Western blot 技術-詳細版.ppt

Westernblot實驗技術 定義 印跡法 blotting 是指將樣品轉移到固相載體上 而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法 1975年 Southern建立了將DNA轉移到硝酸纖維素膜 NC膜 上 并利用DNA RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法 稱為Southern印跡法 而后人們用類似的方法 對RNA和蛋白質進行印跡分析 對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法 對單向電泳后的蛋白質分子的印跡分析稱為Western印跡法 對雙向電泳后蛋白質分子的印跡分析稱為Eastern印跡法 WesternBlot基本原理 在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉移至一種固相支持體 然后用這種多肽的特異抗體來檢測 快速 特異 信號弱 昂貴 信號強 二抗選擇多 非特異性結合 WesternBlot一般流程 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 轉膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色 蛋白樣品的制備 蛋白樣品的制備 裂解液 只能識別非變性的抗原表位的抗體 不能選擇SDS及強去污劑的裂解液研究蛋白之間相互作用 應選擇溫和非變性裂解液對于難溶解蛋白 應選用裂解強度更高的裂解液 如RIPA SDS SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 原理 SDS是一種離子性的界面活性劑 它有強離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈 當SDS與蛋白質混合時 它會以其碳鏈與蛋白質之疏水性胺基酸結合將蛋白質包起來 而以硫酸根離子外露與水分子作用 大多數(shù)蛋白質和SDS的平均結合量是1 1 4 以重量為單位 而蛋白質結合固定比例之SDS後 由於SDS帶強負價 使蛋白質原先的帶電價微不足道 且每單位重量之蛋白質帶電價一致 chargedensity 所以決定不同蛋白的泳動速率就只剩下分子大小一項因素 丙烯酰胺和N N 亞甲雙丙烯酰胺 SDS配膠的Tris緩沖液TEMED過硫酸銨 時間 Tris 甘氨酸電泳緩沖液 凝膠成份 凝膠濃度與蛋白分離范圍 安裝玻璃板 對齊 加緊 配膠 混勻 不要過度 防止氧化 轉膜 大于20KD 0 45um小于20KD 0 2um小于7KD 0 1um 轉膜 半干法將凝膠和固相基質象三明治一樣加在用緩沖液濕潤濾紙之間 小分子量蛋白 濕法將凝膠和固相基質夾在濾紙中間 浸泡在轉移裝置的緩沖液中 大分子量蛋白 不能有氣泡不要污染膜的表面注意正負極冰浴冷卻 濕轉 半干轉 不能有氣泡濾紙 膠 膜大小要一致 否則容易短路 產(chǎn)熱 封閉 脫脂奶粉 5 BSAWesternBlot膜封閉液 生物試劑公司提供 一抗 二抗孵育 把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中 根據(jù)濾膜面積以0 1ml cm2的量加入加入一抗溶液與濾膜溫育 37 一小時 4 過夜 倒掉一抗溶液 用TBST漂洗液濾膜3次 每次10min 加入用封閉液配制的二抗 搖床上緩慢搖動 37 一小時 4 過夜 倒掉二抗溶液 用TBST漂洗液濾膜3次 每次10min 二抗與底物反應顯色 辣根過氧化物酶法 HRP 堿性磷酸酶法 AP 化學發(fā)光顯色法 HRP DAB顯色法 方便 經(jīng)濟 反應慢 不易保存 不能重新剝離檢測ECL發(fā)光法 靈敏 快速 反應快 能重新剝離檢測 WesternBlot常見問題分析 SDS PAGE電泳 膠不平 凝膠漏液 膠板洗刷干凈加入APS和TEMED的量要合適加入試劑后搖勻 使其充分混合 防止部分膠塊聚合不均勻溫度合適 受熱不均勻導致膠聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對齊 條帶比正常的窄 微笑 或 倒微笑 條帶 凝膠聚合不均勻 灌膠時候盡量混合均勻 動作輕緩拔梳子要迅速 清洗加樣孔要小心 以免把上樣帶扭曲樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導致寬窄不一 純化樣品 調整鹽濃度膠板底部有氣泡會影響電泳效果 應趕走氣泡 同時注意電泳槽裝置是否合適 轉膜及抗體檢測 凝膠腫脹或卷曲 條帶歪斜或漂移 單個或多個白點 轉膜緩沖液過熱 可將凝膠在轉膜之前放到轉膜緩沖液中浸泡5 10min電轉儀長期使用導致海綿變薄 三明治 結構不緊湊導致 可在兩塊海綿之間墊上少許普通的濾紙確保膜和膠塊之間沒有氣泡緩沖液中離子濃度太低 電流或電壓太高 轉膜過程注意降溫 背景太