蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾

概念 從廣義上說 凡通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去 而使蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變 都可以稱為蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾 包括兩個(gè)方面 1 側(cè)鏈基團(tuán)的改變 2 主鏈結(jié)構(gòu)的改變 前者屬于化學(xué)修飾的范疇 而后者則屬于基因重組和定點(diǎn)突變的方法 蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的意義 改變蛋白質(zhì)的藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性以及活性改變蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象 化學(xué)修飾的原理 影響蛋白質(zhì)化學(xué)修飾反應(yīng)進(jìn)程的因素有 1蛋白質(zhì)功能基的反應(yīng)性 親核性 1 1基團(tuán)之間的氫鍵及靜電作用1 2基團(tuán)之間的空間位阻2修飾劑的反應(yīng)性2 1選擇吸附2 2靜電相互作用2 3位阻因素 化學(xué)修飾的方法學(xué) 1試劑的選擇水解穩(wěn)定性 蛋白質(zhì)的修飾位點(diǎn) 反應(yīng)類型以及專一性 修飾劑的大小 連接鍵的穩(wěn)定性 毒性和抗原性 修飾后是否需要進(jìn)一步的分離 是否適于建立快速 方便的分析方法 是否能夠簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)的合成或購買 反應(yīng)條件的選擇考慮因素包括pH 反應(yīng)溫度 反應(yīng)介質(zhì)以及緩沖液組成允許反應(yīng)順利進(jìn)行不能造成蛋白質(zhì)的不可逆變性有利于專一性修飾蛋白質(zhì) 修飾反應(yīng)的類型 ?；捌湎嚓P(guān)反應(yīng)烷基化反應(yīng)氧化還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng) 蛋白質(zhì)的PEG修飾 聚乙二醇 polyethyleneglycol PEG 修飾又稱分子的PEG化 PEGalation 是目前蛋白質(zhì)化學(xué)修飾最重要的技術(shù)之一 是用來解決或緩解蛋白和多肽在藥用過程中存在的諸多問題的有效途徑 PEG是由乙二醇單體聚合而成的線性高分子材料 分子組成為HO CH2 CH2 O CH2 CH2 O n CH2 CH2 OH PEG鏈還可以與馬來酸酐進(jìn)一步共聚形成梳狀的PEG衍生物 簡(jiǎn)稱PM PEG分子中存在的大量乙氧基能夠與水形成氫鍵 使PEG具有良好的水溶性 分子末端剩余的羥基通過適當(dāng)方式活化后可與各類蛋白分子相偶聯(lián) 由于PEG無毒 具有良好生物相容性和血液相容性 使它成為一種被廣泛使用的生物修飾材料 對(duì)于各種具有藥用潛能的蛋白來說 采用PEG修飾的目的主要有以下三個(gè)方面 1 增加穩(wěn)定性 延長(zhǎng)血漿半衰期 2 降低免疫原性和抗原性 3 降低毒副作用 1增加穩(wěn)定性和延長(zhǎng)血漿半衰期一些以注射方式使用的藥用蛋白 由于在血液中存留的時(shí)間過短 在很大程度上限制了其正常藥效的發(fā)揮 通過PEG修飾 一方面增加了分子量 降低了腎臟的排泄速率 另一方面 偶聯(lián)的PEG鏈在蛋白分子表面產(chǎn)生空間位阻效應(yīng) 減弱了血液中各種水解酶對(duì)蛋白的水解作用 從而有效地延長(zhǎng)了蛋白在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的保留時(shí)間 2降低抗原性和免疫原性通過PEG修飾來消除免疫反應(yīng)活性 將異源性蛋白轉(zhuǎn)化為非免疫原性的藥用蛋白 主要是利用無免疫原性的PEG分子鏈與蛋白表面的基團(tuán)相偶聯(lián) 進(jìn)而在蛋白表面形成一道屏障 將暴露的抗原結(jié)合位點(diǎn)屏蔽起來 分子構(gòu)型獨(dú)特的梳狀PEG具有更強(qiáng)的屏蔽功能 因而在這方面的應(yīng)用更為普遍 3降低毒副作用通過基因重組技術(shù)獲得的大規(guī)模生產(chǎn)的TNF a IL 2和IFN g等是一類很有前途的抗腫瘤新藥 但由于它們的血漿半衰期短 為達(dá)到顯著的臨床治療效果不得不加大使用劑量 這就常常引起嚴(yán)重的毒副作用 近年來發(fā)現(xiàn) 利用PEG修飾技術(shù)對(duì)這些蛋白進(jìn)行處理后 能夠大大增加其血漿穩(wěn)定性 降低使用劑量 或在大的使用劑量下降低毒副作用 近年來 PEG修飾已成為提高其抗腫瘤效能 降低毒副作用的有效手段 PEG對(duì)蛋白藥物修飾的研究及應(yīng)用進(jìn)展蛋白藥物的PEG修飾已卓有成效 國(guó)際知名的制藥公司已經(jīng)或正在積極推進(jìn)蛋白藥物的PEG修飾 1991年第一種用PEG修飾的蛋白藥物PEG ADA被FDA批準(zhǔn)上市 近幾年上市的有PEG IFN PEG G CSF PEG 生長(zhǎng)抑素 目前處于臨床前研究的PEG修飾的蛋白藥物有幾十種 處于臨床實(shí)驗(yàn)的有 超氧化物歧化酶 即將上市 Enzon公司 白介素 2 期 Chiron公司 水蛭素 期 BASFAG公司 抗 TNF a抗體片段 期 Pharmacia公司 牛血紅蛋白 期 Enzon公司 抗 PDGF抗體片段 期 Celltech公司 TNF a是一種頗有價(jià)值的腫瘤治療藥物 它具有協(xié)同的抗腫瘤效能 一方面直接表現(xiàn)為對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用 另一方面可激活宿主的抗腫瘤應(yīng)答并選擇性地引起腫瘤組織內(nèi)部的微循環(huán)障礙 但是 TNF a在體內(nèi)的清除速率很快 要產(chǎn)生明顯的抗腫瘤效果需要非常大的使用劑量 由此常引發(fā)一系列嚴(yán)重的毒副作用 包括發(fā)熱 組織炎癥和組織損傷 甚至是致命的內(nèi)毒素性休克樣綜合征 要將其轉(zhuǎn)化為一種有效的抗腫瘤藥物必須有效地降低毒副作用 PEG修飾正是為達(dá)到這一目的 研究表明 利用mPEG5000對(duì)TNF a進(jìn)行化學(xué)修飾 通過對(duì)修飾條件的優(yōu)化處理 不僅能夠有效減少毒副作用 還可提高其抗腫瘤活性 當(dāng)賴氨酸殘基被修飾的程度分別為29 和56 時(shí) 其抗腫瘤活性分別增加了4倍和100倍 與天然TNF a相比 修飾產(chǎn)物的分子量明顯增大 延長(zhǎng)了藥物的有效作用時(shí)間 降低了毒副作用 促進(jìn)了它作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用 PEG修飾蛋白