質(zhì)粒抽提常見(jiàn)問(wèn)題與解答.doc

1.沒(méi)有提出質(zhì)?；蛘哔|(zhì)粒收獲量很低A菌種老化建議：對(duì)于甘油保存的菌種，需要先進(jìn)行活化，涂布或者劃線菌種，重新挑選單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，并對(duì)菌種進(jìn)行初搖活化，按照1:500的比例進(jìn)行菌種培養(yǎng)。二次培養(yǎng)時(shí)間最好不要超出16小時(shí)(或者OD600不超過(guò)3.0)。B低拷貝質(zhì)粒建議：如果是由于低拷貝質(zhì)粒引起的質(zhì)粒收獲量低，可以采用兩倍的菌體量，并相應(yīng)增加各種Buffer的用量。C質(zhì)粒丟失建議：某些質(zhì)粒在次繼代培養(yǎng)的過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)丟失的想象，另外檢查篩選抗生素的濃度是否正確。D裂解不充分建議：如果采用超過(guò)推薦量的菌體進(jìn)行質(zhì)粒制備，會(huì)導(dǎo)致菌體裂解不充分?？蛇m當(dāng)減少菌體的用量或者相應(yīng)增大各種Buffer的用量。并確保細(xì)菌混懸均勻。EBuffer中有沉淀未溶解建議：BufferB1和BufferN1，BufferC1在溫度較低時(shí)會(huì)出現(xiàn)沉淀，使用前請(qǐng)檢查是否有沉淀生成，如果有沉淀生成，請(qǐng)置于37溫育片刻，待溶液澄清后使用。FDNAWashBuffer中未加入要求量的乙醇建議：按照說(shuō)明書要求加入要求量的無(wú)水乙醇，使用后旋緊瓶蓋，防止乙醇揮發(fā)。另外對(duì)于質(zhì)粒中提，大提等，要求用70%乙醇洗滌，請(qǐng)確保乙醇的體積不小于70%。G離心柱中乙醇?xì)埩艚ㄗh：漂洗后，可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間，盡量去除殘留的乙醇。另外對(duì)于質(zhì)粒中提，大提和朝大量提取，建議離心后，將柱子或大漏斗用吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹片刻(或置于65烘箱)，以徹底去除殘留的乙醇，便于洗脫和后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。H洗脫液加入位置不正確建議：洗脫液應(yīng)加在膜中央，已取得最好的洗脫效果。I洗脫液pH值不正確建議：將DNA從柱子上洗脫下來(lái)的最適pH值在7.0-8.5之間，如果洗脫液的pH超出此范圍將會(huì)顯著影響洗脫效果，請(qǐng)使用試劑盒配套的ElutionBuffer(pH8.5，10mMTris-HCl)進(jìn)行洗脫，如果用ddH2O進(jìn)行洗脫，請(qǐng)確保pH在7.0-8.5之間。J洗脫體積的選擇建議：洗脫體積將會(huì)影響最終的收獲量，洗脫體積越大，收獲量越高，但是濃度將會(huì)降低。請(qǐng)使用試劑盒推薦的洗脫體積進(jìn)行洗脫，以保證最好的收獲量和濃度。如果需要高濃度的質(zhì)粒，請(qǐng)減少洗脫體積。另外，如果想收獲高濃度高收獲量的質(zhì)粒，請(qǐng)根據(jù)試劑盒要求進(jìn)行二次洗脫，再用推薦的方法進(jìn)行沉淀，濃縮質(zhì)粒。K洗脫時(shí)間的選擇建議：加入洗脫Buffer后，室溫放置2-5分鐘，將有利于洗脫。2.質(zhì)粒純度不高A蛋白質(zhì)污染建議：選擇推薦量的菌體，離心后小心吸取上清，如果上清液中混有懸浮物，可再次離心，以徹底去除蛋白。另外如果用ddH2O作為稀釋溶液,測(cè)定OD比值，比值可能較低，造成蛋白污染的假象，可用pH8.0的TEBuffer來(lái)稀釋。BRNA污染建議：檢查配送的RNaseA是否完全加入到BufferA1中，加入RNaseA后，BufferA1/RNaseA應(yīng)該存放在4，如果存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或者沒(méi)有正確存放，RNaseA活力下降，請(qǐng)重新加入RNaseA。C基因組DNA污染建議：加入BufferB1后，輕輕顛倒混勻，避免劇烈震蕩渦旋，加入BufferB1的處理時(shí)間最好不要超過(guò)5分鐘。D菌株為含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株建議：請(qǐng)選用含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株質(zhì)粒DNA提取試劑盒，或者轉(zhuǎn)化質(zhì)粒到不含內(nèi)源