duì)光的反射和吸收帶來的測定誤差。殘壁溶液是用于調(diào)節(jié)儀器工作零點(diǎn)的，若選擇不適當(dāng)，對(duì)測量讀數(shù)準(zhǔn)確度和影響較大參比溶液的選擇視分析體系而定，選擇的方法是：（1）溶劑參比。試樣簡單、共存其他成分對(duì)測定波長吸收弱，只考慮消除溶劑與吸收池等因素。（2）試樣參比。如果試樣基體溶液在測定波長有吸收，而顯色劑不與試樣基體顯色時(shí)，可按與顯色反應(yīng)相同的條件處理試樣，只是補(bǔ)加入顯色劑。（3） 試劑參比。如果繳入試劑或其他試劑在測定波長有吸收，按顯色反應(yīng)相同的條件，不加入試樣，同樣加入試劑和溶劑作為參比溶液。（4） 平行曹鎖參比。用不含北側(cè)組分的試樣，在相同條件下與被測試樣同時(shí)進(jìn)行處理，由此得到平行操作參比溶液。此外，對(duì)吸收池厚度、透光率、儀器波長、讀數(shù)刻度等應(yīng)進(jìn)行校正。三、反應(yīng)條件的選擇在分光光度分析中，將試樣中被測組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的化學(xué)反應(yīng)叫顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)可分為兩大類，配位反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)，而配位反應(yīng)是最主要的顯色反應(yīng)。與被測組分化合車固有色物質(zhì)的試劑稱為顯色劑。同一被測組分?？膳c若干種顯色劑反應(yīng)，生成多種有色化合物，其原理和靈敏度亦有差別。一種北側(cè)組分究竟應(yīng)該用哪種顯色反應(yīng)，可根據(jù)所需標(biāo)準(zhǔn)加以選擇。（1） 顯色劑的選擇 1.選擇性好所用的顯色劑僅與被測組分顯色，而與其他共存組分不顯色，或者其他組分干擾容易被消除，或者顯色劑與被測組分和干擾離子生成的有色化合物的吸收峰相隔較遠(yuǎn)。2. 靈敏度要足夠高靈敏度高的顯色反應(yīng)有利于微量組分的測定。靈敏度的高低，可由摩爾吸光系數(shù)值得大小來判定。摩爾吸光系數(shù)值越大，靈敏度越高。但應(yīng)注意，靈敏度高的顯色反應(yīng)，并不一定選擇性好；對(duì)于搞含量的組分，不一定要選用靈敏度高的顯色反應(yīng)。3. 有色配合物的組成要恒定顯色劑與被測物質(zhì)的反應(yīng)要定量進(jìn)行，生成有色配合物的組成要恒定。化學(xué)性質(zhì)要穩(wěn)定，有色化合物的組成若不符合一定的化學(xué)式，測定的再現(xiàn)性就差。4. 生成的有色配合物穩(wěn)定性好生成的有色配合物穩(wěn)定性要好，既要求配合物有較大的穩(wěn)定常數(shù)，有色配合物不易受外界環(huán)境的影響，亦不受溶液中其他化學(xué)因素的影響。有較好的重現(xiàn)性，結(jié)果才準(zhǔn)確。5. 色差大有色配合物與顯色劑之間的顏色差別要大，試樣試劑空白小，顯色時(shí)顏色變化才明顯。通常把兩種有色物質(zhì)最大吸收波長之差稱為“比色度”。一般要求有色配合物與顯色劑之間的對(duì)比度在60nm以上。6. 顯色反應(yīng)的條件要易于控制如果條件要求過于苛刻，難以控制，測定結(jié)果的再現(xiàn)性就差。顯色劑一般分為無機(jī)顯色劑和有機(jī)顯色劑兩大類。許多無機(jī)顯色劑能與金屬離子起顯色反應(yīng)，如Cu