間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)方法

間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)方法1. 間充質(zhì)干細胞MSC基本形態(tài)2. 干細胞應(yīng)用與干細胞調(diào)控。3. 間充質(zhì)干細胞MSC生長過程4. 間充質(zhì)干細胞MSC培養(yǎng)的合適氣體環(huán)境5. 細胞培養(yǎng)板的選擇6. 如何選用細胞培養(yǎng)基7. 如何維持培養(yǎng)液 p H8. 血清與干細胞的培養(yǎng)9. 胎牛血清（F B S ）是否需要滅活10. 細胞的細菌、真菌污染及排除11. 細胞培養(yǎng)污染的預(yù)防12. 使用胰蛋白酶時加入 E DTA的目的是什么13. 膠原酶的種類和選型14. 膠原酶 V S胰酶15. 干細胞的種類和表面標記16. 間質(zhì)干細胞培養(yǎng)原理概述17. 間質(zhì)干細胞成脂和成骨誘導(dǎo)分化18. 干細胞老化的表現(xiàn)和處理19. 細胞傳代消化過程指導(dǎo)20. 冷凍保護劑作用和選擇21. 細胞凍存指導(dǎo)22. 干細胞冷凍和復(fù)蘇23. 移植細胞的基因修飾1間充質(zhì)干細胞MSC基本形態(tài)體外培養(yǎng)細胞根據(jù)它們在培養(yǎng)器皿是否能貼附于支持物上生長特征，可分為貼附型生長細胞，常表現(xiàn)為成纖維型細胞和上皮細胞。懸浮型細胞在培養(yǎng)中懸浮生長。間充質(zhì)干細胞MSC基本形態(tài)：形態(tài)與成纖維細胞類似，細胞在支持物表面呈梭形或不規(guī)則三角形生長，細胞中央有卵圓形核，胞質(zhì)向外伸出23 厘米個長短不同的突起。可看到細胞成螺旋狀生長。2干細胞應(yīng)用與干細胞調(diào)控干細胞的調(diào)控是指給出適當?shù)囊蜃訔l件，對干細胞的增殖和分化進行調(diào)控，使之向指定的方向發(fā)展。2.1內(nèi)源性調(diào)控干細胞自身有許多調(diào)控因子可對外界信號起反應(yīng)從而調(diào)節(jié)其增殖和分化，包括調(diào)節(jié)細胞不對稱分裂的蛋白，控制基因表達的核因子等。另外，干細胞在終末分化之前所進行的分裂次數(shù)也受到細胞內(nèi)調(diào)控因子的制約。（1）胞內(nèi)蛋白對干細胞分裂的調(diào)控干細胞分裂可能產(chǎn)生新的干細胞或分化的功能細胞。這種分化的不對稱是由于細胞本身成分的不均等分配和周圍環(huán)境的作用造成的。細胞的結(jié)構(gòu)蛋白，特別是細胞骨架成分對細胞的發(fā)育非常重要。如在果蠅卵巢中，調(diào)控干細胞不對稱分裂的是一種稱為收縮體的細胞器，包含有許多調(diào)節(jié)蛋白，如膜收縮蛋白和細胞周期素A。收縮體與紡錘體的結(jié)合決定了干細胞分裂的部位，從而把維持干細胞性狀所必需的成分保留在子代干細胞中。（2）轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控在脊椎動物中，轉(zhuǎn)錄因子對干細胞分化的調(diào)節(jié)非常重要。比如在胚胎干細胞的發(fā)生中，轉(zhuǎn)錄因子Oct4 是必需的。Oct4 是一種哺乳動物早期胚胎細胞表達的轉(zhuǎn)錄因子，它誘導(dǎo)表達的靶基因產(chǎn)物是FGF-4 等生長因子，能夠通過生長因子的旁分泌作用調(diào)節(jié)干細胞以及周圍滋養(yǎng)層的進一步分化。Oct4 缺失突變的胚胎只能發(fā)育到囊胚期，其內(nèi)部細胞不能發(fā)育成內(nèi)層細胞團。另外白血病抑制因子（LIF）對培養(yǎng)的小鼠ES 細胞的自我更新有促進作用，而對人的成體干細胞無作用，說明不同種屬間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是不完全一致的。又如 Tcf/Lef 轉(zhuǎn)錄因子家族對上皮干細胞的分化非常重要。Tcf/Lef 是Wnt 信號通路的中間介質(zhì)，當與-Catenin 形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物后，促使角質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為多能狀態(tài)并分化為毛囊。2.2外源性調(diào)控除內(nèi)源性調(diào)控外，干細胞的分化還可受到其周圍組織及細胞外基質(zhì)等外源性因素的影響。（1）分泌因子間質(zhì)細胞能夠分泌許多因子，維持干細胞的增殖，分化和存活。有兩類因子在不同組織甚至不同種屬中都發(fā)揮重要作用，它們是TGF家族和Wnt 信號通路。比如TGF 家族中至少有兩個成員能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴干細胞的分化。最近研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)細胞衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）不僅能夠促進多種神經(jīng)元的存活和分化，還對精原細胞的再生和分化有決定作用。GDNF 缺失的小鼠表現(xiàn)為干細胞數(shù)量的減少，而 GDNF的過度表達導(dǎo)致未分化的精原細胞的累積。Wnts 的作用機制是通過阻止-Catenin 分解從而激活Tcf/Lef 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，促進干細胞的分化。比如在線蟲卵裂球的分裂中，鄰近細胞誘導(dǎo)的Wnt 信號通路能夠控制紡錘體的起始點和內(nèi)胚層的分化。（2）膜蛋白介導(dǎo)的細胞間的相互作用有些信號是通過細胞-細胞的直接接觸起作用的。-Catenin 就是一種介導(dǎo)細胞粘附連接的結(jié)構(gòu)成分。除此之外，穿膜蛋白Notch及其配體Delta 或Jagged 也對干細胞分化有重要影響。在果蠅的感覺器官前體細胞，脊椎動物的胚胎及成年組織包括視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮、骨骼肌和血液系統(tǒng)中，Notch 信號都起著非常重要的作用。當Notch 與其配體結(jié)合時，干細胞進行非分化性增殖；當Notch 活性被抑制時，干細胞進入分化程序，發(fā)育為功能細胞。（3）整合素（Integrin）與細胞外基質(zhì)整合素家族是介導(dǎo)干細胞與細胞外基質(zhì)粘附的最主要的分子。整合素與其配體的相互作用為干細胞的非分化增殖提供了適當?shù)奈h(huán)境。比如當1整合素喪失功能時，上皮干細胞逃脫了微環(huán)境的制約，分化成角質(zhì)細胞。此外細胞外基質(zhì)通過調(diào)節(jié)1整合素的表達和激活，從而影響干細胞的分布和分化方向。2.3干細胞的可塑性越來越多的證據(jù)表明，當成體干細胞被移植入受體中，它們表現(xiàn)出很強的可塑性。通常情況下，供體的干細胞在受體中分化為與其組織來源一致的細胞。而在某些情況下干細胞的分化并不遵循這種規(guī)律。1999 年 Goodell 等人分離出小鼠的肌肉干細胞，體外培養(yǎng)5 天后，與少量的骨髓間質(zhì)細胞一起移植入接受致死量輻射的小鼠中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌肉干細胞會分化為各種血細胞系。這種現(xiàn)象被稱為干細胞的橫向分化（trans-differentiation ）。關(guān)于橫向分化的調(diào)控機制目前還不清楚。大多數(shù)觀點認為干細胞的分化與微環(huán)境密切相關(guān)。可能的機制是，干細胞進入新的微環(huán)境后，對分化信號的反應(yīng)受到周圍正在進行分化的細胞的影響，從而對新的微環(huán)境中的調(diào)節(jié)信號做出反應(yīng)。3間充質(zhì)干細胞MSC生長過程潛伏期指數(shù)增生期停滯期（1）潛伏期(latent phase) 細胞接種后,先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時,細胞質(zhì)回縮, 胞體呈圓球形，然后細胞貼附于載體表面,稱貼壁,懸浮期結(jié)束。細胞貼壁速度與細胞種類, 培養(yǎng)基成分,載體的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。一般情況下，原代培養(yǎng)細胞貼壁速度慢,可達10-24 小時或更多, 而傳代細胞系貼壁速度快, 通常10-30分鐘即可貼壁。細胞貼壁后還需經(jīng)過一個潛伏階段，才進入生長和增殖期。原代培養(yǎng)細胞潛伏期長，約24-96 小時或更長, 連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅需6-24 小時。（2）指數(shù)增生期(logarithmic growth phase) 這是細胞增殖最旺盛的階段，分裂相細胞增多。指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長是否旺盛的一個重要標志。通常以細胞分裂相指數(shù)（Mitotic index, MI ）表示，即細胞群中每1000 個細胞中的分裂相數(shù)。一般細胞的分裂指數(shù)介于 0.1%-0.5% ，原代細胞分裂指數(shù)較低，而連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂相指數(shù)可高達35。指數(shù)增生期的細胞活力最好時期，是進行各種實驗最佳時期，也是凍存細胞的最好時機。在接種細胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù) 35 天后，隨著細胞數(shù)量不斷增多、生長空間減少，最后細胞相互接觸匯合成片。正常細胞相互接觸后能抑制細胞運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制現(xiàn)象(contact inhibition)。而惡性腫瘤細胞無接觸抑制現(xiàn)象，能繼續(xù)移動和增殖，導(dǎo)致細胞向三維空間擴展，使細胞發(fā)生堆積（piled up）。細胞接觸匯合成片后，雖然發(fā)生接觸抑制，但只要營養(yǎng)充分，細胞仍能進行增殖分裂，因此細胞數(shù)仍然在增多。但是，當細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)枯竭和代謝產(chǎn)物的影響，導(dǎo)致細胞分裂停止，這種現(xiàn)象稱密度抑制現(xiàn)象（Density Inhibition）。（3）停滯期(Stagnate phase) 細胞數(shù)量達到飽和密度后，如不及時進行傳代，細胞就會停止增殖，進入停止期。此時細胞數(shù)持平，故也稱平臺期（Plateau phase）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動。如不進行分離傳代，細胞會因培養(yǎng)液中營養(yǎng)耗盡、代謝產(chǎn)物積聚、pH 下降等因素中毒，出現(xiàn)形態(tài)改變，貼壁細胞會脫落，嚴重的會發(fā)生死亡，因此，應(yīng)及時傳代。4間充質(zhì)干細胞MSC培養(yǎng)的合適氣體環(huán)境干細胞相關(guān)的培養(yǎng)液都必須在 5 CO2 的氣體環(huán)境中培養(yǎng)使用。否則會對細胞產(chǎn)生影響。氣體是哺乳動物細胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分。開放培養(yǎng)時一般把細胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中。二氧化碳既是細胞代謝產(chǎn)物也是細胞生長繁殖所需成分，它在細胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的pH 值。大多數(shù)細胞的適宜pH 為7.2-7.4，偏離這一范圍對細胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響。一般情況下，細胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環(huán)境中更利于細胞生長。5細胞培養(yǎng)板的選擇細胞培養(yǎng)板依底部形狀的不同可分為平底和圓底（U 型和V 型）；培養(yǎng)孔的孔數(shù)有6、12、24、48、96、384、1536 孔等；根據(jù)材質(zhì)的不同有Terasaki 板和普通細胞培養(yǎng)板。具體選擇時根據(jù)培養(yǎng)細胞的類型、所需培養(yǎng)體積及不同的實驗?zāi)康亩ā＃?）平底和圓底（U 型和V 型）培養(yǎng)板的區(qū)別和選擇 不同形狀的培養(yǎng)板有不同用途。培養(yǎng)細胞，通常是選用平底的，這樣便于鏡下觀測、有明確的底面積、細胞培養(yǎng)液面高度相對一致。因此做MTT 等實驗時，無論是貼壁和懸浮細胞，一般選用平底板。測吸光值一定要使用平底的培養(yǎng)板。要特別注意材質(zhì)，標示“Tissue Culture (TC) Treated”是養(yǎng)細胞用的。 U 型或V 型板，一般在某些特殊要求時才使用。如在免疫學(xué)方面，當做兩種不同淋巴細胞混合培養(yǎng)時，需要二者相互接觸刺激，這時一般會選用U 型板，因為細胞會由于重力的作用而聚集在很小的范圍內(nèi)內(nèi)。圓底培養(yǎng)板還會用于同位素摻入的實驗，需要用細胞收集儀收集細胞的培養(yǎng)，如“混合淋巴細胞培養(yǎng)”等。V型板常用做細胞殺傷、免疫學(xué)血凝集實驗。細胞殺傷這種實驗也可用U 型板替代（加入細胞后，低速離心)。 （2）Terasaki 板和普通細胞培養(yǎng)板的區(qū)別Terasaki plate主要是用于晶體學(xué)研究，產(chǎn)品設(shè)計便于對晶體的觀察與結(jié)構(gòu)分析。有兩種 sitting 和 handing drop 兩種方法，兩種方法應(yīng)用產(chǎn)品的外形結(jié)構(gòu)也不同。材料上選擇crystal class polymer ，特殊的材料有利觀察晶體結(jié)構(gòu)。細胞培養(yǎng)板主要是PS 材料，材料是treated sufface，便于細胞貼壁生長與伸展。當然還有浮游細胞的生長材料，同時還有l(wèi)ow binding surface （3）細胞培養(yǎng)板與酶標板的區(qū)別 酶標板一般要比細胞培養(yǎng)板貴，細胞板主要做細胞培養(yǎng)，也可以用來測蛋白濃度；酶標板包括包被板和反應(yīng)板，一般不用做細胞培養(yǎng)，它主要做免疫酶聯(lián)反應(yīng)后的蛋白檢測，需要更高的要求和特定的酶標工作液。（4 ）常用不同培養(yǎng)板的孔底面積及推薦加液量 不同孔板所加培養(yǎng)液的液面都不宜太深，一般在23mm 范圍，結(jié)合不同孔的底面積就可算出各培養(yǎng)孔的適宜加液量（參考下表）。若加液量過多會影響氣體（氧氣）交換，而且在搬動過程中易溢出造成污染。具體所加細胞密度依實驗的目的不同靈活掌握。常用的培養(yǎng)器皿 培養(yǎng)器皿 底面積（cm2） 加培養(yǎng)液量（mL） 可獲細胞量96 孔培養(yǎng)板 0.32 0.1 10524 孔培養(yǎng)板 2 1.0 510512 孔培養(yǎng)板 4.5 2.0 1066 孔培養(yǎng)板 9.6 2.5 2.51064 孔培養(yǎng)板 28 5.0 71063.5cm 培養(yǎng)皿 8 3.0 2.01066cm 培養(yǎng)皿 21 5.0 5.21069cm 培養(yǎng)皿 49 10.0 12.210610cm 培養(yǎng)皿 55 10.0 13.710625cm 塑料培養(yǎng)瓶 25 5.0 5.210675cm 塑料培養(yǎng)瓶 75 1530 210725cm 玻璃培養(yǎng)瓶 19 4.0 3106100cm 玻璃培養(yǎng)瓶 37.5 10.0 6106250cm 玻璃培養(yǎng)瓶 78 15.0 21072500cm 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶 700 100250 2.5108注：各種單層生長的細胞在培養(yǎng)皿中長滿的細胞數(shù)，主要取決于器皿底表面積和細胞體積的大小。上表以293 細胞為例給出的可獲細胞量僅作參考。 6如何選用細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)基是維持體外細胞生存和生長的基本溶液，是組織細胞培養(yǎng)時最重要的條件。細胞培養(yǎng)基大致有： （1）合成培養(yǎng)基 主要成分為：氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽、輔助物質(zhì)（核酸降解物、氧化還原劑等）。常用的有：199細胞培養(yǎng)基及其改良品種。 1950年由Morgan 等設(shè)計，除BSS 外，含有53 種成分，添加適量的血清后，可廣泛用于多種細胞培養(yǎng)、病毒學(xué)、疫苗生產(chǎn)等。 199 （HB）細胞培養(yǎng)基，主要應(yīng)用于Vero 細胞、地鼠腎細胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)狂犬、乙腦等疫苗，具有高緩沖性能，能夠有效提高病毒滴度。BME細胞培養(yǎng)基?；A(chǔ)Eagle 培養(yǎng)基（Basal Medium Eagle），1955 年由Eagle 設(shè)計，BSS12 種氨基酸谷氨酰胺8種維生素。簡單、便于添加，適于各種傳代細胞系和特殊研究用，在此基礎(chǔ)上改良的細胞培養(yǎng)基品種有MEM、DMEM、IMDM 等。MEM細胞培養(yǎng)基。低限量Eagle 培養(yǎng)基（Minimal Essential Medium），1959 年修改配方，刪去賴氨酸、生物素，增加氨基酸濃度，適合多種細胞單層生長，是一種最基本、適用范圍最廣的培養(yǎng)基，是一種被廣泛應(yīng)用的培養(yǎng)基。需要注意的是，MEM 細胞培養(yǎng)基有含 Earles 平衡鹽的類型，也有含 Hanks平衡鹽的類型；有高壓滅菌型的，也有過濾除菌型的；還有含非必需氨基酸的類型。生產(chǎn)和科研時，應(yīng)根據(jù)實際情況注意選擇合適的MEM 細胞培養(yǎng)基。另外，因MEM 培養(yǎng)基營養(yǎng)成分所限，針對生產(chǎn)之特定細胞培養(yǎng)與表達時，并不一定是使用效果最佳或者最經(jīng)濟的培養(yǎng)基。DMEM細胞培養(yǎng)基及其改良品種。 DMEM 由Dulbecco 改良的Eagle 培養(yǎng)基，各成份量加倍，分低糖（1000mg/L）、高糖（4500mg/L ）。細胞生長快。附著稍差的腫瘤細胞、克隆培養(yǎng)用高糖效果較好，常用于雜交瘤的骨髓瘤細胞和DNA 轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化細胞培養(yǎng)。例如CHO 細胞表達生產(chǎn)乙肝疫苗、CHO 細胞表達EPO。 IMDM 細胞培養(yǎng)基。 IMDM 是由Iscoves 改良的Eagle 培養(yǎng)基，增加了幾種氨基酸和胱氨酸量?？捎糜陔s交瘤細胞培養(yǎng)，以及無血清培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。 RPMI-1640 細胞培養(yǎng)基。 Moore 等人于1967 年在Roswell Park Memorial Institute 研制，針對淋巴細胞培養(yǎng)設(shè)計，BSS21種氨基酸維生素11 種等，廣泛適于許多種正常細胞和腫瘤細胞，也用做懸浮細胞培養(yǎng)。 Fischers細胞培養(yǎng)基。用于白血病微粒細胞培養(yǎng)。 HamF10、F12 細胞培養(yǎng)基。 1963 年、1969 年由Ham 設(shè)計，含微量元素，可在血清含量低時用，適用于克隆化培養(yǎng)。F10適用于倉鼠、人二倍體細胞，F(xiàn)12 適用于CHO 細胞。DMEM/F12細胞培養(yǎng)基。 DMEM 和F12 細胞培養(yǎng)基按照 1:1 比例混合效果最佳，營養(yǎng)成分豐富，且可以使用較少血清，或作為無血清培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。 （2）低血清細胞培養(yǎng)基 主要應(yīng)用于VERO 細胞、BHK21 細胞等細胞在轉(zhuǎn)瓶、微載體反應(yīng)器中的培養(yǎng)。（3）無血清培養(yǎng)基 是設(shè)計用來在無血清條件下促使特殊類型的細胞生長或進行專門應(yīng)用的培養(yǎng)基。需要添加生長因子和或細胞因子，含有個別蛋白或大量蛋白組分。 （4）替代天然培養(yǎng)基 培養(yǎng)基中不包含有蛋白、水解產(chǎn)物或未知結(jié)構(gòu)的組分，所有的成分均有已知的化學(xué)結(jié)構(gòu)。面對如此多的細胞培養(yǎng)基，對細胞培養(yǎng)基的選用，建議：可以查閱相關(guān)文獻，或在購買細胞株時咨詢選用最適合細胞株的培養(yǎng)基，或購買相配套的細胞培養(yǎng)基產(chǎn)品。 許多培養(yǎng)基都適合多種細胞株的培養(yǎng)，可以采用現(xiàn)有的培養(yǎng)基進行試驗。根據(jù)細胞株的特點、實驗的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細胞株多選 1640；進行細胞雜交、基因轉(zhuǎn)移實驗，可選擇IMDM。結(jié)合細胞特性及培養(yǎng)基的培養(yǎng)效能，用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、克隆形成率等指標判斷，根據(jù)實驗結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基。注：目前也有不少商業(yè)化的msc培養(yǎng)基，如百恩維的間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基，間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基（低血清）7如何維持培養(yǎng)液 p H配好的培養(yǎng)液變堿（變紫紅）是正常的現(xiàn)象。暴露在空氣中的培養(yǎng)液，因為大氣中二氧化碳的濃度很低，培養(yǎng)液中的HCO3 -被漸漸耗掉，培養(yǎng)液的pH值也逐漸升高，變成了紫紅色。如果培養(yǎng)基pH值偏堿的程度不大，可將裝培養(yǎng)液的瓶口擰松，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱中一段時間，讓培養(yǎng)箱中的CO2進入培養(yǎng)液，pH值就可以糾正。如果pH值偏離的程度很大，可以通過添加少量無菌的H Cl 或者NaOH調(diào)節(jié)pH，便可以使用。將配制好的培養(yǎng)基小劑量分裝，可以避免反復(fù)開蓋引起其中的二氧化碳逸出而造成pH升高。同時因NaHCO3遇熱不穩(wěn)定，會分解釋放出CO2 ，而使培養(yǎng)基的pH升高，偏堿。因此在配置使用培養(yǎng)的過程中應(yīng)注意： （1）動作迅速，不可使培養(yǎng)液長時間處于較高室溫下； （2）配置過程中，混勻時切不可加熱。混勻后應(yīng)立即放入4C 冰箱，待過濾時再取出； （3）使用完畢應(yīng)盡快將瓶口封好，放于4C 冰箱保存。通過在培養(yǎng)液中同時添加Hepes 也可以有效的穩(wěn)定pH 值。Hepes （羥乙基哌嗪乙硫磺酸）是一種非離子兩性緩沖液,它在pH 7.27.4范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力。其最大優(yōu)點是在開放式培養(yǎng)或細胞觀察時能維持較恒定的pH 值。在這種培養(yǎng)條件下，細胞培養(yǎng)瓶的蓋子應(yīng)擰緊，以防止培養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。該緩沖液使用的終濃度為1050mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/L Hepes 便可達到緩沖能力。Hepes 的使用方法有以下兩種：（1）Hepes 可按所需的濃度直接加入到配制的培養(yǎng)液中，再過濾除菌。每1000ml 培養(yǎng)液中加入2.38 克HEPES，溶解后用1N NaOH 調(diào)pH 至7.2，過濾除菌后使用。此時HEPES 的使用濃度為10 mmol/L。（2）配成 100x 貯存液（1 mol/L），使用前取 99mL 培養(yǎng)液加入 lmL 貯存液，最終應(yīng)用濃度仍為 10 mmol/L。1 mol/L （100x）Hepes 貯存液配制方法：取23.8g Hepes 溶于90ml 雙蒸水中，用1N NaOH 調(diào)pH 至7.58.0，然后用水定容至100mL，過濾除菌，分裝小瓶（2mL/瓶），4或-20保存。8血清與干細胞的培養(yǎng)干細胞在體內(nèi)存在的量很少，處在一個個環(huán)境相對穩(wěn)定的“niche”中，所以一旦完成分離進入體外環(huán)境，最重要的就是保證細胞的活力不受影響，那么就必須提供一個相對穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境。這些環(huán)境就是靠培養(yǎng)基和培養(yǎng)箱來提供了。培養(yǎng)液中最重要的莫過-血清，特別是對干細胞來說。所以為了最優(yōu)的干細胞培養(yǎng)效果，推薦選用對應(yīng)的干細胞專用血清。牛血清是最常用的，但是根據(jù)血清的來源不同又可以分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新牛血清取自出生24 小時之內(nèi)的新生牛；小牛血清取自出生1030 天的小牛。顯然，胎牛血清是品質(zhì)最高的，因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少，所以也成為了干細胞培養(yǎng)的首選。 培養(yǎng)中如何正確的使用血清？避免不好的影響呢？血清的濃度：對大部分的干細胞，最佳的血清濃度是10%。過高的血清濃度會導(dǎo)致細胞出現(xiàn)分化的現(xiàn)象，如果是需要高濃度的血清，培養(yǎng)的時間也不能超過兩周，否則會導(dǎo)致細胞分化能力下降。過低的血清會導(dǎo)致細胞的增殖速度下降。血清的溶解：必須在 4進行，最好過夜溶解。這樣可以減少沉淀的產(chǎn)生，避免營養(yǎng)物質(zhì)的流式。同時也要避免血清的過濾，如果需要過濾可以和培養(yǎng)基一起過濾。細胞培養(yǎng)液中添加的血清有牛血清、馬血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分為胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是從母牛破腹取出的胎牛中分離出的血清，價格昂貴。新生小牛血清是從剛出生的尚未哺乳的小牛中分離出來的血清，如廠家能做到這一點，新生小牛血清的質(zhì)量與胎牛血清的質(zhì)量相差不大。如小牛出生后已哺乳，從這種小牛中取出的血清中可能含有較多的生物活性物質(zhì)，其質(zhì)量明顯不如前兩種。血清的質(zhì)量，種類及使用的濃度都有可能影響細胞的生長，而不同批次的血清支持細胞生長的能力也不同，尤其是對克隆細胞的生長，某些批次血清可能含有毒性或抑制細胞生長的物質(zhì)。注意以下幾點：（1）需要長期保存的血清必須儲存于-20或-80低溫冰箱中。4冰箱中保存時間切勿超過1 個月。由于血清結(jié)冰時體積會增加約10，因此，血清在凍入低溫冰箱前，必須預(yù)留一定體積空間，否則易發(fā)生污染或玻璃瓶凍裂。（2）瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法：-20 或 -80 低溫冰箱中的血清放入4冰箱中溶解1 天。然后移入室溫，待全部溶解后再分裝。在溶解過程中需不斷輕輕搖晃均勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。切勿直接將血清從-20 進入37解凍，這樣因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝集而出現(xiàn)沉淀。影響使用效果?。?）熱滅活是指56, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理的目的是使血清中的補體成分（complement ）滅活。除非必須，一般不建議作此熱處理，因為熱處理會造成血清沉淀物顯著增多，而且還會影響血清的質(zhì)量。補體參與反應(yīng)有：細胞毒作用, 平滑肌細胞收縮, 肥大細胞和血小板釋放組胺, 增強吞噬作用, 促進淋巴細胞和巨噬細胞發(fā)生化學(xué)趨化和活化。（4 ）切勿將血清在 37放置太久，否則血清會變得渾濁，同時血清中的有效成分會破壞而影響血清質(zhì)量。（5）血清中的沉淀物 絮狀物：主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量?？捎秒x心3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理。顯微鏡下“小黑點”：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點”，常誤認為血清受污染。一般情況下，此小黑點不會影響細胞生長。9胎牛血清（F B S ）是否需要滅活滅活的目的是去除血清中的補體成分，避免補體對細胞產(chǎn)生細胞毒害作用。胎牛血清（FBS）對許多細胞系均有促生長作用，主要適用于細胞株的保藏及特殊用途的細胞株的體外培養(yǎng)。胎牛血清是取自剖腹產(chǎn)的胎牛。因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞生長有害的成分最少，質(zhì)量是最高的。所以不必要滅活。10細胞的細菌、真菌污染及排除真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，尤其在梅雨季節(jié)進行細胞培養(yǎng)更易污染。污染培養(yǎng)細胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁，倒置顯微鏡下可見于細胞之間縱橫交錯穿行的絲狀、管狀、及樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。很多菌絲在高倍鏡可見到有鏈狀排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形，散在細胞周邊和細胞之間生長。鏡下看時，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。細菌是一種原核細胞微生物，其大小以微米（m）計。常見的污染細菌有革蘭氏陰性菌和大腸桿菌、假單胞菌等，革蘭氏陰性菌中白色葡萄球菌等比較常見。一旦發(fā)生細菌污染較易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象；有時靜置的培養(yǎng)液液體初看不混濁，但稍加振蕩，就有很多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮。必要時可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查以證實細菌種類；有的培養(yǎng)液改變不明顯而又疑有污染，可取出少量培養(yǎng)液用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可取 10ml 細胞懸液以 100rpm 離心5min，沉淀中加入無抗生素的培養(yǎng)液2ml，置于37培養(yǎng)，24h 可得結(jié)果。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗， 最后變圓脫落死亡，造成試驗失敗和細胞株(系)丟失。細菌和真菌污染多在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發(fā)生，而且由于增生迅速，多再發(fā)生污染48h以內(nèi)就已明顯。在實驗的最初兩天密切觀察實驗樣品是否有污染發(fā)生，有利于及時采取措施予以補救或排除。培養(yǎng)細胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。如果污染細胞價值不大，宜棄之；有細胞株留存的或可購置的，可在尋找原因后徹底消毒操作室和二氧化碳培養(yǎng)箱(若發(fā)現(xiàn)真菌污染，可在污染孔內(nèi)加入1mol/L氫氧化鈉或硫酸銅11細胞培養(yǎng)污染的預(yù)防溶液處理（具體操作方法可參考細胞培養(yǎng)污染的預(yù)防），復(fù)蘇或重新購置細胞，再培養(yǎng)。若污染細胞價值較大，又難于重新得到，可采用510 倍于常用量的抗生素沖擊，加入高濃度抗生素后作用2448h，再換入常規(guī)培養(yǎng)液，有時可能奏效。細胞培養(yǎng)中常用的抗生素及用量見下表。 常用抗生素用量和效應(yīng) 抗生素 抗菌譜 濃度（量/mL）細菌 真菌 支原體 青霉素 G+ 1001000g鏈霉素 G- 1001000g慶大霉素 G+ /G- + 50200g四環(huán)素 G+ /G- + 1050g卡那霉素 G+ /G- + 1001000g兩性霉素 + 常用2g/mL制霉菌素 + 常用25g/mL+表示效應(yīng)程度 高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素 B 和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。 （1）在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細胞，稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度。 （2）分散細胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B 推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml 。 （3）每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。 （4）確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度23 倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞23 代。（5）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代。 （6）重復(fù)步驟4 。 （7）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)46 代，確定污染是否以已被消除。12使用胰蛋白酶時加入 E DTA的目的是什么體外培養(yǎng)的細胞受到嚴重污染時，有時即使想盡各種辦法也難以挽回。因此，防止污染，預(yù)防是關(guān)鍵。只有將預(yù)防措施貫穿于整個細胞培養(yǎng)的始終，才能將發(fā)生污染的可能性降到最小程度。 一般預(yù)防可從以下幾方面著手： （1）添加抗生素 各種抗生素性質(zhì)不同，對各種微生物的作用也不同，聯(lián)合應(yīng)用比單用效果好，預(yù)防性應(yīng)用比污染后使用好（但迄今尚無對抗支原體特效抗生素）。但反復(fù)使用抗生素會使微生物產(chǎn)生耐藥性，且對細胞本身也有一定影響，因此為避免誘導(dǎo)抗藥細菌，應(yīng)定期更換培養(yǎng)系統(tǒng)中的抗生素，或盡可能不用抗生素處理。（2）從物品、用品消毒滅菌著手 細胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細，并在取樣檢菌一周后確認無菌才能使用。同時，在無菌過濾操作中，隨著濾過體積的增大，濾膜破損的可能性增加，故應(yīng)選擇最后過濾的液體進行檢測。定期對二氧化碳培養(yǎng)箱進行消毒。具體操作：75%的酒精搽拭培養(yǎng)箱后，使用可移動的紫外燈至少消毒30min，加入高壓滅菌過的超純水于培養(yǎng)箱水槽中保持濕度。也可配制300ml 的飽和硫酸銅加3L 滅菌超純水混合成硫酸銅溶液加入水槽中。 （3）從操作者做起 進無菌室前要徹底洗手，按規(guī)定穿隔離衣。開始操作前要用 75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。 操作者動作要輕，安裝吸管帽、打開或封閉瓶口等操作應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行。但要注意，金屬器械不能在火焰中長時間燒灼，以防退火；燒過的器械要冷卻后才能使用；已吸過培養(yǎng)液的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管內(nèi)的培養(yǎng)液成分如蛋白質(zhì)等燒焦后會產(chǎn)生有害物質(zhì)，吸管再用時會將其帶到培養(yǎng)液中；膠塞、橡皮乳頭及塑料的細胞培養(yǎng)用品過火焰是也不能時間太長，以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體，危害培養(yǎng)細胞，同時塑料細胞培養(yǎng)用品也會產(chǎn)生變形影響使用。使用培養(yǎng)液前不宜過早開瓶，開瓶后的培養(yǎng)液應(yīng)保持斜位，避免直立，以防止下落細菌的污染。不再使用的培養(yǎng)液應(yīng)立即封閉瓶口，培養(yǎng)的細胞在處理之前勿過早暴露在空氣中。 操作時盡量不要談話，咳嗽以防止來自唾沫和呼出的氣流所造成的污染。 吸取培養(yǎng)液、細胞懸液時，應(yīng)專管專用，一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去，以防止污染擴大或造成培養(yǎng)物之間的交叉污染。操作完畢后應(yīng)整理好工作臺面，用消毒水浸泡的紗布擦拭臺面。（4）防止細胞交叉污染 所有從別處轉(zhuǎn)來的或是自己所建的細胞系都要早期留有的充足的凍存儲備，一旦懷疑發(fā)生交叉污染，可做細胞遺傳學(xué)方面的鑒定，如發(fā)現(xiàn)原有的細胞遺傳物發(fā)生改變，可以復(fù)蘇早期凍存的細胞使用。重要細胞系（株）的傳代工作應(yīng)由兩人獨立進行。（5）無菌室的徹底消毒新潔爾滅全面徹底擦洗無菌室。使用前應(yīng)稀釋即配即用。新潔爾滅和酒精相比，最大的優(yōu)點是便宜，因為新潔爾滅 500ml只需5元，而且可以稀釋50倍用，而同樣量的酒精價格可能是新潔爾滅的幾十倍。甲醛熏蒸法：甲醛是一種廣譜滅菌劑菌，其水溶液和氣體對各種細菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。甲醛價廉，熏蒸消毒時不損壞衣服、家具、皮革、橡膠等。市售的甲醛水溶液中一般含3740%的甲醛。13膠原酶的種類和選型在細胞的取材中，各種消化酶經(jīng)常用于組織的分散，在組織中取得目的細胞。例如脂肪間質(zhì)干細胞（ADSCs ）、軟骨細胞培養(yǎng)等。其中膠原酶是最常用的一種。種類：I-IV 型選擇：結(jié)締組織I，III 型；骨組織、脂肪組織I 型；軟骨組織II 型；胰島細胞IV 型。崩裂酶Dispase作用：用于增強膠原酶的消化能力，對細胞損傷最小。14膠原酶 V S胰酶胰蛋白酶（Trypsin ），簡稱胰酶，可使細胞間的蛋白質(zhì)水解從而達到細胞離散的目的，是目前應(yīng)用最為廣泛的消化劑，主要采自?；蜇i的胰臟，呈白色粉末狀，易潮解，應(yīng)在低溫干燥處保存。胰酶適用于細胞間質(zhì)較少的軟組織（如胚胎、上皮、羊膜、肝、腎等軟組織）及傳代細胞的消化，但對于纖維性組織或較硬的癌組織則效果較差。胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常見有1：125 和1：250，即一份胰酶可消化125 或250 份酪蛋白。組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.10.25%濃度，常用0.25%，特別敏感的可以使用0.125%。胰酶的消化效果主要于pH 值、溫度、胰酶的濃度、組織塊的大小和硬度有關(guān)。胰酶作用及溶解的最佳pH 是89，配制胰酶溶液可將液體調(diào)至pH8 左右，充分溶解，過濾除菌，過濾后再調(diào)至pH7.4 左右。胰酶作用的最適溫度為37，在夏季室溫25以上對一般傳代細胞也能達到消化效果。一般新鮮配制的胰酶消化能力較強。消化時間要根據(jù)不同的情況而定，胰酶對細胞的分離效果與細胞的類型、特性和瓶壁表面特性有關(guān)。一般來說，溫度低，組織塊大、胰酶濃度低者，消化時間長，反之則相應(yīng)減少時間。酶的濃度過大或消化時間太長，會導(dǎo)致消化過度，對細胞的活性損傷較大，并有部分細胞漂浮，被消化掉；消化時間太短，消化不足則細胞難于從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣也會損傷細胞活性，也達不到分散細胞的目的。影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性（配制條件、凍存或 4保存時間長短、是否反復(fù)凍融、化凍后存放時間及溫度等）、消化時的溫度（氣溫、細胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度）以及所加胰酶溶液的多少等。在使用胰酶進行消化時，可改變不同參數(shù)以確定出最佳消化效果。胰酶的配置方法： （1）稱取胰酶：按胰酶液濃度為0.25 ，用電子天平準確稱取粉劑溶入PBS 或D-hanks 中，低速攪拌34小時或者置于 4過夜混勻（低速很重要，機械攪拌對酶是一種沖擊，如果起沫嚴重，有可能導(dǎo)致酶的變性）。（0）調(diào)節(jié)pH 值為7.4 左右。用注射濾器過濾除菌，因蛋白制劑不宜4長期保存，忌反復(fù)凍融，建議分裝成小瓶（離心管）于-20凍存或置4保存?zhèn)溆谩Ｗ⒁馐马棧菏欠裥枰?放置過夜，取決于胰酶的純度。過去的胰酶純度不高，所以難以溶解，需要4過夜。而現(xiàn)在的胰酶純度都很高，就沒有必要4過夜。從理論上來說，4放置過夜，給細菌生長的機會，盡管過濾可以除去細菌，但除不掉其代謝產(chǎn)物。 如果胰酶不溶、有絮狀物，考慮可能的原因有：胰酶過期或是已經(jīng)部分變性；溶液 pH 值不對；在沒過濾之前的絮狀沉淀是正?，F(xiàn)象，因胰酶多取自動物胰腺，沉淀為組織塊，過濾后即可。Ca2+、Mg2+、血清和蛋白質(zhì)對胰酶的活性有一定的抑制作用，所以需用不含Ca2+、Mg2+、這些離子的BSS 如D-Hanks 或者PBS 來配制。正是這個道理，開始消化前，需用PBS 將培養(yǎng)液沖洗干凈后方加入胰酶進行消化，否則會大大影響胰酶的作用效果。終止消化時，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細胞的作用。對于一些貼壁特別牢固的細胞，可在上述配方中，加入0.02%的EDTA，將胰酶與EDTA （乙二胺四乙酸）混合來進行消化。EDTA 可通過結(jié)合（螯合）細胞間質(zhì)中的二價陽離子從而破壞細胞連接從而增加消化效力。但因EDTA 不能被血清中和，終止消化后，需用培養(yǎng)液或PBS 徹底沖洗培養(yǎng)瓶（板），使得更好的再次利用培養(yǎng)瓶（板），否則再培養(yǎng)時可能會導(dǎo)致細胞容易脫壁。 EDTA在常溫下難溶于酸，微溶于水（20時溶解度只有 0.02g ），但在堿性溶液中溶解性較大。因此為了更快的溶解 EDTA 可采取調(diào)節(jié) PH或者是加熱的辦法。但須注意：由于胰酶不耐高溫，因此待EDTA溶解后，溫度有所下降才能加入胰酶。如果是單獨配置 EDTA 溶液，配制后可過濾除菌，也可高溫消毒滅菌。膠原酶（collagenase ）是從溶組織梭狀細胞芽孢桿菌提取制備的，主要水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分。當擬消化的組織較硬，內(nèi)含較多結(jié)締組織或膠原成分時，用胰蛋白酶解離細胞的效果較差，這時可采用膠原酶解離細胞法。膠原酶僅對細胞間質(zhì)有消化作用而對上皮細胞影響不大。因此適于消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細胞與膠原成分分離而不受損害。常用劑量為最終濃度200U/ml （約為1mg/mL ）或0.03%0.3%。膠原酶分為、型以及肝細胞專用膠原酶，要根據(jù)所要分離消化的組織類型選擇膠原酶類型。具體可見膠原酶的種類和選型。膠原酶消化緩和、無須機械振蕩，因而可進一步提高細胞成活率，但膠原酶價格較高，大量使用將增加實驗成本。膠原酶的配置膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制、消毒滅菌和儲藏。關(guān)于胰蛋白酶配置方法可見：胰蛋白酶消化法。注意：因為型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。鈣、鎂離子和血清成分不會影響膠原酶的消化作用，因而可用 BSS （如D-hanks 或者PBS）或含血清的培養(yǎng)液配制。 膠原酶的使用： （1）將漂洗、修剪干凈的組織剪成12mm3左右小塊（2）將組織塊放入離心管（三角燒瓶）中加入3050 倍體積的膠原酶溶液，旋緊蓋子（密封燒瓶）。 （3）將燒瓶放入37水浴或者37孵箱內(nèi)，每隔3min 振搖一次，如能放在37的恒溫震蕩水浴箱中則更好。消化時間與組織的類別很有關(guān)系，對于某些腫瘤組織或其他較致密結(jié)締組織，消化時間448h，對于容易消化的組織可以采用37震蕩消化 1545min，也可以根據(jù)具體情況而定。如組織塊已分散而失去塊的形狀，一經(jīng)搖動即成細胞團或單個細胞，可以認為已消化充分。上皮組織經(jīng)膠原酶消化后，由于上皮細胞對此酶有耐受性，可能仍有一些細胞團未完全分散，但成團的上皮細胞比分散的單個上皮細胞更易生長，因此，如無特殊需要可以不必再進一步處理。 （4）收集消化液（有時含個別組織塊及沒有充分消化的組織碎屑則需用 100 目不銹鋼網(wǎng)過濾），離心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks 液或者無血清培養(yǎng)液離心漂洗12 次，去除上清，加培養(yǎng)液制成細胞懸液，接種培養(yǎng)瓶。膠原酶Vs 胰蛋白酶 胰蛋白酶和膠原酶消化時間與濃度上的差異，依消化溫度而異。另外這兩種酶也可混合應(yīng)用，濃度為：胰蛋白酶0.1mg+膠原酶0.25mg/mL。兩酶相比的差別見表1 和表2。 表1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別 項目 胰蛋白酶 膠原酶消化特性 適用于消化軟組織 適用于消化纖維多的組織用量 0.01%0.5% 0.10.3 mg/mL（200 U/mL）消化時間 0.5 2h 1 12hpH 89 6.57.0作用強度 強烈 緩和細胞影響 時間過長有影響 無大影響血清抑活 有 無Ca2+和Mg2+ 有影響 無影響表2 胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊（0.51cm3 ）時所需時間（h） 酶種類和用量 較硬組織 軟組織4 室溫 37 4 室溫 37胰蛋白酶（0.25%） 2448 16 12 1224 12 0.51膠原酶（1200 U/mL） 24 6 0.5 12 3 0.25胰蛋白酶（0.25%）+膠原酶（200 U/mL） 1246 1224 412 1224 612 1215干細胞的種類和表面標記通過流式細胞儀分析，間充質(zhì)干細胞特異性表面抗原有：SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124。BMSC：是骨髓中除HSC 以外的非造血性干細胞，骨髓中絕大多數(shù)是HSC，BMSC 只占骨髓有核細胞的0.001%0.01% 。因此鑒定BMSC 的方法是在骨髓的干細胞中排除HSCBMSC：CD45-、CD34-、CD29+、 CD14+/ HSC：CD34+。16間質(zhì)干細胞培養(yǎng)原理概述間質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一群中胚層來源的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞，在適宜的培養(yǎng)條件下可分化成多種組織細胞，包括成骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、脂肪細胞等。間質(zhì)干細胞最早是從骨髓中分離得到的，正常情況下，它在骨髓中的比例非常低，僅占單核細胞的1/105 1/104 。骨髓中單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞，其體積、形態(tài)和密度與其他細胞不同，紅細胞和多核白細胞密度較大，為1.090 g/ml左右，而淋巴細胞和單核細胞密度為1.0751.090 g/ml，血小板為1.0301.035 g/ml。為此利用一種密度介于1.0751.092 g/ml之間而近于等滲的溶液（分層液）進行密度梯度離心，使一定密度的細胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種。在骨髓的原代培養(yǎng)物中，除了貼壁生長的成纖維細胞樣的間質(zhì)干細胞外，還混雜著一些巨噬細胞、單核細胞、造血細胞及紅細胞等，要得到較均一的間質(zhì)干細胞，必須除去其他細胞。根據(jù)其他細胞的特性，可采用不同的方式排除它們。對于紅細胞，因其不貼壁，可通過換液除去。對于貼壁的單核巨噬細胞，可根據(jù)其黏附能力的不同，通過調(diào)整Trypsin/EDTA 的消化時間，保證間質(zhì)干細胞在短暫的作用時間內(nèi)與塑料培養(yǎng)瓶壁分離，而巨噬細胞、單核細胞、造血細胞等仍貼附于培養(yǎng)瓶壁，從而使間質(zhì)干細胞與其他的貼壁細胞得到分離。在傳代培養(yǎng)中，接種密度是影響體外培養(yǎng)間質(zhì)干細胞增殖潛能的重要因素。低密度接種時，間質(zhì)干細胞的增殖能力明顯提高，而誘導(dǎo)細胞分化時則需要較高的細胞密度，這可能與分化時細胞與細胞間的相互作用有關(guān)。而在培養(yǎng)過程中，若細胞過度融合會促進其分化趨向，故要保持干細胞未分化狀態(tài)，要及時傳代。17間質(zhì)干細胞成脂和成骨誘導(dǎo)分化成骨和成脂誘導(dǎo)是鑒定干細胞的一種重要的方法，也是最常用、報道見得最多的方法。成骨最常用的染色方法是茜素紅染色（堿性磷酸酶），成脂誘導(dǎo)最常用是Oil Red O （油紅O）染色法。下面我介紹一下這兩種染色方法的原理和步驟。 茜素紅染色方法和原理：成骨誘導(dǎo)的過程是使鈣離子能夠以鈣鹽的方式沉淀下來，這就是我們常說的“鈣結(jié)節(jié)”。鑒定鈣結(jié)節(jié)的染色方法常用“茜素紅”。 步驟： （1）吸去誘導(dǎo)液，再PBS 洗一到兩次；（2）加入10中性甲醛，固定30min-60min；（3）吸去固定液，加入0.1%的茜素紅染色液，染色6-10min；（4）用PBS 洗兩次，去處殘留的染色液；（5）加入PBS，完成染色； 茜素紅：茜素磺酸鈉，茜素S，茜素紅S，茜素胭脂紅，1,2-二羥基蒽醌-3-磺酸鈉，1,2-二羥基蒽醌-3-磺酸鈉鹽。橙黃色或黃棕色粉末。易溶于水，微溶于乙醇，不溶于苯和氯仿。1%水溶液pH 為2.15，其水溶液呈淺黃褐色，加鹽酸后變成黃色，加氫氧化鈉后則變成藍紫色。有刺激性。能與許多金屬離子生成帶色化合物，能與鋯、釷、鋁、鈦及鈹和鈣的顯色反應(yīng)。染色的原理就是茜素紅和鈣發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生一種深紅色的帶色化合物，這樣成骨誘導(dǎo)的細胞外面沉積的鈣結(jié)節(jié)也就被染成了深紅色。Oil Red O（油紅O）染色的方法和原理：成脂肪誘導(dǎo)的過程中，細胞在胞漿中不斷有油滴的累積，并不斷的增加變大，最后整個細胞的胞漿中都是油滴。Oil Red O染色的方法是對油滴的染色的一種方法。 步驟： （1）吸去誘導(dǎo)液，再PBS 洗一到兩次；（2）加入10中性甲醛，固定60min； （3）吸去固定液，加入現(xiàn)配和過濾后的Oil Red O 染色液，染色60min； （4）用PBS 洗2-5 次，去處殘留的染色液和殘渣； （5）加入PBS，完成染色； Oil Red O（油紅O）：1-2,5-二甲基-4-(2,5-二甲基苯偶氮)苯