RT-PCR及瓊脂糖凝膠電泳原理與結(jié)果.ppt

RT PCR及瓊脂糖凝膠電泳原理與技術(shù) RT PCR reversetranscriptional PCR RT PCR原理 RT PCR主要用途 檢測(cè)特異基因的表達(dá)量特異基因的組織定位構(gòu)建cDNA文庫(kù)鑒定已轉(zhuǎn)錄序列是否發(fā)生突變 RT PCR反應(yīng)體系 一步法RT PCR RT PCR反應(yīng)體系 兩步法RT PCR cDNAPCR擴(kuò)增 cDNA第一鏈合成反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解RT PCR的基本原理 熟悉RT PCR的常規(guī)步驟 掌握瓊脂糖凝膠電泳技術(shù) 實(shí)驗(yàn)要求 掌握PCR技術(shù) 學(xué)會(huì)操作PCR儀 熟悉瓊脂糖凝膠電泳技術(shù) 實(shí)驗(yàn)原理 聚合酶鏈反應(yīng) PolymeraseChainReaction PCR 是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù) 它具有特異 敏感 產(chǎn)率高 快速 簡(jiǎn)便 重復(fù)性好 易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn) 能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍 使肉眼能直接觀察和判斷 可從一根毛發(fā) 一滴血 甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定 過去幾天幾星期才能做到的事情 用PCR幾小時(shí)便可完成 PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑 實(shí)驗(yàn)原理 PCR是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法 其特異性是由兩個(gè)人工合成的引物序列決定的 在DNA聚合酶催化的一系列合成反應(yīng)中 用兩段寡核苷酸作為反應(yīng)的引物 一般情況下 這兩段寡核苷酸引物的序列互不相同 并分別與模板DNA兩條鏈上的各一段序列互補(bǔ) 而這兩段模板序列又分別位于待擴(kuò)增DNA區(qū)段的兩側(cè) 反應(yīng)時(shí) 首先是在摩爾數(shù)過量的兩段寡核苷酸及4種dNTP存在下 將模板進(jìn)行加熱變性 隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度 使引物與它的靶序列進(jìn)行配對(duì) 稱為退火 然后 退火引物可在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸 上述過程是由溫度控制的 這種熱變性 復(fù)性 延伸的過程就是一個(gè)PCR循環(huán) 實(shí)驗(yàn)原理 PCR是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù) PCR按照底物 即模板DNA 的來源和引物的特點(diǎn)可分為經(jīng)典PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCR RT PCR 和免疫PCR IM PCR 其中 RT PCR較常用 在這個(gè)反應(yīng)體系中 被檢物為RNA 如mRNA 需借助逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄作用 轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的互補(bǔ)鏈DNA cDNA 才能進(jìn)行PCR 為此 逆轉(zhuǎn)錄和PCR分兩步進(jìn)行 先作逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 再以此為模板作PCR RT PCR的準(zhǔn)備 試劑 提取細(xì)胞或組織中RNA購(gòu)買RT PCR試劑盒 一步法或兩步法 RT PCR的準(zhǔn)備 耗材 儀器 超凈臺(tái)PCR儀移液器吸頭200ulPCR管EP管架槍頭盒PCR板冰盒 RT PCR過程中cDNA第一鏈合成反應(yīng)所用的槍頭 槍頭盒 PCR管等塑料制品均提前用氯仿進(jìn)行處理 高壓滅菌后使用 玻璃制品在180 干烤6 8小時(shí) 加樣過程在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行 需戴手套與口罩 cDNAPCR擴(kuò)增的準(zhǔn)備工作同普通PCR反應(yīng) RT PCR反應(yīng)程序 1 42 30min 2 94 3min 3 94 變性3min 4 94 變性30sec 5 52 退火30sec 6 72 延伸1min 7 goto 4 repeat29 8 72 延伸10min 9 holdat4 RT PCR操作過程 cDNA第一鏈合成反應(yīng)所用槍頭 槍頭盒 PCR管等塑料制品均提前用氯仿進(jìn)行處理 高壓滅菌后使用 玻璃制品在180 干烤6 8小時(shí) 在超凈臺(tái)內(nèi)按試劑盒說明書進(jìn)行加樣 加樣過程需戴手套與口罩 cDNAPCR擴(kuò)增的準(zhǔn)備工作同普通PCR反應(yīng) 在PCR儀上設(shè)定程序進(jìn)行反應(yīng) 瓊脂糖凝膠電泳的原理 瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定核酸片段的有效方法 瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶有一定孔隙的固體基質(zhì)的特性 利用電荷效應(yīng) 在電場(chǎng)的作用下及中性pH的緩沖條件下 帶負(fù)電的核酸分子向正極遷移 利用分子篩效應(yīng)可以分離不同片斷大小和不同構(gòu)象的DNA RNA分子 瓊脂糖凝膠電泳的主要用途 分離不同片斷大小和不同構(gòu)象的DNA RNA分子 鑒定DNA片段 如PCR產(chǎn)物的鑒定 純化DNA分子 瓊脂糖凝膠電泳的準(zhǔn)備 試劑 瓊脂糖電泳緩沖液 Tris 冰乙酸 EDTA TAE 6X載樣緩沖液 Loadbuffer 溴酚藍(lán) 蔗糖染色液 goldviewDNA或RNA樣品DNA分子量marker 瓊脂糖凝膠電泳的準(zhǔn)備 儀器 耗材 電泳儀電泳槽微波爐三角瓶移液器電子天平槍頭凝膠成像系統(tǒng) 瓊脂糖凝膠電泳的操作過程 1g瓊脂糖加入100ml1 TAE電泳緩沖液中 搖勻 在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解 冷卻到60 加入5 l的goldview 并搖勻 裝好制膠板 插入適當(dāng)梳子 將溶解的瓊脂糖 約50 倒入 室溫冷卻凝固 充分凝固后 小心垂直向上拔出梳子 將凝膠置入電泳槽中 加1 TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1 2mm 瓊脂糖凝膠電泳的操作過程 用移液器吸取PCR產(chǎn)物10 l于封口膜上 再加入2 l的6X載樣緩沖液 混勻后 小心加入點(diǎn)樣孔 打開電源開關(guān) 調(diào)節(jié)電壓至50 100V 可見到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極