中藥材中鞣質(zhì)含量測定方法的研究與優(yōu)化

中藥材中鞣質(zhì)含量測定方法的研究與優(yōu)化摘要: 參照藥典,采用磷鉬鎢酸 - 干酪素比色法 ,以沒食子酸為對照測定五倍子、地榆藥材中鞣質(zhì)的含量。探討藥典中規(guī)定的條件合理性，并增加了超聲條件優(yōu)化了實驗，平均加樣回收率為 97.39 %。本法可快速、準確地用于中藥材中鞣質(zhì)的含量測定,并可作為鞣質(zhì)提取工藝的優(yōu)化方案。關鍵詞: 鞣質(zhì)測定;波長；室溫浸提；干酪素；沒食子酸；超聲鞣質(zhì)又稱單寧(Tannins) ,是一類復雜的具有沉淀蛋白質(zhì)性質(zhì)的水溶性多元酚類化合物 ,廣泛存在于植物藥材,如五倍子、貫眾、兒茶等。近年來,對鞣質(zhì)生理活性的研究方興未艾。研究表明,鞣質(zhì)能清 除生物體內(nèi)過剩的自由基,維護細胞膜的流動和蛋白質(zhì)的構(gòu)象 ,防止輻射誘發(fā)的 DNA斷裂 ,從而在抑制脂質(zhì)過氧化、心血管病、抗癌、抗突變、抗衰老、抗白內(nèi)障等方面有獨特功效。鞣質(zhì)的經(jīng)典含量測定方法有很多種 ,如重量法、容量法、比色法等。最常用的有皮粉法、高錳酸鉀法、干酪素法、絡合量法。皮粉法是國際公認的鞣質(zhì)含量測定方法。皮粉的主要成分是蛋白質(zhì) ,鞣質(zhì)可通過分子中的酚羥基與蛋白質(zhì)的酰胺基形成氫鍵而結(jié)合成不溶于水的沉淀,以重量法測定含量。 中國藥典一部1鞣質(zhì)含量測定法一直沿用皮粉法 ,適用范圍廣。缺點是耗用樣品多,測定時間長 ,且沒有選擇性,測定結(jié)果偏高 ,而且皮粉用量很大。近年來,皮粉試劑的供應和質(zhì)量都很難保證,使皮粉法的應用受到很大限制。英國藥典2002 版2鞣質(zhì)測定法附錄采用的是磷鉬鎢酸 - 皮粉比色法,即利用鞣質(zhì)在堿性溶液中將磷鉬鎢酸還原產(chǎn)生深藍色,其吸收度與含量成正比,采用比色法測定。其中,以焦性沒食子酸為對照,測定總酚和不被皮粉吸附的酚,二者之差計為鞣質(zhì)的含量。 羅文毓等報道了改進的干酪素法3 ,其關鍵步驟是以干酪素代替皮粉,采用磷鉬鎢酸比色法測定; 藥材樣品提取采用浸泡過夜代替加熱回流提取等。本文參照英國藥典和干酪素法,重點對提取方法、顯色劑、干酪素用量等進行了比較,提出了鞣質(zhì)含量測定方法,為藥典相關附錄方法的修訂提供了實驗基礎。中國藥典42015年版2202鞣質(zhì)含量測定法已為沒食子酸為對照，測定測定總酚和不被干酪素吸附的酚,二者之差計為鞣質(zhì)的含量。并且同時進行干酪素吸附空白試驗，計算時扣除空白值。實驗為避光操作。4 本研究對中藥主要的化學活性成分鞣質(zhì)提取工藝的優(yōu)化，有利于地榆資源進一步的開發(fā)、利用，并為中藥材有效成分的富集提供理論依據(jù)。并改進鞣質(zhì)含量測定方法。1 儀器與試劑18系列紫外可見分光光度計【2007（C）北京普析通用儀器有限責任公司】; KQ-250B型超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）。鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、無水碳酸鈉;磷酸、鹽酸、干酪素、鞣酸（分析純）; 焦性沒食子酸、沒食子酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，經(jīng)色譜分析，純度98，) ;五倍子、地榆藥材(購自中藥材市場)。2 實驗方法探究21 測定波長的選擇探究 取對照品、總酚和不被吸附的多酚比色液 ,在 4001000nm波長測定 ,結(jié)果三種比色液均在 760nm 具最大吸收。繪制不同波長總酚比色液吸收曲線和不被吸附的多酚比色液吸收曲線。 結(jié)果表明，確定測定鞣質(zhì)含量最大吸收波長為 760nm。22 供試品溶液制備方法的比較探究5英國藥典2000 版鞣質(zhì)測定法藥材供試液提取方法采用加熱提取 ,羅文毓等報道,鞣質(zhì)遇熱不穩(wěn)定,采用室溫浸提過夜的方法操作簡單,提取完全。本試驗對加熱和冷浸提取兩種方法進行了比較。分別測定次數(shù)5次。冷浸過夜提取測定含量高于加熱提取法,且操作較簡單。結(jié)果表明,測定鞣質(zhì)含量供試品處理應采用室溫浸提過夜的提取方法。23 吸附劑的比較探究5英國藥典法采用皮粉作為吸附劑測定不被吸附的多酚類。參考文獻3干酪素對鞣質(zhì)的吸附更具專屬性,即可選擇性吸附有生理活性鞣質(zhì),而鞣酐等非活性鞣質(zhì)則不被吸附,選擇性較皮粉法高。以鞣酸為例,試驗分別采用皮粉和干酪素為吸附劑 , 測定含量。結(jié)果皮粉法測定值為 81118 % ,干酪素法測定值為 62126 %。結(jié)果表明,測定鞣質(zhì)含量吸附劑應為干酪素。2 4 干酪素用量的比較探究試驗考察了干酪素的用量對測定五倍子鞣質(zhì)含量結(jié)果的影響。干酪素用量的影響： 干酪素不同用量時測定含量3次取其平均值，測得干酪素用量和對應測得的含平均值為下:0.15g-18.26%,0.30g-23.24%，0.45g- 32.72%, 0.60%g- 32.82% , 0.75g-32.62 % ,0.90g- 32.86% 結(jié)果表明 , 對于測定樣品 , 三倍取樣量的干酪素用量基本可吸附完全。試驗使用干酪素 0.6 克。5結(jié)果表明,測定鞣質(zhì)含量干酪素用量為0.6g。2 5 對照品的比較探究5英國藥典2000 版鞣質(zhì)測定法附錄采用焦性沒食子酸為對照品,試驗表明焦性沒食子酸很不穩(wěn)定,溶液在室溫放置很快變色 ,必須新鮮配置使用?？紤]到?jīng)]食子酸具有相似的結(jié)構(gòu)和顯色行為 ,且已有含量測定用對照品,可以作為鞣質(zhì)含量測定對照物質(zhì)。實驗比較了焦性沒食子酸和沒食子酸分別作為對照的測定情況。以鞣酸含量測定為例, 采用不同對照物比較測定結(jié)果: 以沒食子酸對照, 測得含量平均值為 62.26 % ,以焦性沒食子酸對照,測得含量平均值為45.45 %。以沒食子酸對照 , 含量值較高。結(jié)果表明,測定鞣質(zhì)含量時對照品應采用沒食子酸。2. 6 超聲輔助的優(yōu)化比較探究62.6.1 單因素考察2.6.1.1超聲輔助提取的次數(shù)取干燥的地榆根粉末適量，加入15B/V 的60% C2H5OH，分別提取1、2、3、4、5 次，每次60 分鐘。提取物經(jīng)測定吸光度，計算含量結(jié)果提取次數(shù)對的總鞣質(zhì)的提取量有一定差異，但3、4、5 次差異不大，故而選定超聲次數(shù)1、2、3 次作為正交試驗考察的因素水平，進一步考察超聲輔助提取次數(shù)對提取的影響。2.6.1.2超聲輔助提取的時間取干燥的地榆根粉末適量，加入15B/V 的60% C2H5OH 溶液，并依此超聲提取20 分鐘、40 分鐘、60 分鐘、80 分鐘、100 分鐘。提取物經(jīng)測定吸光度，計算含量結(jié)果表明20 分鐘到60 分鐘提取量逐漸上升，故而選定45分鐘，60 分鐘，75 分鐘作為正交實驗考察的因素水平，進一步考察超聲輔助提取的時間對提取的影響。2.6.1.3溶劑濃度取干燥的地榆根粉末適量，分別加入15B/V的30% 、40% 、50% 、60% 、70% 、80% C2H5OH， 超聲提取60 分鐘。提取物經(jīng)測定吸光度， 計算含量結(jié)果表明70% 、60%C2H5OH 提取結(jié)果最好，故而選定50%、60%、70% C2H5OH 溶液作為正交實驗考察的因素水平，進一步考察溶劑濃度對提取的影響。2.6.1.4溶劑用量取干燥的地榆根粉末適量，分別加入5、10、15、20、25、30B/V 的60%C2H5OH，超聲提取60 分鐘。提取物經(jīng)測定吸光度，計算含量結(jié)果表明15B/V 的60% C2H5OH 提取結(jié)果最好，故而選擇10、15、20B/V 的溶劑用量，作為正交實驗考察的因素水平，進一步考察溶劑用量對提取的影響。2.6.3 L9 （34）正交試驗設計通過單因素實驗的結(jié)果考察，選擇超聲輔助提取次數(shù)A、超聲輔助提取時間B、溶劑濃度C、溶劑用量D 為考察的四組因素，采用L9 （34）正交試驗設計方法，確定地榆中總鞣質(zhì)的最佳提取方法為A3C3B2D2，即為超聲波輔助提取3 次，每次60 分鐘，溶劑為15B/V 的70%C2H5OH。通過顯著性檢驗及方法分析，得出各因素對地榆中總鞣質(zhì)提取效果影響的主次順序為ACBD。依照正交試驗的結(jié)果重復試驗5 次，計算得RSD 為1.74%。結(jié)果表明，測定鞣質(zhì)含量時最佳提取方法為超聲波輔助提取3 次，每次60 分鐘，溶劑為15B/V的70%C2H5OH。2. 7 顯色劑的穩(wěn)定性探究加入顯色劑磷鉬鎢酸試液，分別于15min、30min、45min、60min、75min、90min后測定吸光度，發(fā)現(xiàn)磷鉬鎢酸顯色 30 分鐘后反應完全, 顯色溶液在 3小時內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果表明，測定鞣質(zhì)含量時自加入磷鉬鎢酸顯色 30 分鐘后測定吸光度較好。 2. 8 堿性濃度的優(yōu)化探究 藥典規(guī)定，測定鞣質(zhì)含量時所使用的碳酸鈉堿性溶液的濃度為29%，溫度為碳酸鈉的溶解度影響較大，且高濃度的碳酸鈉較易析出結(jié)晶，影響測定結(jié)果，多采用低濃度碳酸鈉溶液，實驗分別用20%，25%，29%，35%碳酸鈉測定結(jié)果，取沒食子酸對照品溶液（0.05mg/ml）2ml,進行顯示測定，結(jié)果表明，四者吸光度基本一致。 結(jié)果表明，測定鞣質(zhì)含量時應采用20%碳酸鈉。 2. 9 實驗光照度的探究 強光照射會使顯色體系吸光度下降。 結(jié)果表明，測定鞣質(zhì)含量時需要使用棕色容量瓶并且避光操作。3方法學驗證31 線性關系考察本法為標準曲線法 , 每次測定5個均隨行測定 , 做 3 次測定數(shù)據(jù) , 表示線性關系情況 。32 重復性試驗取樣品 6 份 , 按正文方法測定, 測得含量結(jié)果，重復性試驗結(jié)果測定次數(shù)6次對應含量( %)分別為： 1- 42.80 2 -41.75 3 -41.02 4 -42.49 5 -42.53 6- 42.74 3 3 回收率試驗 取同一樣品 4 份,分別精密稱取約75mg ,置250ml 量瓶中,分別精密加入鞣酸溶液27.09mg (以沒食子酸計含量為 62126 %) 50ml ,加水100ml ,按供試品溶液制備方法制備,并按總酚和不被吸附的多酚測定法分別測定含量,計算回收率。回收率試驗結(jié)果如下：測定次數(shù)樣品中含量(mg) 加入量(mg) 測得量(mg) 回收率( %)1 33.26 27.09 59.37 96.382 34.56 27.09 60.66 96.333 33.85 27.09 60.47 98.264 34.70 27.09 61.41 98.60平均值97.39% RSD值 1.24%4 樣品測定4.1 對照品溶液的制備精密稱取沒食子酸對照品50mg ,置100ml 棕色量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,精密量取5ml,置 50ml棕色量瓶中,用水稀釋至刻度，搖勻,作為對照品溶液。 42 標準曲線的制備精密量取對照品溶液 1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml , 分別置25ml棕色量瓶中,各加入磷鉬鎢酸試液1ml,再分別加水 11ml、10ml、9ml、 8ml、7ml , 用 20%碳酸鈉溶液稀釋至刻度,搖勻。以相應的試劑為空白,照分光光度法,30分鐘后,在760nm波長處測定吸收度,以吸收度為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線。 4. 3 供試品溶液制備取地榆藥材,粉碎,過三號篩,分別稱取0.15g和0.75g,精密稱定,置250ml棕色量瓶中,加水150ml,放置過夜,超聲波輔助提取3 次，每次60分鐘，溶劑為15B/V的70%C2H5OH,放冷,用水稀釋至刻度,搖勻,靜置 (使固體物沉淀),濾過,棄去 50ml初濾液,精密量取續(xù)濾液20ml,置100ml棕色量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。 4. 4 測定4.4.1總酚測定 精密量取供試品溶液 2ml,置 25ml 棕色量瓶中,照標準曲線制備項下的方法,自“加 入磷鉬鎢酸試液 1ml”起, 加水10ml,同法測定吸收值,從標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量 (mg) ,計算,即得。4.4.2不被吸附的多酚測定取供試品溶液 25ml ,加至已盛有 0.6g 干酪素的100ml具塞錐形瓶中,密塞,置 30 水浴中保溫 1 小時,時時振搖,取出,放冷, 搖勻,濾過,棄去初濾液,精密量取續(xù)濾液2ml,置 25ml 棕色量瓶中, 照標準曲線制備項下的方法,自“加入磷鉬鎢酸試液 1ml”起,加水 10ml,同法測定吸收值,從標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量 (mg) ,計算,即得。4.4.3 干酪素吸附空白試驗取供純化水25ml ,加至已盛有 0.6g 干酪素的100ml具塞錐形瓶中,密塞,置 30 水浴中保溫 1 小時,時時振搖,取出,放冷, 搖勻,濾過,棄去初濾液,精密量取續(xù)濾液 2ml,置 25ml 棕色量瓶中,照標準曲線制備項下的方法,自“加入磷鉬鎢酸試液 1ml”起,加水 10ml,同法測定吸收值,從標準曲線中讀出空白干酪素的量（mg）。鞣質(zhì)含量 = 總酚量 - （不被吸附的多酚量-空白干酪素的量）(減去水分含量，以干燥品計算)樣品測定結(jié)果 13.96% 13.72% 平均值13.848.0%（藥典規(guī)定） 以前的中國藥典鞣質(zhì)含量測定法一直沿用皮粉法 ,該法確為經(jīng)典方法 , 但專屬性不強 , 皮粉用量大, 試驗周期長 , 已不適用于日常分析測定。2015年版藥典修訂提出了的新方法 ,在專屬性和測定精密度等方面都有了明顯的提高,試驗周期也大大縮短 (除樣品過夜提取外,一般僅需要 4 小時) 。本法對于2015年版藥典相關品種鞣質(zhì)