轉(zhuǎn)基因生物第十三周星期五上午.ppt

1 轉(zhuǎn)基因生物 第四章 Transgenicbiology 龔青副教授 基因 是一個特定的DNA片段 編碼一種特定的多肽或蛋白質(zhì) 是遺傳信息的功能單位 一般說來 從細(xì)菌到哺乳動物的全部生命有機(jī)體 它們的基因都是由DNA構(gòu)成的 由于所有生物的DNA的基本結(jié)構(gòu)是一致的 因此 來自兩種生命形態(tài)的基因可以融為一體 由此可見 基因的DNA共性 是進(jìn)行基因工程的重要理論基礎(chǔ)之一 DNA分子是遺傳物質(zhì)和基因的載體 基因是細(xì)胞中所有的RNA及蛋白質(zhì)分子的 藍(lán)圖 一旦基因發(fā)生突變 那么由它指導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)也將隨之發(fā)生變化 甚至可能導(dǎo)致活性的喪失 1 轉(zhuǎn)基因 將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中 2 轉(zhuǎn)基因技術(shù) Transgenetechnology 指利用分子生物學(xué)技術(shù) 將某些生物的基因轉(zhuǎn)移到其它物種中 改造生物的遺傳物質(zhì) 并使其在性狀 營養(yǎng)和消費(fèi)品質(zhì)等方面向人類需要的目標(biāo)轉(zhuǎn)變 轉(zhuǎn)基因技術(shù) 自然選擇 人工定向改造 轉(zhuǎn)基因技術(shù) 將希望轉(zhuǎn)入的基因注射到小鼠的受精卵的細(xì)胞核中 使注射的DNA整合到受精卵的基因組中 然后將該卵細(xì)胞注射 移植 到宿主鼠的子宮中 使其發(fā)育 產(chǎn)下子代小鼠 從子代鼠中提取DNA樣品 檢測外源基因 轉(zhuǎn)移基因 是否整合到了子代鼠中 成功移植 不成功移植 探針檢測到轉(zhuǎn)移基因 將注射外源基因的卵移植到宿主鼠子宮中 向受精卵中注射外源基因 通常都是將提取的DNA用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切 然后電泳 將電泳后凝膠上的核酸物質(zhì)轉(zhuǎn)移到薄膜 硝酸纖維素薄膜 上 用探針檢測是否存在轉(zhuǎn)移基因 探針是能夠與轉(zhuǎn)移基因結(jié)合的一段單鏈DNA或RNA 著名的轉(zhuǎn)基因鼠實驗是讓小鼠攜帶額外的生長激素基因 結(jié)果接受了外源生長激素基因的受精卵發(fā)育的小鼠的體重是正常小鼠體重的兩倍 利用蘇云金芽孢桿菌在西紅柿細(xì)胞DNA內(nèi)引入一段基因 這段基因能夠編碼出對毛毛蟲有毒性的蛋白 抑制蟲害 抗毛毛蟲西紅柿 正常鼠 轉(zhuǎn)入生長激素基因的小鼠 轉(zhuǎn)基因微生物 分解石油的假單孢桿菌等 轉(zhuǎn)基因動物 轉(zhuǎn)基因牛 豬 雞 鯉魚等 轉(zhuǎn)基因植物 轉(zhuǎn)基因大豆 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉 轉(zhuǎn)基因玉米 轉(zhuǎn)基因水稻 轉(zhuǎn)基因抗除草劑農(nóng)作物等 轉(zhuǎn)基因動物 以實驗方法將外源基因?qū)雱游锶旧w基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動物 第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動物 特點(diǎn)分子及細(xì)胞水平操作 組織及動物整體水平表達(dá) 轉(zhuǎn)基因動物的研究歷史 1974年 美國學(xué)者Jaenisch首次應(yīng)用顯微鏡注射法獲得轉(zhuǎn)基因小鼠 1981年 美國科學(xué)家成功地將外源基因?qū)雱游锱咛?創(chuàng)立了轉(zhuǎn)基因動物技術(shù) 1982年獲得轉(zhuǎn)基因小鼠 1982年 Palmiter將大鼠的生長激素基因?qū)胄∈笫芫阎?獲得體重是對照組2倍的 超級鼠 1985年 Wagner等利用拼接有新霉素抗性基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染胚胎干細(xì)胞 ES細(xì)胞 獲得嵌合體小鼠 為利用ES細(xì)胞制備轉(zhuǎn)基因小鼠開辟了先河 轉(zhuǎn)基因超級鼠 1982年 英國的 自然 雜志發(fā)表了一篇文章 有兩個美國實驗小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù) 將大鼠生長激素重組基因?qū)氲叫∈笫芫阎?培育出具快速生長效應(yīng)的 轉(zhuǎn)基因超級鼠 轉(zhuǎn)基因鼠比與它同胎所生的小鼠生長速度快2 3倍 體積大一倍 1989年 意大利學(xué)者用精子作為載體轉(zhuǎn)移目的基因 成功地獲得了純系轉(zhuǎn)基因小鼠 1987年 世界上第一只商業(yè)化轉(zhuǎn)基因綿羊在英國著名的羅斯林研究所誕生 這只轉(zhuǎn)基因母羊的乳汁中可以分泌 抗胰蛋白酶 含量高達(dá)30毫克 升 1997年2月 英國羅斯林研究所維爾穆特博士科研組公布體細(xì)胞克隆羊 多利 培育成功 1999年2月 上海遺傳研究所宣布轉(zhuǎn)基因試管牛 滔滔 誕生 其體內(nèi)被檢測到帶有人的血清白蛋白基因 這項成果被評為當(dāng)年 中國十大科技進(jìn)展 之一 1997年10月 英國羅斯林研究所 Roslin 宣布已成功克隆出3只攜帶有人凝血因子 基因轉(zhuǎn)染綿羊 二 基本原理 獲取外源目的基因 實驗動物的受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞中 目的基因整合到基因組中 再植入受體動物輸卵管 子宮 揭示外源基因的功能 顯微注射等基因轉(zhuǎn)移方法 發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動物 培育優(yōu)良的動物品種 轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作的具體流程 一 目的基因的設(shè)計轉(zhuǎn)基因可分為隨機(jī)整合型基因和基因敲除 geneknockout 型載體基因 隨機(jī)整合型基因要求結(jié)構(gòu)完整 包括5 上游啟動子區(qū)和3 下游區(qū)等 多用基因組文庫篩選或人為改造基因 改造基因可選擇不同的啟動子來控制外源基因表達(dá)的組織特異性 基因敲除 geneknockout 型載體基因要設(shè)計與待剔除基因的同源性的載體基因 三 轉(zhuǎn)基因的基本方法 二 重組載體的構(gòu)建選擇合適的基因載體 要求載體序列不干擾外源基因的表達(dá) 能接受外源DNA 穩(wěn)定 對宿主細(xì)胞無威脅 三 重組載體的體外驗證 invitro 重組載體的正確性驗證 如拷貝數(shù) 連接方向等 對于連有組織特異性啟動子或局部體細(xì)胞轉(zhuǎn)染的載體需先在同類型的體外離體培養(yǎng)細(xì)胞中初步驗證表達(dá)特性 四 基因轉(zhuǎn)移1 化學(xué)法2 物理法3 生物法 五 轉(zhuǎn)基因動物模型的驗證從基因組 mRNA 蛋白質(zhì)和整體表型各個層次進(jìn)行驗證 用核酸雜交 聚合酶鏈反應(yīng) 免疫印跡雜交 酶聯(lián)免疫法 免疫熒光法和Western雜交法等多種方法 篩選出有外源基因整合的陽性動物 傳代后檢測外源基因在轉(zhuǎn)基因動物中的表達(dá)情況 對外源基因表達(dá)產(chǎn)物的生物活性和生化性質(zhì)進(jìn)行鑒定 以及檢查轉(zhuǎn)基因動物的生理功能和是否出現(xiàn)某些疾病癥狀的表型等 六 組建轉(zhuǎn)基因系第一代轉(zhuǎn)基因動物是半合子轉(zhuǎn)基因動物 因為外源基因僅在一條染色體上穩(wěn)定整合 只有通過選種選配 將兩個半合子轉(zhuǎn)基因動物成功交配 才能得到純合子轉(zhuǎn)基因動物 建立轉(zhuǎn)基因動物家系 外源DNA才能在后代中穩(wěn)定遺傳 1 顯微注射法 以單細(xì)胞受精卵為靶細(xì)胞 利用顯微注射技術(shù)將構(gòu)建好的外源DNA直接注射到受精卵的原核內(nèi) 再把接受注射的受精卵移入假孕母體輸卵管 使之發(fā)育成正常的幼仔 獲得轉(zhuǎn)基因動物個體 目前應(yīng)用較廣泛 最早最經(jīng)典的方法 操作技術(shù)性很強(qiáng) 受過嚴(yán)格訓(xùn)練的專業(yè)人員操作 發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物的受精卵也只占注射卵的5 因此用增大微注射受精卵的數(shù)目的辦法提高成功率 轉(zhuǎn)基因的主要技術(shù) 1 顯微注射法microinjection它是創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因動物的有效途徑 microinjection 顯微注射法將外源基因?qū)肷臣?xì)胞和體系胞后 在染色體上的整合位置是隨機(jī)的外源基因甲基化程度在胚胎發(fā)育過程中會影響其活性某些外源基因的表達(dá)程度可受到個體細(xì)胞正常調(diào)節(jié)機(jī)制的控制由于受到宿主組織分化的影響 外源基因還具有一定的組織特異性 顯微注射法獲得轉(zhuǎn)基因鼠的成活率 優(yōu)點(diǎn) 外源DNA大小基本不受限制 1 50kb 導(dǎo)入過程直觀 無需載體缺點(diǎn) 設(shè)備昂貴 環(huán)節(jié)較多對操作人員有較高的技術(shù)要求效率低 尤其是大家畜 對卵子傷害大 胚胎存活率低轉(zhuǎn)基因沉默 2 胚胎干細(xì)胞 ES細(xì)胞 法 ES細(xì)胞是早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)經(jīng)過體外培養(yǎng)建立起來的多潛能細(xì)胞系 它是一種含正常二倍體染色體的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞 可以在體外進(jìn)行人工培養(yǎng) 擴(kuò)增 并能以克隆的形式保存 將攜帶有外源基因的ES細(xì)胞注射入動物的早期胚胎內(nèi) 將來出生的動物的生殖系統(tǒng)就有可能整合上外源基因 再通過雜交繁育得到純合目的基因的個體 即為轉(zhuǎn)基因動物 目前 胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法在小鼠上應(yīng)用比較成熟 在大動物上應(yīng)用較晚 優(yōu)點(diǎn) 1 外源基因整合情況的可控性高 可預(yù)先在細(xì)胞水平檢測外源基因的拷貝數(shù) 定位 表達(dá)的水平及插入的穩(wěn)定性2 外源基因?qū)隕S細(xì)胞的方法多樣 如逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法 電擊法等 細(xì)胞鑒定及篩選方便缺點(diǎn) 1 ES細(xì)胞系建立及培養(yǎng)困難2 維持ES細(xì)胞的未分化及多向分化潛能不易 將目的基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上 制成高滴度病毒顆粒 人為感染著床前后的胚胎 也可直接將胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細(xì)胞共同培養(yǎng)以達(dá)到感染目的 獲得轉(zhuǎn)基因動物的方法 目前這種方法主要應(yīng)用于雞胚胎操作 3 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法 反轉(zhuǎn)錄病毒感染法的載體的構(gòu)建 提取病毒未整合的環(huán)狀形式DNA 將環(huán)狀DNA克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中 選擇適當(dāng)?shù)拿笇⒉《窘Y(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)切除 將外源目的基因克隆到載體中 通過物理方法將重組DNA分子轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞 反轉(zhuǎn)錄病毒載體的工作原理 寄生在受體細(xì)胞中的重組病毒由于沒有包裝信號 能生產(chǎn)病病毒RNA和所有蛋白質(zhì) 但不能包裝成病毒顆粒 病毒載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞后 載體上的包裝信號將使包裝蛋白把載體包裝成為侵染生的病毒顆粒 優(yōu)點(diǎn) 受精卵攜帶外源基因的陽性率高外源基因多單拷貝整合操作簡單 避免注射法對卵子的損害宿主范圍廣可同時感染大量胚胎 感染率及胚胎存活率高 缺點(diǎn) 容納大小有限潛在致癌性 載體復(fù)雜整合率不高 胚胎自我保護(hù)機(jī)制對其有抗性 4 體細(xì)胞核移植方法 將外源基因?qū)氲襟w細(xì)胞中 篩選 培養(yǎng) 擴(kuò)增 用這種細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行核移植 即把體細(xì)胞核植入一個去了核的卵母細(xì)胞中 融合并激活 將重構(gòu)胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)或者植入同步化的假孕動物的輸卵管 1997年2月17日英國Roslin研究所的Wilmut從1只六歲母羊的乳腺上皮細(xì)胞成功的克隆到了一只綿羊一多利 Dolly 這是人類第一次采用分化的體細(xì)胞作為供體細(xì)胞 它的成功是20世紀(jì)生物學(xué)重大突破之一 學(xué)術(shù)意義在于證明分化的體細(xì)胞甚至是分化終端的體細(xì)胞核仍有全能性 優(yōu)點(diǎn) 轉(zhuǎn)基因效率顯著超過顯微注射可以方便的建立生產(chǎn)畜群可以預(yù)測基因表達(dá)水平可以使用定點(diǎn)整合目標(biāo)基因的技術(shù)對體細(xì)胞進(jìn)行基因改造后 用于核移植可以提高轉(zhuǎn)基因的效率 具有 ES細(xì)胞途徑 的全部優(yōu)點(diǎn) 且物種適用面廣 缺點(diǎn) 技術(shù)上難度大 成功率極低 胚胎死亡率高 非一般實驗室可以開展 直接以精子為載體的轉(zhuǎn)基因方法 將成熟精子與外源 共培養(yǎng) 成熟精子與外源DNA預(yù)培養(yǎng)之后使精子有能力攜帶外源DNA進(jìn)入卵子中 使之受精 并使外源DNA整合到染色體中 目前國際上只有1例成功模型 國內(nèi)也很少有相關(guān)報道 精子載體法很少被應(yīng)用 5 精子載體法 染色體及基因水平 斑點(diǎn)雜交 Southern雜交 PCR轉(zhuǎn)錄水平 Northern雜交蛋白質(zhì)水平 Western印跡 轉(zhuǎn)基因動物中外源基因的檢測 轉(zhuǎn)基因動物研究存在的問題 轉(zhuǎn)基因動物的低效性轉(zhuǎn)入基因造成宿主基因突變問題轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)問題病毒轉(zhuǎn)基因研究存在的問題轉(zhuǎn)基因動物模型與預(yù)期不符問題乳腺生物反應(yīng)器的問題社會問題 轉(zhuǎn)基因動物研究出現(xiàn)的問題 1 制作轉(zhuǎn)基因動物效率低 如顯微注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物小鼠 大鼠 兔 牛 豬 綿羊 轉(zhuǎn)基因陽性率分別為26 44 15 0 7 0 9 0 9 2 外源基因在宿主基因組中的行為難以控制 轉(zhuǎn)基因隨機(jī)整合于動物基因組中 有可能引起宿主細(xì)胞染色體的插入突變 可造成插入位點(diǎn)的基因片段的丟失及位移 也可能激活正常情況下處于關(guān)閉的基因 其結(jié)果導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因陽性個體出現(xiàn)不育 胚胎死亡 流產(chǎn) 畸形等異?，F(xiàn)象 3 轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平低 許多轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平受到宿主染色體上整合位點(diǎn)的影響 出現(xiàn)異位表達(dá) 影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá)能力 從而使大部分轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平較低 轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用 一 轉(zhuǎn)基因動物在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用 研究基因的結(jié)構(gòu)與功能研究基因的組織特異性表達(dá)研究發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控克隆在發(fā)育中起重要作用的基因基因多級調(diào)節(jié)系統(tǒng)的研究細(xì)胞功能研究 基因敲除 geneknockout 是指對一個結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因 從分子水平上設(shè)計實驗 將該基因去除 或用其它順序相近基因取代 然后從整體觀察實驗動物 推測相應(yīng)基因的功能 這與早期生理學(xué)研究中常用的切除部分 觀察整體 推測功能的三部曲思想相似 基因敲除的技術(shù)路線如下 1 構(gòu)建重組基因載體 2 用電穿孔 顯微注射等方法把重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi) 3 用選擇培養(yǎng)基篩選已擊中的細(xì)胞 4 將擊中細(xì)胞轉(zhuǎn)入胚胎使其生長成為轉(zhuǎn)基因動物 對轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測 二 轉(zhuǎn)基因動物在醫(yī)藥研究領(lǐng)域中的應(yīng)用 研究病毒性疾病研究建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型轉(zhuǎn)基因動物與基因治療生產(chǎn)天然活性藥物蛋白 1 轉(zhuǎn)基因動物是對多種生命現(xiàn)象本質(zhì)深入了解的工具 如研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 細(xì)胞發(fā)育的潛能性 細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的相互關(guān)系 胚胎發(fā)育調(diào)控 腫瘤 神經(jīng)與發(fā)育等 2 可用來建立多種疾病的動物模型 進(jìn)而研究這些疾病的發(fā)病機(jī)理及治療方法 如代謝病高歇氏 Gaucher 病轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)用 3 轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)可由于改造動物的基因組而改良其經(jīng)濟(jì)性狀 提高經(jīng)濟(jì)效益 4 轉(zhuǎn)基因動物可作為醫(yī)用或食用蛋白的生物反應(yīng)器 如轉(zhuǎn)基因山羊抗凝血酶III 轉(zhuǎn)基因綿羊 1 抗胰蛋白酶 轉(zhuǎn)基因兔的 葡萄糖苷酶 5 通過轉(zhuǎn)基因動物可以生產(chǎn)人體或動物進(jìn)行器官或組織移植時所需的器官和組織 如家畜胎兒神經(jīng)細(xì)胞可替代人類神經(jīng)細(xì)胞用于帕金森癥的治療 第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院將轉(zhuǎn)基因乳豬皮用于皮膚移植 豬器官的體積和形狀以及DNA基本與人類相似 是理想的腎 心 肝等器官供應(yīng)者 但存在免疫排斥 可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)和克隆技術(shù)培育大量不含免疫排斥的轉(zhuǎn)基因克隆豬的器官 乳腺生物反應(yīng)器的研究1987年 Gordon首次報道小鼠乳腺中表達(dá)tPA蛋白 至今國際上轉(zhuǎn)基因羊 轉(zhuǎn)基因牛等的成功報道實例已有10多種 生產(chǎn)出抗胰蛋白酶 乳鐵蛋白 人凝血蛋白因子 蛋白質(zhì)C等藥用蛋白 國外經(jīng)濟(jì)學(xué)家預(yù)期 10年后 轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的藥物銷售額超過250億美元 基因藥物生產(chǎn) 基因藥物生產(chǎn)第一階段是細(xì)菌基因工程 第二階段是動物細(xì)胞基因工程 第三階段是轉(zhuǎn)基因動物 乳腺生物反應(yīng)器 三 轉(zhuǎn)基因動物研究進(jìn)展1 英格蘭羅斯林研究所 Roslin 1997年成功培育轉(zhuǎn)基因綿羊 其乳汁中含有人的凝血因子IX 用來治療血友病 含有的 抗胰蛋白酶可治療北美肺氣腫 2 日本培育的轉(zhuǎn)基因雞含有白血病阻止因子 可能成為生產(chǎn)抗癌藥品的 動物工廠 3 湖北省農(nóng)科院魏慶信研究員2000年培育轉(zhuǎn)基因豬 能合成人血清白蛋白 為治療因失血 創(chuàng)傷 癌癥等引起的休克 水腫等提供醫(yī)用血清白蛋白開辟了新途徑 4 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)和中國農(nóng)業(yè)大學(xué)合作 用轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺表達(dá)人瘦蛋白的研究 5 用轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)的基因工程小鼠已經(jīng)達(dá)到很高的水平 如將特定的外源基因插入小鼠的基因組 可得到轉(zhuǎn)基因小鼠 transgenicmice 將小鼠的基因組中特定內(nèi)源基因定點(diǎn)突變 可得到基因剔除小鼠 geneknockoutmice 將小鼠的基因組中特定內(nèi)源基因進(jìn)行定向重組 可得到基因替換小鼠 geneknockinmice 為醫(yī)學(xué)研究提供了豐富的動物模型 如BALB C HSF1用于熱休克研究 Smad3用于研究粘膜免疫缺陷和骨性關(guān)節(jié)炎等 6 轉(zhuǎn)基因研究已經(jīng)滲透到醫(yī)學(xué) 遺傳學(xué) 發(fā)育生物學(xué) 畜牧學(xué)等領(lǐng)域 轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用前景1 研究外源基因在動物整體水平的表達(dá)調(diào)控規(guī)律 2 轉(zhuǎn)基因動物疾病模型可用來進(jìn)行疾病發(fā)病學(xué)和治療性研究3 改善動物生產(chǎn)性能 提高動物育種效率 4 改變動物基因使其表現(xiàn)型更適合人類需要 用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)一些人類所需的生物活性物質(zhì) 第二節(jié)轉(zhuǎn)基因植物 轉(zhuǎn)基因植物 transgenicplant 是指利用重組DNA技術(shù)將克隆的優(yōu)良目的基因?qū)胫参锛?xì)胞或組織中進(jìn)行表達(dá) 從而獲得新性狀的植物 這一技術(shù)使基因交流的范圍無限擴(kuò)大 可將從細(xì)菌 病毒 動物 遠(yuǎn)緣植物 人工合成的基因?qū)胫参?所以其應(yīng)用前景十分廣闊 一 基本方法 獲取外源目的基因 克隆到表達(dá)載體 培養(yǎng)受體細(xì)胞 如培養(yǎng)懸浮細(xì)胞 將轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)培養(yǎng) 篩選陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定 電擊法 基因槍法 顯微注射法 培植陽性轉(zhuǎn)化植株 抗蟲基因 1 技術(shù)路線 目的基因分離 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 受體材料的準(zhǔn)備 遺傳轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化組織 組織脫分化 轉(zhuǎn)化植株篩選 煉苗 1 目的基因的分離 1 已知基因的獲得 化學(xué)合成法 PCR擴(kuò)增 2 未知基因的獲得 構(gòu)建基因組文庫 篩選目的基因 構(gòu)建cDNA文庫 篩選目的基因 mRNA差異顯示技術(shù)篩選差異表達(dá)基因 差異蛋白質(zhì)譜表達(dá)技術(shù)篩選功能基因 pGEM T 銀杏葉RNA提取 反轉(zhuǎn)錄cDNA 全長cDNA的克隆 克隆及測序 兩端引入酶切位點(diǎn) 雙酶切 定向克隆 導(dǎo)入農(nóng)桿菌 2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 例pBI121 chs構(gòu)建 pBI121圖譜 3 遺傳轉(zhuǎn)化 1 間接轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法 2 直接轉(zhuǎn)化法A 基因槍轉(zhuǎn)化法B 電擊法C 花粉管通道法D PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法 根癌農(nóng)桿菌 Agrobacteriumtumefaciens 是一種革蘭氏陰性土壤桿菌 它含有Ti質(zhì)粒 能誘導(dǎo)被侵染的植物細(xì)胞形成腫瘤 即誘發(fā)冠癭瘤 Ti質(zhì)粒 包括Ri質(zhì)粒 上有一段轉(zhuǎn)移DNA 在農(nóng)桿菌侵染宿主植物時 這段DNA可以轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞 并穩(wěn)定地保留在植物細(xì)胞染色體中 變?yōu)橹参锛?xì)胞新增加的一群基因 最終能通過有性世代遺傳給子代 基因槍轉(zhuǎn)化法由美國Cornell大學(xué)的Sanfor 1987 提出 它的主要原理是將包含目的基因的載體包被在微小的金屬微粒 鎢粒或金粒 表面 通過高壓驅(qū)動力加速微粒穿透植物細(xì)胞壁 導(dǎo)入受體組織細(xì)胞內(nèi) 然后通過組織培養(yǎng)再生出完整的植株 微粒上的外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后 整合到染色體上并得到表達(dá) 從而實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化 電擊法的主要原理是將原生質(zhì)體在溶液中與DNA混合 然后利用高壓電脈沖作用 使原生質(zhì)體膜的某些部位被擊穿而產(chǎn)生可回復(fù)的小孔 外源DNA可通過小孔進(jìn)入原生質(zhì)體內(nèi) 而且不影響經(jīng)電擊處理的原生質(zhì)體再生植物的能力 花粉管通道法是利用開花植物授粉后形成的花粉管通道 直接將外源目的基因?qū)肷胁痪邆湔＜?xì)胞壁的卵 合子或早期胚胎細(xì)胞 實現(xiàn)目的基因轉(zhuǎn)化 PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的主要原理是聚乙二醇 PEG 多聚 L 鳥核苷酸 pLO 磷酸鈣及高pH值條件下誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNA分子 PEG可促使細(xì)胞膜與DNA間接觸與粘連 并通過引起膜表面電荷的紊亂及干擾細(xì)胞間的識別 利于細(xì)胞膜間的融合以及外源DNA進(jìn)入原生質(zhì)體 表1幾種植物轉(zhuǎn)基因方法比較 4 轉(zhuǎn)化組織 農(nóng)桿菌介導(dǎo)之葉盤轉(zhuǎn)化法 帶有轉(zhuǎn)化基因的農(nóng)桿菌活化 受體植物 葉盤 侵染 共培養(yǎng) 篩選培養(yǎng) 誘導(dǎo)成苗 5 煉苗 6 轉(zhuǎn)基因苗的篩選與鑒定 培養(yǎng)過程中利用標(biāo)記基因篩選 標(biāo)記基因 選擇標(biāo)記基因 Slectivegene 報告基因 Reportgene 抗生素類選擇基因抗除草劑類選擇基因生物安全性標(biāo)記類選擇基因 例Gus檢測 原理 葡萄糖酸苷酶基因 Gus 催化 葡萄糖苷酯類物質(zhì)水解 其中很多水解產(chǎn)物具有發(fā)色團(tuán)或形成熒光物質(zhì) 例 組織化學(xué)法測定Gus活性作用底物為X gl