細菌內(nèi)毒素檢驗操作程序.doc

山 東 天 力 藥 業(yè) 有 限 公 司標題：細菌內(nèi)毒素檢測操作程序編號：SOP-QM-243-B頁碼：1/9制定人：審核人： 批準人： 頒發(fā)部門：日期：日期：日期：生效日期：分發(fā)部門：品質(zhì)部、中心化驗室、過程分析室目的：規(guī)范細菌內(nèi)毒素檢驗操作程序。范圍：適用于細菌內(nèi)毒素檢查操作。責任：品質(zhì)部組織制定，中心化驗室負責實施。內(nèi)容1準備工作1.1實驗設(shè)備及用具1.1.1刻度吸管、稱量瓶、鑷子、安瓿瓶（2ml、5ml）、藥匙、250烘烤1小時。1.1.2干燥箱、恒溫水浴鍋、漩渦混合器、精密天平。1.1.3剪刀、砂輪片、醫(yī)用膠布、洗耳球、試管架、脫脂棉球、水銀溫度計、試管1.2內(nèi)毒素標準品與實驗試劑1.2.1鱟試劑：在使用前應(yīng)進行靈敏度測定，原則上購進一個批號測定一次。1.2.2細菌內(nèi)毒素檢查用水（內(nèi)毒素含量0.015Eu/mL滅菌注射用水）。1.2.3細菌內(nèi)毒素國家標準品和工作標準品。1.2.4 75%乙醇、鉻酸洗液。1.3實驗用具的消毒處理：凡是參與實驗樣品或試劑接觸的器具，在實驗前必須經(jīng)除細菌內(nèi)毒素處理，將洗凈的器具經(jīng)純化水沖洗后，在250干熱滅菌至少60分鐘。1.4恒溫水浴箱內(nèi)水浴溫度調(diào)節(jié)到371。2鱟試劑靈敏度復(fù)核2.1根據(jù)鱟試劑靈敏度的標示值（如：=0.25 EU/ml），細菌內(nèi)毒素工作標準品加入1ml細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在漩渦混合器上混勻15分鐘。2.2將工作標準品制備成2、0.5、0.25四個濃度（0.5 EU/ml、0.25 EU/ml、0.125 EU/ml、0.06 EU/ml）的內(nèi)毒素標準溶液，備用。山 東 天 力 藥 業(yè) 有 限 公 司標題：細菌內(nèi)毒素檢測操作程序編號：SOP-QM-243- B頁碼：2/9例：工作標準品為160 EU/ml時160EU/ ml標準品溶液0.2ml16EU/ ml0.5ml8EU/ ml0.5ml1.8ml0.2ml1.4ml1EU/ ml0.9ml0.9ml0.5EU/ ml0.9ml0.9ml0.25EU/ ml0.9ml0.9ml0.125EU/ ml0.9ml0.9ml0.06EU/ ml注意：每稀釋一步均應(yīng)在混合器上混勻30秒。2.3取18支0.25 EU/ml鱟試劑，每支中加入0.1mlBET 水，然后分別加入0.1ml2.2中制備好的4個濃度的標準液,按濃度從高到低依次加入，每個濃度加4支，；最后2支加入0.1mlBET 水作陰性對照。2.4將上述試管用醫(yī)用膠布封口，垂直放入371水浴鍋中，保溫602分鐘。放入水浴前把水攪動幾下，以使水溫均勻。再次檢查溫度是否在所要求的范圍，注意保溫和取放過程應(yīng)避免受到振動造成的假陰性結(jié)果。2.5保溫結(jié)束后將試管輕輕取出，緩緩轉(zhuǎn)到180，若關(guān)內(nèi)形成凝膠，不變形、不從管壁滑落者為陽性；未形成凝膠或形成凝膠變形從壁滑落者為陰性。（注意：保溫盒拿取試管過程應(yīng)避免受到震動而造成的假陰性結(jié)果）2.6 結(jié)果判定當最大濃度24支管均為陽性，最低濃度0.254支管均為陰性，陰性對照2支管為陰性，實驗方有效。如圖1山東天力藥業(yè)有限公司標題：細菌內(nèi)毒素檢測操作程序編號：SOP-QM-243- B頁碼：3/9按下述公式計算反應(yīng)終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值c。c=antilg(x/4)當c在0.5-2時，方可用于細菌內(nèi)毒素的檢查，并以標示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度。式中：X為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值lg。反應(yīng)重點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。antilg是lg函數(shù)的反函數(shù)，在excel里可以用power公式，power（數(shù)值）2.7舉例設(shè)待復(fù)核鱟試劑的靈敏度為0.25 EU/ml，即=0.25 EU/ml。實驗結(jié)果如下：內(nèi)毒素濃度 （EU/ml） 0.50 0.25 0.125 0.062 Nc 反應(yīng)終點濃度X 1 + + - - - 0.25 2 + - - - - 0.50 3 + + + - 0.125 4 + + + - 0.125山東天力藥業(yè)有限公司標題：細菌內(nèi)毒素檢測操作程序編號：SOP-QM-243- B頁碼：4/9則：c =antilg(X/4)=antilg（lg0.25lg0.50lg0.125lg0.125）/4= antilg(-0.602-0.301-0.903-0.903)/4= antilg(-0.508)=0.310（EU/ml）c在0.5-2范圍內(nèi)，符合規(guī)定。結(jié)果不是內(nèi)毒素最大濃度（2）4管全部陽性，最小濃度（0.25）4管全部陰性，本批鱟試劑不能使用。需查找原因，可能是靈敏度標示不準確或內(nèi)毒素效價標示不準確，或操作不當所致。3.干擾實驗干擾試驗的目的是確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)不存在干擾作用，為能否使用細菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。3.1制備內(nèi)毒素標準對照溶液取1支細菌內(nèi)毒素標準品，用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成4個濃度的標準溶液即2.0、0.5、0.25。3.2制備含內(nèi)毒素的供試品溶液將供試品稀釋至預(yù)實驗中確定的不干擾稀釋倍數(shù)，再用此稀釋液將11.1中的同支細菌內(nèi)毒素標準品稀釋成4個濃度即2.0、1.0、0.5、0.25的含內(nèi)毒素的供試品溶液。3.3鱟試劑的準備取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑36支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。若待復(fù)核鱟試劑的規(guī)格不是0.1ml/支時，按其標示量加入檢查用水復(fù)溶，將復(fù)溶后的鱟試劑溶液混和在一起，然后每0.1ml分裝到1075mm凝集管中，要求至少分裝36管備用。3.4凝膠反應(yīng)山東天力藥業(yè)有限公司標題：細菌內(nèi)毒素檢測操作程序編號：SOP-QM-243- B頁碼：5/9將準備好的鱟試劑18支（管）放在試管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入0.1ml的2.0、1.0、0.5、0.25的內(nèi)毒素標準對照液，另一列2支（管）加入0.1ml檢查用水作為陰性對照。將另外18支（管）鱟試劑放在試管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入0.1ml的2.0、1.0、0.5、0.25的內(nèi)毒素的含供試品溶液；另一列2支（管）加入0.1ml供試品溶液作為樣品陰性對照，如表1所示。加樣結(jié)束后，用封口膜封口，輕輕振動混勻，避免產(chǎn)生氣泡，兩同試管架放入371水浴或適宜恒溫器中，保溫602分鐘后，觀察并記錄結(jié)果。表l 凝膠法干擾試驗溶液的制備編號內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液2B2/供試品溶液供試品溶液12421440.5480.254C2/檢查用水檢查用水12421440.5480.254D無/檢查用水2注：A為供試品溶液；B為干擾試劑系列；C鱟試劑標示靈敏度的對照系列；D為陰性對照。山東天力藥業(yè)有限公司標題：細菌內(nèi)毒素檢測操作程序編號：SOP-QM-243- B頁碼：6/93.5判定并計算C和B的反應(yīng)終點濃度的集合平均值(Es和Et) 只有當溶液A 和陰性對照溶液D 的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C 的結(jié)果在鱟試劑靈敏度復(fù)核范圍內(nèi)時，試驗方為有效。按下式計算系列溶液C 和B 的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（Es和Et ) :Es= antilg （Xs / 4 )Et=antilg （Xt / 4 )式中Xs、Xt分別為系列溶液C 和溶液B 的反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值（lg）。當Es在0.52（包括0.5和2）及Et在0.5Es 2 Es （包括0.5Es和 2 Es）時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小于MVD 的稀釋倍數(shù)下對試驗有干擾，應(yīng)將供試品溶液進行不超過MVD 的進一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗?？赏ㄟ^對供試品進行更大倍數(shù)的稀釋或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會使內(nèi)毒素失去活性，要使用預(yù)先添加了標準內(nèi)毒素再經(jīng)過處理的供試品溶液進行干擾試驗。當進行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前，或無內(nèi)毒素檢查項的品種建立內(nèi)毒素檢查法時，須進行干擾試驗。當鱟試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新進行干擾試驗。3 供試品細菌內(nèi)毒素檢查凝膠限度試驗4.1要求：在細菌內(nèi)毒素檢查中，每批供試品必須做2支供試品和2支供試品陽性對照，同時每次試驗必須做2支陽性對照和2支陰性對照。 4.1.1因藥典對甘露醇原料藥內(nèi)毒素無要求，參照甘露醇注射液內(nèi)毒素限值，每1g甘露醇中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于1.25EU。根據(jù)MVD=CL/ ，且當供試品為注射用原料藥時，MVD取1。故20%甘露醇注射液的鱟試劑限度為： =0.2g/ml1.25EU/g=0.25EU/ml4.2操作方法4.2.1供試品溶液的制備山東天力藥業(yè)有限公司標題：細菌內(nèi)毒素檢測操作程序編號：SOP-QM-243- B頁碼：7/9準確稱取0.2甘露醇用1mlBET水溶解，制成20%甘露醇溶液。根據(jù)MVD=CL/，將供試品進行稀釋，其稀釋倍數(shù)不得超過MVD。式中：C為供試品濃度。L為供試品的細菌內(nèi)毒素限值。為在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度。例：當用標示值為0.25EU/ml靈敏度的鱟試劑時，MVD=CL/=20%1.25/0.25=1(倍),所以把供試品制成20%的稀釋液即可。當用標示值為0.125EU/ml靈敏度的鱟試劑時，MVD=CL/=20%1.25/0.125=2(倍),所以把供試品制成10%的稀釋液即可。當用標示值為0.06EU/ml靈敏度的鱟試劑時，MVD=CL/=20%1.25/0.06=4(倍),所以把供試品制成5%的稀釋液即可。4.3陽性對照溶液的制備用檢查用水將內(nèi)毒素標準品稀釋制成2濃度的內(nèi)毒素標準溶液。取規(guī)格為10EU的細菌內(nèi)毒素標準品一支 用酒精棉球?qū)⑵款i消毒后開啟，加BET檢查用水1.0ml混合15分鐘后備用。例：當用標示值為0.25EU/ml靈敏度的鱟試劑時，2=0.5EU/ml， 10EU/ ml標準品溶液0.2ml(10EU/ml標準品溶液)10EU/ ml1.0ml(1.0EU/ml標準品溶液)0.50EU/ ml1.0mlBET1.8mlBET 例：當用標示值為0.125EU/ml靈敏度的鱟試劑時，2=0.25EU/ml， 10EU/ ml標準品溶液0.2ml(10EU/ml標準品溶液)10EU/ ml1.0ml(1.0EU/ml標準品溶液)0.50EU/ ml1.0mBET1.8mlBET1.0ml(0.50EU/ml標準品溶液)1.0mBET0.250EU/ ml山東天力藥業(yè)有限公司標題：細菌內(nèi)毒素檢測操作程序編號：SOP-QM-243- B頁碼：8/94.4供試品陽性對照溶液的制備用待檢測的供試品溶液或其稀釋液將內(nèi)毒素標準品制成2濃度的內(nèi)毒素溶液。例：當用標示值為0.25EU/ml靈敏度的鱟試劑時，2=0.5EU/ml， 10EU/ ml標準品溶液0.2ml（10EU/ml標準品溶液）10EU/ ml1.0ml(1.0EU/ml標準品溶液)0.50EU/ ml供試品陽性對照溶液 1.0ml（20%供試品溶液）1.8ml（20%供試品溶液）例：當用標示值為0.125EU/ml靈敏度的鱟試劑時，2=0.25EU/ml， 10EU/ ml標準品溶液0.2ml(10EU/ml標準品溶液)10EU/ ml1.0ml(1.0EU/ml標準品溶液)0.50EU/ ml1.0ml（10%供試品溶液）1.8ml（10%供試品溶液）1.0ml(0.50EU/ml標準品溶液)1.0ml（10%供試品溶液）0.25 EU/ml供試品陽性對照溶液4.5陰性對照液即細菌內(nèi)毒素檢查用水4.5.1鱟試劑的準備取規(guī)格為0.1ml的鱟試劑8支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后開啟備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解。4.5.2加樣取8支2.2.5溶解好的鱟試劑，其中2支加入0.1ml供試品溶液，作為供試品管；2支加入0.1ml陽性對照溶液，作為陽性對照管（PC）；2支加入0.1ml供試品陽性對照溶液，作為供試品陽性對照管（PPC）；2支加入0.1ml檢查用水作為陰性對照管（NC）。試驗加樣如：（單位ml）參照管試劑供試品管陽性對照PC供試品陽性對照PPC陰性對照NC12121212鱟試劑0.10.10.10.10.10.10.10.1山東天力藥業(yè)有限公司標題：細菌內(nèi)毒素檢測操作程序編號：SOP-QM-243- B頁碼9/9供試品液0.10.1BET用水0.10.1供試品陽性對照液0.10.1陽性對照液0.10.