鏈霉菌的基因組及其抗生素生物合成基因研究

鏈霉菌的基因組及其抗生素生物合成基因研究吳雪昌浙江大學(xué)遺傳學(xué)研究所InstituteofGeneticsZhejiangUniversity 鏈霉菌是一類主要來源于土壤的革蘭氏陽性菌 約占土壤可培養(yǎng)微生物的1 20 在系統(tǒng)生物學(xué)上它歸于鏈霉菌屬 Streptomyces 鏈霉菌屬中的鏈霉菌 迄今有約500個種 它與其它原核生物相比 鏈霉菌具有比較復(fù)雜的形態(tài)結(jié)構(gòu) 生活周期與遺傳特性 其重要特點之一是具有豐富的次級代謝多樣性 在已知的微生物所產(chǎn)生的抗生素中 約2 3由放線菌產(chǎn)生 而其中的80 來源于鏈霉菌 可見鏈霉菌在醫(yī)藥上的重要性 鏈霉菌由于它與我們?nèi)祟惤】档拿芮嘘P(guān)系及商業(yè)上的重要價值而成為當(dāng)代生命科學(xué)中的研究熱點之一 下面擇幾個較重要問題加以探討 一 鏈霉菌的基因組 Genome 2002年5月 BentleyS D 等在英國自然雜志 Nature417 141 147 2002 以 CompletegenomesequenceofthemodelactinomyceteStreptomycescoelicolorA3 2 為題 報道了鏈霉菌的模式種天藍(lán)色鏈霉菌 Streptomycescoelicolor A3 2 菌株的基因組全序列研究結(jié)果 這為鏈霉菌的后基因組研究奠定了基礎(chǔ) 它將有力地推動鏈霉菌抗生素生物合成基因的結(jié)構(gòu) 功能與表達(dá)調(diào)控的研究 從而將加速通過基因工程構(gòu)建高產(chǎn)抗生素工業(yè)菌株的研究進(jìn)程 這一研究計劃共有44位學(xué)者參與完成 涉及四個單位 主要完成單位是WellcomeTrustSangerInstitute Hinxton Cambridge UK 世界著名的鏈霉菌遺傳學(xué)學(xué)者D A Hopwood及他所在的JohnInnesCenter Norwich UK 也參與了研究 參與研究的還有Departmentofchemistry UniversityofWarwich Coventry UK 我國臺灣的InstituteofGenetics NationalYang MingUniversity也有一位學(xué)者 C W Chen 參與了這一計劃的研究工作 1 已公布的鏈霉菌的基因組的基本信息見Table1 表 從上表可見 鏈霉菌的基因組是目前已完成測序的原核生物基因組中生物信息量較大的基因組之一 生物信息量排名第二 比大腸桿菌 E coliK124639221bp 的基因組大近一倍 最大的為Bradyrhizobiumjaponicum nt 9105828bp 目前已完成測序94個細(xì)菌菌株 涉及51個細(xì)菌屬 鏈霉菌基因組見下圖 二 鏈霉菌抗生素生物合成相關(guān)基因簇研究已知 鏈霉菌抗生素生物合成相關(guān)基因在鏈霉菌細(xì)胞中有兩種存在方式 一是大多數(shù)抗生素其生物合成基因存在于染色體上 二是少數(shù)抗生素的生物合成基因存在于游離狀態(tài)的質(zhì)粒上 如天藍(lán)色鏈霉菌3 2 菌株中的次甲霉素 Methylenomycin 的生物合成基因位于SCP 1 質(zhì)粒上 鏈霉菌抗生素生物合成相關(guān)基因在染色體或質(zhì)粒上往往成簇排列 構(gòu)成基因簇 Genecluster 包括抗生素的生物合成基因 耐藥基因 轉(zhuǎn)運基因和調(diào)節(jié)基因 而耐藥 轉(zhuǎn)運與調(diào)節(jié)基因三者大多與抗生素生物合成基因緊密連鎖并存在一種協(xié)同調(diào)節(jié)機(jī)制 例如目前用于治療急性白血病 Leukemia 與淋巴瘤 Lymphomas 有良好療效的阿克拉霉素 Aclacinomycin 它是由Streptomycesgalilaeus合成的聚酮類化合物 其合成酶的生物合成涉及13個基因 緊密成簇排列 請見下圖與表 Gene203 1 9 鏈霉菌抗生素生物合成相關(guān)基因在染色體或質(zhì)粒上成簇排列的特性 為我們研究這些基因的結(jié)構(gòu) 調(diào)控表達(dá)與進(jìn)行基因克隆提供了方便 但是也帶來了一些問題 例如其中某一個基因一旦發(fā)生突變 有時往往要影響到鄰近基因的調(diào)控表達(dá)效率甚至關(guān)閉表達(dá) 這也可能是導(dǎo)致抗生素生產(chǎn)菌株常常表現(xiàn)出生產(chǎn)性能不穩(wěn)定 效價達(dá)到一定水平后 進(jìn)一步提高其發(fā)酵效價就十分艱難的重要原因之一 三 鏈霉菌抗生素抗性 耐藥 基因 Antibioticresistancegene 抗生素普遍存在于環(huán)境中 尤其是土壤環(huán)境中 對細(xì)菌的生存造成了壓力 在長期的進(jìn)化過程中 抗生素耐藥基因在細(xì)菌中已經(jīng)普遍存在 這是自然選擇的結(jié)果 在非抗生素產(chǎn)生菌中 抗生素耐藥基因的表達(dá)主要是為了應(yīng)對環(huán)境的抗生素壓力 而對某些產(chǎn)抗生素鏈霉菌而言 除了受到環(huán)境中的抗生素壓力外 還首當(dāng)其沖地受到自身所產(chǎn)生的抗生素的更強(qiáng)的壓力 在長期的進(jìn)化中 這些鏈霉菌也被認(rèn)為是通過自然選擇積累了相應(yīng)的抗生素耐藥基因和調(diào)節(jié)基因 以保護(hù)自身免受這些高濃度的致命代謝物的傷害 而這些基因又被認(rèn)為是病原細(xì)菌獲得性耐藥因子的最初來源 產(chǎn)抗菌株存在抗性基因 這不難理解 研究發(fā)現(xiàn) 產(chǎn)抗菌株不僅存在抗性基因 而且抗性基因還參與了抗生素的生物合成與調(diào)控 以確?？股啬退幮缘募皶r表達(dá) 從而免受自身抗生素的傷害 研究還發(fā)現(xiàn) 產(chǎn)抗菌株的抗性水平與該菌株自身的產(chǎn)抗水平呈正相關(guān) 這就使研究者們很快設(shè)想到 提高產(chǎn)抗菌株存在的耐藥水平 就會提高菌株的產(chǎn)抗生素水平 因此 對產(chǎn)抗菌株的抗性基因的結(jié)構(gòu) 表達(dá)調(diào)控研究 在理論與工農(nóng)醫(yī)實踐上均有重要的意義而成為研究熱點之一 到目前為止 已揭示了一些基本規(guī)律 也開展了有一定成效的應(yīng)用研究 1 在產(chǎn)抗生素的鏈霉菌中 耐藥基因一般與抗生素合成基因緊密連鎖 而大部分抗生素合成基因簇位于染色體DNA上 因而與合成基因連鎖的耐藥基因也存在于染色體DNA上 到目前為止所發(fā)現(xiàn)的抗生素合成基因簇中只有位于SCP1質(zhì)粒上的次甲霉素基因簇是一個例外 抗生素耐藥基因可以脫離抗生素合成基因簇而單獨存在于質(zhì)粒上 隨質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散 2 抗生素耐藥基因的抗抗生素種類 選擇性 與其位置有關(guān) 抗生素耐藥基因?qū)股氐倪x擇性不同 其中具有較強(qiáng)的抗生素選擇性耐藥基因往往與抗生素合成基因成簇存在 而表達(dá)多種抗生素耐藥性的基因則不與抗生素合成基因成簇存在 如始旋鏈霉菌 S pristinaespiralis 能夠合成鏈陽菌素類抗生素原霉素 Pristinamycin 它是兩種結(jié)構(gòu)不同的分子的混合物 即原霉素 環(huán)形十六肽 和原霉素 多不飽和大環(huán)內(nèi)酯 從始旋鏈霉菌中克隆的原霉素耐藥基因Ptr能夠編碼膜轉(zhuǎn)運蛋白 Ptr在淺青紫鏈霉菌表達(dá)時 不僅可以提高對原霉素 和 的耐藥性 還可以提高利福平耐藥性 Ptr獨立于原霉素合成基因簇而存在 3 耐藥基因可能是抗生素合成基因簇的一部分 在抗生素合成過程中起限速作用 在吸水鏈霉菌 S hydroscopicus 中 與抗生素bialaphos合成基因緊密連鎖的耐藥基因bar所編碼的產(chǎn)物與bialaphos生物合成途徑第10步所需的乙酸基轉(zhuǎn)移酶相同 bar可能是bialaphos生物合成途徑的一部分 4 耐藥水平與抗生素合成水平呈正相關(guān) 抗生素產(chǎn)生能力的提高應(yīng)該是抗生素合成調(diào)控基因的超量表達(dá) 這說明表達(dá)抗生素耐藥性的酶是抗生素生物合成途徑的限速酶 Fernandez從普卡霉素產(chǎn)生菌S argillaceus中分離的2個普卡霉素耐藥基因mtmG 和mtmG 分別編碼普卡霉素生物合成過程中所必需的糖基轉(zhuǎn)移酶和葡萄糖醛酸苷轉(zhuǎn)移酶 分別將這2個基因通過基因置換失活后 高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)變異株失去了合成普卡霉素的能力 但積累了普卡霉素生物合成途徑中的中間產(chǎn)物 5 在抗生素耐藥機(jī)制方面 在細(xì)菌中 至少存在以下幾種抗生素耐藥機(jī)制 1 合成鈍化抗生素的酶 如弗氏鏈霉菌的氨基糖在耐藥性主要通過產(chǎn)生催化抗生素共價修飾的酶 2 改變細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu) 如胰蛋白的缺失或變異 內(nèi)膜滲透性的改變等 3 通過主動排出機(jī)制降低細(xì)胞內(nèi)的抗生素積累 如抗生鏈霉菌 S antibioticus oleC基因所控制的竹桃霉素主動外排 4 改變核糖體靶位 如從卡那霉素產(chǎn)生菌卡那霉素鏈霉菌 S kanamyceticus 中分離得到的一種誘導(dǎo)性卡那霉素耐藥基因 通過修飾核糖體 調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成 可以賦子淺青紫鏈霉菌 S lividans 淡紫灰鏈霉菌 S lavendulae 和微小鏈霉菌 S parvulus 卡那霉素耐藥性 5 改變靶酶 如青霉素結(jié)合蛋白 6 過量合成靶酶 7 存在抗生素抑制的旁路 四 產(chǎn)抗鏈霉菌的基因工程隨著對抗生素生物合成基因以及調(diào)控基因的深入了解 人們已可以在分子水平上改造鏈霉菌使它們過量合成抗生素或改造抗生素的結(jié)構(gòu)獲得新功效抗生素 目前提高產(chǎn)抗鏈霉菌產(chǎn)抗水平的基因工程所采用的主要策略與有關(guān)基因克隆實例 一 策略 改善或提高限速步驟相關(guān)酶的活性 或增加單位細(xì)胞內(nèi)控制限速步驟相關(guān)酶的基因拷貝數(shù) 解除或一定程度上解除該酶的限速性 用強(qiáng)啟動子替換相關(guān)基因簇中的弱啟動子 增加細(xì)胞內(nèi)攜帶抗生素生物合成基因簇質(zhì)粒的拷貝數(shù) 抑制負(fù)調(diào)控蛋白的合成或敲除編碼負(fù)調(diào)控蛋白的基因 將經(jīng)改造的或篩選獲得的強(qiáng)抗生素抗性基因?qū)氲湍退幘?提高產(chǎn)抗菌株的抗生素抗性 6 引入編碼抗生素分子結(jié)構(gòu)修飾酶之基因 改變原抗生素分子結(jié)構(gòu) 獲得具有新功能的抗生素 二 實例 抗生素 公司 克隆方法與類型 內(nèi)酰胺類克拉維酸 Beecham 頭霉素C Panlabs 芳香聚酮體類放線紫紅素榴菌素土霉素 Pfizer 突變互補(bǔ)全部生物合成基因克隆在異源宿主中突變互補(bǔ)actI基因作為雜交探針抗性基因 抗生素 公司 克隆方法與類型 大環(huán)內(nèi)酯類泰樂星 EliLilly 碳霉素 EliLilly 紅霉素 EliLilly Abbott Avermectin merck 根據(jù)O 轉(zhuǎn)甲基酶序列合成的寡聚核苷酸探針 抗性基因選擇抗性基因抗性基因突變互補(bǔ) 抗生