HPLC儀器原理20080610.ppt

HPLC儀器原理 大連依利特分析儀器有限公司應(yīng)用實驗室 主要內(nèi)容 1 概述2 高壓輸液系統(tǒng)3 進(jìn)樣系統(tǒng)4 檢測器5 色譜柱6 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)7 其他 1 概述 HPLC HighPerformanceLiquidChromatography 系統(tǒng)一般由輸液泵 進(jìn)樣器 色譜柱 檢測器 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等組成 其中輸液泵 色譜柱 檢測器是關(guān)鍵部件 有的儀器還有梯度洗脫裝置 在線脫氣機 自動進(jìn)樣器 預(yù)柱或保護柱 柱溫控制器 自動餾分收集裝置 工作站等 高效液相色譜法的基本流程 2 高壓輸液系統(tǒng) 2 1高壓輸液泵 功能 高壓輸液泵是液相色譜分離過程的動力裝置 它將沖洗劑 流動相 連續(xù)不斷地送進(jìn)柱系統(tǒng) 使樣品在色譜柱中完成分離過程 2 2高壓輸液泵的基本要求 恒流 準(zhǔn)確度與精密度恒壓耐高壓系統(tǒng)死體積小惰性表面壓力檢測與保護功能耐用 易維護程序控制 什么樣的高壓輸液泵才是優(yōu)良的呢 2 3泵的分類 柱塞往復(fù)泵 液壓隔膜泵 螺旋注射泵 氣動放大泵 世界主要HPLC儀器公司商品泵類型分布隔膜泵2 氣動放大泵3 柱塞往復(fù)泵4 螺旋注射泵 2 4雙柱塞往復(fù)泵結(jié)構(gòu) 并聯(lián)式雙柱塞泵 串聯(lián)式雙柱塞泵 2 5消除脈動的方法 降低單沖程排液體積凸輪曲線設(shè)計改進(jìn)驅(qū)動方式脈動阻尼器 2 6單向閥 柱塞桿和密封圈 單向閥 密封圈 柱塞桿 2 7部分P型高壓恒流泵的技術(shù)指標(biāo) P230高壓恒流泵 雙柱塞串聯(lián)式 P230p高壓恒流泵 雙柱塞串聯(lián)式 P270高壓恒流泵 雙柱塞并聯(lián)式 流量范圍選擇寬 可選擇微量 分析 制備 穩(wěn)定 重現(xiàn) 小結(jié) 3 進(jìn)樣系統(tǒng) 3 1功能與特點 功能 進(jìn)樣系統(tǒng)是將待分析樣品引入色譜柱的裝置 特點 進(jìn)樣重復(fù)性好死體積小耐高壓保證中心進(jìn)樣便于實現(xiàn)自動化 3 2分類 手動手動注射進(jìn)樣器手動進(jìn)樣閥自動圓盤式坐標(biāo)式其他 六通進(jìn)樣閥 可靠和重復(fù)自動注射樣品自動完成進(jìn)樣 清洗和編程自動稀釋 混合 衍生溫度控制生物兼容 3 3AS230自動進(jìn)樣器 小結(jié) 4 檢測器 連續(xù)監(jiān)測色譜柱分離組分的組成和含量 4 1HPLC檢測器基本要求 靈敏度高 線性范圍寬 通用響應(yīng)快 響應(yīng)值不受溫度及流動相影響噪音低 漂移小死體積小對樣品無破壞性方便便宜 示差折光檢測器RI紫外 可見 二極管陣列檢測器DAD熒光檢測器電化學(xué)檢測器蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)用技術(shù) LC MS LC MS MSLC NMR LC NMR MS 4 2常用HPLC檢測器類型 商品HPLC檢測器基本狀況電化學(xué)2 熒光3 二極管陣列4 示差折光5 UV vis6 放射性7 LC MS8 LC FTIR 單波長及可變波長紫外 可見檢測器光路圖 4 3紫外 可見檢測器 朗伯 比爾定律 紫外 可見檢測池結(jié)構(gòu) UV230 紫外可見檢測器 UV230 檢測器特性 寬范圍測定波長集成微型光學(xué)系統(tǒng)和二極管陣列技術(shù)光譜分辨率高 動態(tài)范圍寬波長準(zhǔn)確度和重復(fù)性高長壽命D2燈與W燈兼容生物HPLC系統(tǒng) UV230 檢測器功能 開機自檢 電源 燈狀態(tài)與能量 標(biāo)準(zhǔn)靈敏度時間波長程序高靈敏度吸收譜錯誤信息提示 UV230 檢測器技術(shù)指標(biāo) 波長范圍 190nm 720nm波長分辨率 6nm波長準(zhǔn)確度 0 5nm波長重復(fù)性 0 1nm時間波長程序 0 1min 999 9min響應(yīng)時間設(shè)定 0 0sec 9 9sec 基線噪聲 3 0X10 5 AU 基線漂移 5X10 4 AU h 反相標(biāo)樣 UV230 波長程序 蘇丹紅 UV230 波長程序 流通池的選擇 分析池光程 10mm 體積 10 L半制備池光程 3mm 體積 5 L微量池光程 3mm 體積 1 2 L 4 4二極管陣列檢測器 DAD DAD230二極管陣列檢測器是大連依利特分析儀器有限公司在國家科技部 九五 攻關(guān)項目的支持下 開發(fā)的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高性能檢測器 EC2000DAD數(shù)據(jù)處理工作站特點 等高線 光譜 色譜圖 三維圖 旋轉(zhuǎn)與局部放大三維圖 單波長 雙波長吸收比 波長時間程序 最大吸收波長 總體吸收色譜圖 色譜工作站所有定性定量功能色譜峰純度判斷 等高線圖法 光譜色譜三維圖法 重疊光譜圖法 波長比圖法和色譜峰純度計算法等 譜圖庫管理與檢索程序 建立特定的紫外譜圖庫 自動從光譜 色譜三維數(shù)據(jù)中對各色譜峰提取光譜圖 自動譜圖庫檢索 梯度控制 低壓 高壓 依利特DAD記錄三維光 色譜圖 等高線圖1苯 2聯(lián)苯 3萘 4蒽 5螢蒽 其中b的2 3之間有二甲苯 總體性能檢測器濃度敏感性檢測器中等靈敏度對壓力和溫度的變化很敏感流動相流速影響檢測信號 流通池的幾何形狀 大小及材料 檢測器的光路系統(tǒng) 4 5示差折光檢測器 通用型檢測器 示差折光檢測器檢測池示意圖 依利特RI230示差折光檢測器 4 6蒸發(fā)光散射檢測器 有望作為新一代通用型檢測器 蒸發(fā)光散射檢測器的優(yōu)點及限制 優(yōu)點通用型質(zhì)量檢測器靈敏度高于RI可以進(jìn)行梯度洗脫可作為SEC和SFC色譜 細(xì)內(nèi)徑LC檢測器可測定磷脂 皂甙 糖類 聚合物 樹脂限制受樣品組分和流動相的揮發(fā)性的影響 ChromachemELSD檢測器 4 6其它檢測器 熒光檢測器 激光誘導(dǎo)熒光檢測器電化學(xué)檢測器聯(lián)用技術(shù) LC MS LC MS MSLC NMR LC NMR MS LIFD230激光誘導(dǎo)熒光檢測器 激發(fā)光波長 nm 473發(fā)射光中心波長 nm 525 510 540 激光類型10mWDPSS激光473nm 主要特點 全新的光路系統(tǒng)模塊 采用共聚焦光學(xué)配置 減小了雷利散射和拉曼散射所引起的背景噪聲 在發(fā)射通路上以長通濾光片及帶通濾光片配合使用 以消減進(jìn)入光電倍增管的激光散射 提高檢測器的信噪比 對聚光物鏡的數(shù)值孔徑進(jìn)行優(yōu)化 以使物鏡的工作距離和其聚光能力相匹配 采用大數(shù)值孔徑的物鏡 增加了物鏡的采光效率 專用型檢測池模塊 采用反射式Z 型檢測池 實現(xiàn)了熒光的高效采集 大大提高了LIFD的靈敏度 專用型激光器電源模塊 小結(jié) 測得出來 盡量靈敏 多用途 5 色譜柱 色譜柱是HPLC分離過程的核心 1 柱頭螺絲2 過濾篩板3 色譜柱管刃環(huán)4 柱頭壓帽5 色譜柱柱管 零死體積連接 3微米多孔二氧化硅微球 不同品牌填料性能參數(shù)比較 分析 制備 固定相顆粒粒徑使用情況調(diào)查 實際應(yīng)用中HPLC色譜固定相類型 柱重復(fù)性公司信譽柱壽命技術(shù)支持塔板數(shù)柱硬件設(shè)計產(chǎn)品資料其他 選擇HPLC柱優(yōu)先考慮的因素 小粒徑短柱快速色譜制備柱整體柱專用色譜柱 蛋白質(zhì) 肽 氨基酸 核酸 糖 手性 高通量柱 開發(fā)新藥和組合化學(xué) 樣品制備處理柱高光潔度柱管 內(nèi)襯玻璃 PEEK 色譜柱發(fā)展方向 內(nèi)徑80mm柱長250mm填料 SinoChromODS BP粒度 20微米最大上樣量 2g 俊杰制備色譜柱 6 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 什么是工作站 由一臺個人電腦為中心 實現(xiàn)色譜信號數(shù)據(jù)采集及處理 并實時控制色譜儀各部件的運行 從而形成閉環(huán)的控制系統(tǒng) 稱色譜工作站 色譜工作站的基本功能 包含色譜積分儀的全部功能儀器控制功能計算機軟件平臺所提供的功能 GPC DAD 7 其他 7 1LU230低壓梯度混合器 特點采用四入一出高質(zhì)量快速響應(yīng)電磁閥 保證流動相組成的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性 單片機計算扣除電磁閥啟動時間 使得流動相組成變化步長減少到0 1 提高了流動相比例精度 并且有效降低了流動相切換周期 保證流動相均勻穩(wěn)定 基于流動相流速參數(shù)控制電磁閥切換速度設(shè)定功能 保證在較高和較低流速下流動相分配的準(zhǔn)確性 同時延長了電磁閥壽命 泵后靜態(tài)混合器使溶劑混合快速 均勻 保證了分析結(jié)果的重現(xiàn)性 同時降低了基線噪聲 計算機控制和面板設(shè)置2 4元低壓梯度 實時顯示各通道比例 可選擇內(nèi)置DG230在線脫氣機 減小了儀器組合體積 7 2脫氣機 依利特DG230在線脫氣機 脫氣機原理圖 Teflon AF聚合物中空纖維脫氣膜 7 3柱溫箱