切膠回收注意事項.doc

膠回收DNA注意事項膠回收DNA注意事項切膠回收DNA片段是要把整個目的片斷所在位置的膠全部回收。所以為了減少膠的體積，我們就可以用相對比較薄的膠來跑電泳，通常只要夠點樣即可，或是采用薄而寬的梳子來跑膠。這樣可減少回收試劑引起的一些后續(xù)麻煩。主要還是DNA的濃度, 如果DNA濃度不夠, 想膠小點也不可能。紫外燈下切下含待回收DNA的凝膠時，要襯以干凈的塑料薄膜，使用無DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。利用凝膠回收試劑盒DNA回收效率較低或者未回收到目的片段可能有以下幾個原因：膠塊未完全溶解，可適當延長水浴時間，并增加上下顛倒次數(shù)輔助溶解；膠塊體積太大，應先將其切為小塊，分多次回收；電泳緩沖液pH太高，硅基質膜在高鹽低pH結合DNA，如pH太高，應作適當調整；漂洗液中未加入無水乙醇。可以改用去離子水洗脫。但是實驗室所用純水一般pH偏低，可利用NaOH適當調高其pH值，以增加洗脫得率。洗脫產(chǎn)物含有殘留的乙醇會影響后續(xù)酶切實驗，請確保徹底去除漂洗緩沖液，具體方法參見回收效率低的解決方案。不可以使用更小洗脫體積（小于說明書提供的最小洗脫體積）進行洗脫以提高濃度，因為說明書提供的最少洗脫體積是能完全覆蓋吸附膜的最小體積，若減少體積則不能將DNA完全洗脫下來。電泳檢測只有一條目的帶，可以選用凝膠回收試劑盒。如果后續(xù)實驗對片段純度要求較高，建議即使只有一條帶，也可以切膠純化，其回收得到片段的純度可能要比直接回收高一些。瓊脂糖凝膠膠塊不溶可能是下述原因：瓊脂糖質量不好；含目的片段的凝膠再空氣中放置過久，使膠塊失水、干燥，建議切膠后立即進行回收或將膠塊保存在4或-20；制膠的電泳緩沖液濃度過高或陳舊。關于膠回收切膠的一點注意事項1. 電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺子清理干凈，刀片最好洗凈滅菌，總之一句話就是保證切下的帶沒有外源dna污染。2. 切膠是要把整個目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積，可以用相對比較薄的膠來做，只要夠點樣即可，也可采用薄而寬的梳子來跑膠。3. 關于防護，在一般有機玻璃后就足夠了，戴上防護面具以保護眼睛，如果戴樹脂眼鏡就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者對于膠有特殊要求，例如要求不含EB，可以采用點marker和帶刻度的尺子一起照相的方法來確定目的條帶在膠上的位置進行切膠。4. 按照正常程序點marker跑膠，然后切下有marker的膠，EB染色，紫外燈下與帶刻度的尺子一起照相。由于要回收的帶與marker間的相對位置已知，根據(jù)尺子來衡量未染色膠上目的帶的位置即可。如果覺得很難判斷，可以直接在marker邊點少量的樣，這樣位置就容易確定了。 膠回收一. 提高膠回收量的辦法：1) 增加電泳時的上樣量。2) 電泳緩沖液用新鮮配制的。3) 切膠時盡量只切有條帶的膠，減小切膠體積：含目的片斷很少的膠就不要要了，不然影響回收率。4) 把切的兩塊或多塊膠融化后，無論多大的體積都用一個管子，轉移到同一個柱子上。5) 溶膠時所加的溶液可多一點，這樣更有利于DNA與膜的結合，不過一般不要多余750ul。6) 膠回收的關鍵是通過柱子的溶液的鹽濃度、酸堿性（電荷）和疏水性使DNA與柱子結合，因此，若電泳緩沖液的PH偏高，可在溶膠液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；為了使DNA分子更好的攔截在膜上，可以添加30異丙醇在加熱溶解膠后的液體里。7) 加洗脫液之前，將柱子在室溫放置幾分鐘（大約需10分鐘），以使乙醇充分揮發(fā)。 最后少加些洗脫液，盡量減少回收體積，一般用30-50l洗脫液洗脫（不能太少，否則無法浸濕膜反而不利于洗脫）；洗脫液滴在膜中央，以充分洗脫結合在膜上的DNA。9) 可以在加入洗脫液之后，可以在55度水浴5分鐘或放在50度水浴10分鐘以上再洗脫，或用封口膜密封4度過夜，第二天再離心回收，效果不錯。10) 將離心后的洗脫液加回吸附柱，再次離心。四、一些注意事項1.電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺子清理干凈，刀片最好洗凈滅菌，總之一句話就是保證切下的帶沒有外源DNA污染。2.切膠是要把整個目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積，可以用相對比較薄的膠來做，只要夠點樣即可，也可采用薄而寬的梳子來跑膠。3.關于防護，在一般有機玻璃后就足夠了，戴上防護面具以保護眼睛，如果你戴樹脂眼鏡就可以了。4.瓊脂糖對回收率有一定影響，如果瓊脂糖較多，可以增加溶膠液，保證體系鹽濃度。影響回收率的因素主要是柱子填料必須在適宜的緩沖環(huán)境中（如果用柱子的話）。對于小于的片段回收，可加至30%異丙醇。5.如果是用PAGE回收，用水或TE溶解，槍頭搗碎，過夜浸泡，即可。當然你要將100bp在膠中位置定好切下。已標記的探針用X片，未標記的用EB。6.選用回收效率較高的柱子，比如進口的Qiaquick spin column。7.參照分子克隆用低熔點膠回收。除低熔點凝膠回收法外，如用一般凝膠可用透析帶短暫電泳，離心管低部加玻璃棉，高速離心等方法回收DNA片段。附注：1影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素：1)DNA分子大小 遷移速率U與logN成反比（N為堿基對數(shù)目）。分子大小相等，電荷基本相等（DNA結構重復性）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結構緊密的電泳快（超螺旋線性DNA）2) 瓊脂糖濃度：logU=logU0 Krt 膠濃度，U為遷移率，U0 為DNA的自由電泳遷移率，t為膠濃度，Kr為介質阻滯系數(shù)。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNAAgarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb.3)DNA構象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀線狀DNA單鏈開環(huán)。當條件變化時，情況會相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強度、離子強度及EB含量有關。4)所加電壓：低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應超過5V/cm5)堿基組成與溫度：一般影響不大4 -30 6)嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中)7)電泳緩沖液 （0.5TBE）的組成及其離子強度影響DNA的遷移率，無離子存在時，核酸基本不泳動，離子強度過大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠并導致DNA變性，一般采用1TAE，1TBE，1TPE（均含EDTA pH8.0）。2溴化乙錠（EB）為致癌劑，操作時應戴手套，盡量減少臺面污染。3電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍（bromophenol blue, Bb）呈藍紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈藍色，它攜帶的電荷量比溴酚藍少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍慢 DH5DH5菌株是一種能夠攝入外源DNA的受容菌，普通的大腸桿菌細胞內有一種“免疫”機制，即當外源DNA 侵入時，會產(chǎn)生諸如限制性內切酶類的物質，將外源的DNA剪切掉，而其自身DNA因被修飾（如甲基化）所以不被限制酶識別，不會被剪切。這樣的菌是不能直接用于基因工程的，我們總不希望目的基因導入進去還來不及復制就被剪切掉。DH5菌株是一種經(jīng)誘變的菌株，其基本特性是：R