第三章 細胞生物學研究方法.ppt

第三章細胞生物學研究方法 進行初步觀察 形成可驗證的假說 設(shè)計對照試驗 收集資料 解釋結(jié)果 作出合理結(jié)論 查閱已有知識 生物學研究模式生物不同物種享有共同分子機制 如何學習細胞生物學 抽象思維與動態(tài)觀點結(jié)構(gòu)與功能統(tǒng)一的觀點同一性 unity 和多樣性 diversity 的問題細胞生物學的主要內(nèi)容 結(jié)構(gòu)與功能 動態(tài)特征 細胞的生命活動 實驗科學與實驗技術(shù) 細胞真知源于實驗室 Whatweknow Howweknow 第三章細胞生物學研究方法 細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法 細胞組分的分析方法 細胞培養(yǎng) 細胞工程與顯微操作技術(shù) 第一節(jié)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法 光學顯微鏡技術(shù) lightmicroscopy 電子顯微鏡技術(shù) Electromicroscopy 掃描探針顯微鏡 ScanningProbeMicroscope 掃描遂道顯微鏡 scanningtunnelingmicroscope 第二節(jié)細胞組分的分析方法 離心分離技術(shù) 細胞內(nèi)核酸 蛋白質(zhì) 酶 糖與脂類等的顯示方法 特異蛋白抗原的定位與定性 細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性 放射自顯影技術(shù) 定量細胞化學分析技術(shù) 第三節(jié)細胞培養(yǎng) 細胞工程與顯微操作技術(shù) 細胞的培養(yǎng) 細胞工程 一 光學顯微鏡技術(shù) lightmicroscopy 普通復式光學顯微鏡技術(shù) 熒光顯微鏡技術(shù) FluorescenceMicroscopy 激光共焦掃描顯微鏡技術(shù) LaserConfocalMicroscopy 相差顯微鏡 phase contrastmicroscope 微分干涉顯微鏡 differentialinterferencecontrastmicroscope DIC 錄像增差顯微鏡技術(shù) video enhancemicroscopy 二 電子顯微鏡技術(shù) 電子顯微鏡的基本知識 電鏡與光鏡的比較 電鏡與光鏡光路圖比較 電子顯微鏡的基本構(gòu)造 主要電鏡制樣技術(shù) 負染色技術(shù) 冰凍蝕刻技術(shù) 超薄切片技術(shù) 電鏡三維重構(gòu)技術(shù) 掃描電鏡 Scanningelectronmicroscope SEM SPM Scanningprobemicroscope 三 掃描遂道顯微鏡 ScanningProbeMicroscope SPM 80年代發(fā)展起來的檢測樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器 包括 STM AFM 磁力顯微鏡 摩擦力顯微鏡等原理 掃描探針與樣品接觸或達到很近距離時 即產(chǎn)生彼此間相互作用力 如量子力學中的隧道效應(yīng) 隧道電流 原子間作用力 磁力 摩擦力等 并在計算機顯示出來 從而反映出樣品表面形貌信息 電特性或磁特性等 裝置 掃描的壓電陶瓷 逼近裝置 電子學反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集 處理 顯示系統(tǒng) 特點 1 可對晶體或非晶體成像 無需復雜計算 且分辨本領(lǐng)高 側(cè)分辨率為0 1 0 2nm 縱分辨率可達0 01nm 2 可實時得到樣品表面三維圖象 可測量厚度信息 3 可在真空 大氣 液體等多種條件下工作 非破壞性測量 4 可連續(xù)成像 進行動態(tài)觀察 用途 納米生物學研究領(lǐng)域中的重要工具 在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu) 普通復式光學顯微鏡技術(shù) 光鏡樣本制作分辨率是指區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最小距離 熒光顯微鏡技術(shù) FluorescenceMicroscopy 原理與應(yīng)用 直接熒光標記技術(shù) 間接免疫熒光標記技術(shù) 在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位 如綠色熒光蛋白 GFP 的應(yīng)用 激光共焦掃描顯微鏡技術(shù) LaserScanningConfocalMicroscopy 原理 應(yīng)用 排除焦平面以外光的干擾 增強圖像反差和提高分辨率 1 4 1 7 可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu) 相差顯微鏡 phase contrastmicroscope 將光程差或相位差轉(zhuǎn)換成振幅差 可用于觀察活細胞 微分干涉顯微鏡 differential interferencemicroscope 偏振光經(jīng)合成后 使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別 增加了樣品反差且具有立體感 適于研究活細胞中較大的細胞器 錄像增差顯微鏡技術(shù) video enhancemicroscopy 計算機輔助的DIC顯微鏡可在高分辨率下研究活細胞中的顆粒及細胞器的運動 電鏡與光鏡的比較 電鏡與光鏡光路圖比較 電子顯微鏡的基本構(gòu)造 主要電鏡制樣技術(shù) 超薄切片技術(shù)用于電鏡觀察的樣本制備示意圖 負染色技術(shù) Negativestaining 與金屬投影染色背景 襯托出樣品的精細結(jié)構(gòu) 冰凍蝕刻技術(shù) Freezeetching 技術(shù)示意圖 冰凍斷裂與蝕刻復型 主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu) 快速冷凍深度蝕刻技術(shù) quickfreezedeepetching 電鏡三維重構(gòu)技術(shù)電子顯微術(shù) 電子衍射與計算機圖象處理相結(jié)合而形成的具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù) 電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X 射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合 是當前結(jié)構(gòu)生物學 StructuralBiology 主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實驗手段 掃描電鏡 原理與應(yīng)用 電子 探針 掃描 激發(fā)樣品表面放出二次電子 探測器收集二次電子成象 CO2臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題 一 離心分離技術(shù) 用途 于分離細胞器與生物大分子及其復合物 差速離心 分離密度不同的細胞組分 密度梯度離心 精細組分或生物大分子的分離 二 細胞內(nèi)核酸 蛋白質(zhì) 酶 糖與脂類等的顯示方法 原理 利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊基團特異性結(jié)合的特征 通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細胞中的分布和含量 FeulgenStaining 三 特異蛋白抗原的定位與定性 免疫熒光技術(shù) 快速 靈敏 有特異性 但其分辨率有限 圖 蛋白電泳 SDS PAGE 與免疫印跡反應(yīng) Western Blot 免疫電鏡技術(shù) 免疫鐵蛋白技術(shù) 免疫酶標技術(shù) 免疫膠體金技術(shù)應(yīng)用 通過對分泌蛋白的定位 可以確定某種蛋白的分泌動態(tài) 胞內(nèi)酶的研究 膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等 四 細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性 光鏡水平的原位雜交技術(shù) 同位素標記或熒光素標記的探針 電鏡水平的原位雜交技術(shù) 生物素標記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標記結(jié)合 PCR技術(shù) 五 放射自顯影技術(shù) 原理及應(yīng)用 利用同位素的放射自顯影 對細胞內(nèi)生物大分子進行定性 定位與半定量研究 實現(xiàn)對細胞內(nèi)生物大分子進行動態(tài)和追蹤研究 步驟 前體物摻入細胞 標記 持續(xù)標記和脈沖標記 放射自顯影 六 定量細胞化學分析技術(shù) 細胞顯微分光光度術(shù) Microspectrophotometry 利用細胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜的吸收 測定這些物質(zhì) 如核酸與蛋白質(zhì)等 在細胞內(nèi)的含量 包括 紫外光顯微分光光度測定法可見光顯微分光光度測定法 流式細胞儀 FlowCytometry 主要應(yīng)用 用于定量測定細胞中的DNA RNA或某一特異蛋白的含量 測定細胞群體中不同時相細胞的數(shù)量 從細胞群體中分離某些特異染色的細胞 分離DNA含量不同的中期染色體 一 細胞的培養(yǎng) 動物細胞培養(yǎng) 類型 原代培養(yǎng)細胞 primaryculturecell 繼代培養(yǎng)細胞 sub culturecell 細胞株 cellstrain 正常二倍體 接觸抑制 細胞系 cellline 亞二倍體 接觸抑制喪失 植物細胞 類型 原生質(zhì)體培養(yǎng) 體細胞培養(yǎng) 單倍體細胞培養(yǎng) 花藥培養(yǎng) 非細胞體系 cell freesystem 二 細胞工程 細胞融合 cellfusion 與細胞雜交 cellhybridization 技術(shù) 單克隆抗體 monocloneantibody 技術(shù)圖 細胞拆合與顯微操作技術(shù) 物理法結(jié)合顯微操作技術(shù) 圖1 圖2 化學法結(jié)合離心技術(shù) 制備核體 karyoplast 和胞質(zhì)體 cytoplast 其它技術(shù)遺傳分析 mutant knockout knockin 對細胞生命活動的研究成為當今生命科學發(fā)展的瓶頸 對細胞生命活動的研究成為當今生命科學發(fā)展的瓶頸 細胞生命活動 突變體分析 突變體分析 蛋白修飾分析 基因表達 多肽定性分析 生物信息學 序列測定 雙向電泳分析 DNA分離與克隆 機器人技術(shù) robotics 功能基因組學 蛋白質(zhì)分離與制備 蛋白質(zhì)組學 Caenorhabditiselegans Drosophilamelanogaster Arabidopsisthaliana Hela細胞 左 CHO細胞 右 的培養(yǎng) 現(xiàn)代分子細胞生物學中幾種常用技術(shù)與研究手段 一 PCR技術(shù)及其應(yīng)用 二 DNA檢測技術(shù)及其應(yīng)用 三 基因組測序技術(shù)及其應(yīng)用 以HGP為例 四 體細胞克隆技術(shù)及其應(yīng)用 五 雜交瘤技術(shù)及其應(yīng)用 以單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)為例 六 細胞信號轉(zhuǎn)導研究技術(shù) 以本室研究內(nèi)容為例 七 組學技術(shù)及其在轉(zhuǎn)基因食品安全性評價中的應(yīng)用 一 PCR技術(shù)及其應(yīng)用1 PCR技術(shù)基本原理2 PCR技術(shù)應(yīng)用實例 1 利用PCR技術(shù)對食品中致病微生物的快速檢測請同學們根據(jù)PCR的原理自己設(shè)計 技術(shù)要點 優(yōu) 缺點 2 利用PCR技術(shù)對基因進行定點突變 3 利用PCR技術(shù)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系 利用PCR技術(shù)對基因進行定點突變例如 設(shè)計一實驗方案將一個已知基因的3 端的第7位堿基由A定向突變?yōu)镃 利用PCR技術(shù)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系例如 設(shè)計一實驗方案檢驗一已知蛋白質(zhì)的C末端的3個氨基酸是否是該蛋白質(zhì)生物學活性的必需氨基酸 二 DNA檢測技術(shù)及其應(yīng)用1 DNA檢測技術(shù)原理2 在刑事偵察中的應(yīng)用 三 基因組測序技術(shù)及其應(yīng)用 以HGP為例 1 了解基因組測序的基本流程 2 DNA測序反應(yīng)的原理 四 體細胞克隆技術(shù)及其應(yīng)用克隆的概念clone 由同一個細胞祖先經(jīng)分裂 繁殖所形成的純細胞系 克隆的類型 體細胞克隆 分子克隆 基因克隆克隆動 植物 利用單個細胞通過無性繁殖產(chǎn)生出的個體 克隆動物的基本原理 克隆羊Dolly1996年7月5號羅斯林研究所維爾默特 Wilmut NATURE 1997年2月27號 植物克隆 快速繁