「實體瘤組織單細胞懸液制備」.doc

實體瘤組織單細胞懸液制備及培養(yǎng)方案一、 單細胞懸液制備(一) 儀器、材料及試劑1. 儀器：(1) CO2培養(yǎng)箱（調(diào)至37），離心機，水浴鍋（37），血球計數(shù)板；(2) 無菌器械：細胞培養(yǎng)瓶，50 ml離心管，平皿，吸管，移液管，紗布，200目/ 300目尼龍濾網(wǎng)，手術(shù)器械。2. 材料：腫瘤造模成功的大鼠3. 試劑：RPMI1640 培養(yǎng)基（含10%小牛血清），0.25%胰酶，Hanks液/PBS緩沖液，碘酒附：Hanks液配方： KH2PO4 ：0.06g；NaCl：8.0g；NaHCO3：0.35g；KCl：0.4g；Glucose：1.0g； Na2HPO4H2O：0.06g；加H2O定容至 1000 ml注：Hanks液可以高壓滅菌，4下保存。(二) 操作步驟 機械-胰酶消化法1. 取材：制備實體瘤單細胞懸液，腫瘤取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū)，取材時盡量避免用退變組織，挑選活力較好的部位。將大鼠麻醉，置75%酒精泡3-5 min（時間不能過長，以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)），固定后再用碘酒消毒腹部，帶入超凈臺內(nèi)解剖取腫瘤組織，置于平皿中。2. 用Hanks 液/PBS緩沖液洗滌三次，并剔除周圍脂肪、結(jié)締組織、血液等。3. 用無菌眼科手術(shù)剪將腫瘤剪成小塊（1-2 mm），再用Hanks 液/PBS緩沖液洗滌三次，轉(zhuǎn)移至50 ml 離心管中。4. 視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37中消化20-40 min，每隔5 min輕輕振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。5. 加入2-5 ml含血清培養(yǎng)基，以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。6. 靜置2-3 min，使未分散的組織塊下沉，將懸液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。7. 用200/300目尼龍網(wǎng)過濾懸液2次。8. 將過濾后懸液1000 rpm，離心5-10 min，棄上清液。9. 加入Hanks液/PBS緩沖液5 ml，輕輕沖散細胞，再離心一次，棄上清液。10. 視細胞量加入l-2 ml培養(yǎng)液，血球計數(shù)板計數(shù)。11. 將細胞調(diào)整到5105 /ml左右，轉(zhuǎn)移至25 ml細胞培養(yǎng)瓶中，37下培養(yǎng)?；蛘咧苯佑米髁魇椒治黾捌渌治?。二、 實體瘤組織中抗癌藥物含量檢測1. 按上述取材步驟取出合適的腫瘤組織，分成A、B兩份，分別置于含有1-2 ml PBS緩沖液的無菌離心管中（離心管及PBS液已稱重），準確稱量腫瘤組織的重量。A組可直接用于檢測組織中抗癌藥物的含量，B組用于檢測細胞內(nèi)抗癌藥物含量。2. B組組織按照上述步驟制成單細胞懸液，制備過程中，保留每一次的PBS洗液（1-2 ml），標記清楚，用于檢查含藥量。3. 將單細胞懸液計數(shù)，統(tǒng)計細胞總量，檢查細胞內(nèi)抗癌藥物含量。三、 腫瘤細胞培養(yǎng)(一) 腫瘤細胞培養(yǎng)1. 腫瘤細胞對培養(yǎng)基的要求不如正常細胞嚴格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細胞培養(yǎng)。腫瘤細胞多為貼壁細胞，將剛分散的細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶后，待4-5 h后觀察細胞貼壁情況，此時可更換新的培養(yǎng)基，除去未能貼壁的細胞碎片及死細胞。2. 每日觀察細胞生長增殖情況，待細胞貼壁密度大于90%時，可用胰酶消化，按1:5比例進行傳代到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板上，可根據(jù)需要適當調(diào)整接種比例，或者取適量消化后進行其他細胞實驗。(二) 成纖維細胞的排除成纖維細胞常與腫瘤細胞同時混雜生長，致難以純化腫瘤細胞。而且成纖維細胞常比腫瘤細胞生長得快，最終能壓制腫瘤細胞的生長。因此排除成纖維細胞成為腫瘤細胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。1. 機械刮除法：是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）。刮除程序為：1) 標記：鏡下觀察，用記號筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位；2) 刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標記空間；3) 用Hanks液/PBS緩沖液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細胞；4) 注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細胞殘留，可重復刮除至完全除掉為止2. 反復貼壁法：根據(jù)腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點，并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液，把含有兩類細胞的細胞懸液反復貼壁，使兩類細胞相互分離，操作方法與傳代相同。1) 待細胞生長達一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，Hanks /PBS緩沖液沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液；2) 取編號為此A、B、C三個培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)520分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B培養(yǎng)瓶中后；向A瓶中補充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)；3) 培養(yǎng)B瓶中細胞520分鐘后，接處理A的方法，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中；再向B瓶中補加完全培養(yǎng)基。4) 當三個瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細胞，B瓶兩類細胞相雜，C瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復處理多次，直至癌細胞純化為止。3. 消化排除法：1) 先是用0.5%胰蛋白酶和0.02EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細胞脫落下來后，便立即停止消化；2) 把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶內(nèi)也補加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用此法處理后，成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落。經(jīng)過幾次反復處理，可能把成纖維細胞除凈。4. 膠原酶消化法：本法是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點，通過消化進行選擇。1) 可用0.5 mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當發(fā)現(xiàn)成纖維細胞被除掉后，即終止消化；2) 用Hanks/PBS緩沖液洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細胞。如成纖維細胞未被除凈，可再次重復。四、 注意事項(一) 自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數(shù)可在有菌環(huán)境中進行。(二) 在超凈臺中，組織細胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā)。(三) 凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細菌落入。四、 無菌操作的幾個注意事項(一) 操作前要洗手，進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦拭。試劑等瓶口也要擦拭。(二) 點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后