細胞活性測定方法介紹和使用探討.doc

1.細胞活性測定方法介紹和使用探討細胞活性測定方法有臺盼藍染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素摻入法、MTT法等。其中MTT法以其快速簡便，不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測的特點而得到廣泛的應(yīng)用。但MTT法形成的Formazan為水不溶性的，需要加有機溶劑溶解，由于在去上清操作時會有可能帶走小部分的Formazan，故有時重復(fù)性略差。為了解決這個問題，研究人員又開發(fā)了很多種水溶性的四氮唑鹽類：如XTT、CCK-8（WST-8）等?，F(xiàn)就這三種四氮唑鹽類方法作一個簡單介紹：1、MTT法MTT：化學(xué)名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲 （Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲 ，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟。缺點：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲 產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲 的有機溶劑對實驗者也有損害。2、XTT法XTT：化學(xué)名：2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-(phenylamino)carbonyl-2H-tetrazolium hydroxide，作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細胞還原成水溶性的橙黃色甲 產(chǎn)物。當(dāng)XTT與電子偶合劑（例如PMS）聯(lián)合應(yīng)用時，其所產(chǎn)生的水溶性的甲 產(chǎn)物的吸光度與活細胞的數(shù)量成正比。優(yōu)點：1、使用方便，省去了洗滌細胞；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT。缺點：XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。3、CCK-8法或稱WST-8法CCK-8試劑中含有WST8：化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲 產(chǎn)物（Formazan）。生成的甲 物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。該方法已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞增殖試驗、細胞毒性試驗以及藥敏試驗等。優(yōu)點：1、使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT；5、對細胞毒性?。?、為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用。缺點:1、與MTT相比，CCK-8和XTT的價格比較貴。2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多加。2.細胞復(fù)蘇方法1 從液氮罐中取出安剖；有時因安剖未封嚴，浸入了液氮，取出后因安剖內(nèi)液氮迅速氣化而發(fā)生爆炸，因此應(yīng)帶有防護眼睛和手套。2迅速放入盛有3637水的搪瓷罐中，扣上蓋并不時搖動，盡快解凍。3剪開紗布口袋，取出安剖，用70酒精擦拭消毒后，凈化臺上打開蓋，用吸管吸出細胞懸液，裝入離心管中，再補加10ml培養(yǎng)液，吹打使細胞懸浮。4低速離心（5001000轉(zhuǎn)/分）5分鐘，取上清后再重復(fù)用培養(yǎng)液漂洗、離心。5加入培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，再移裝入培養(yǎng)瓶中，置溫箱培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)。3.細胞凍存方法4.常規(guī)組織培養(yǎng)法1）初代消化培養(yǎng)法1.準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒20分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2.布局：點燃酒精燈，安裝吸管帽。3.處理組織：把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗23次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中3060分鐘。4.剪切：用眼科剪把組織切成23毫米大小的塊，以便于消化。加入比組織塊總量多3050倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結(jié)扎瓶口或塞以膠塞。5.消化：或用恒溫水浴，或置于37溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應(yīng)搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。6.分離：在消化過程中見消化液發(fā)混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速（5001000轉(zhuǎn)/分）離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。7.計數(shù)：用計數(shù)板計數(shù)，如細胞懸液細胞密度過大，再補加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中。對大多數(shù)細胞來說，pH要求在7.27.4范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說明液體變酸，可用NaHCO3調(diào)整。8.培養(yǎng)：置于36.5溫箱培養(yǎng)，如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需要換新塞。2）初代組織塊培養(yǎng)法1.剪切：把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸靜Hanks液，用眼科剪反復(fù)剪切1mm3塊為止。2.擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置于培養(yǎng)瓶中，用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底部，小塊相互距離以0.5cm為宜，每一25ml培養(yǎng)瓶底可擺布2030塊。3.輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，另瓶底向上，注意翻瓶時勿另組織小塊流動，塞好瓶塞，置36.5溫箱培養(yǎng)2小時左右（勿超過4小時），使小塊微干涸。4.培養(yǎng)：從微箱中取出培養(yǎng)瓶，開塞，46度斜持培養(yǎng)瓶，箱瓶底腳部輕輕注入培養(yǎng)液少許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細胞從組織塊游出數(shù)量增多后。再補加培養(yǎng)液。3）傳代培養(yǎng)法1.吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。2.向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶和EDTA混合液少許，以能覆滿瓶底為限。3.置溫箱中25分鐘，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，立即終止消化。4.吸除消化液，向瓶內(nèi)注入Hanks液數(shù)毫升，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，把殘余消化液沖掉。注意加Hanks液沖洗細胞時，動作要輕，以免把已松動的細胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液單獨消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液沖洗，直接加入培養(yǎng)液。5.用吸管吸取營養(yǎng)液輕輕反復(fù)吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。6.計數(shù)板計數(shù)后，把細胞懸液分成等份分裝入數(shù)個培養(yǎng)瓶中，置溫箱中培養(yǎng)。5.細胞培養(yǎng)中血清使用的常見問題1.保存血清最好的辦法？我們建議血清應(yīng)保存在-5至-20。若你一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。2.如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損？我們建議您將血清從冷凍箱中取出后，先置于2-8冰箱中使之溶解，然后在室溫下使之全溶。但必須注意的是，溶解過程中必須規(guī)則地搖晃均勻。3.血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理？血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性造成的；而血纖維蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成血清沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。若您欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管中，以400g稍微離心，上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞您的過濾膜。4.何謂熱滅活？有必要做熱滅活嗎？一般以56，30分鐘來處理已解凍的血清，因為此加熱步驟，可以使補體去活性，而補體所參與的反應(yīng)有：溶細胞活性，平滑肌的收縮，肥大細胞和血小板組胺的釋放，增強吞噬作用，淋巴細胞、巨噬細胞的趨化和激活。實驗顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細胞而言是不需要的。經(jīng)過處理的血清對細胞生長只有微小的促進，或完全沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量，而造成細胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小