腸道微生物作為環(huán)境因素調(diào)節(jié)脂肪儲(chǔ)存.docx

精品文檔腸道微生物作為環(huán)境因素調(diào)節(jié)脂肪儲(chǔ)存和能量攝取、吸收或儲(chǔ)存有關(guān)的非認(rèn)知性的減少的藥物作用靶點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，這和全球性的肥胖有重要關(guān)系。腸道微生物對食物中多糖的加工起著重要作用。我們發(fā)現(xiàn)對成年無菌（GF）C57BL/6小鼠用正常飼養(yǎng)動(dòng)物的盲腸微生物處理過后，在忽略食物攝取的情況下喂養(yǎng)14天，增加了60%的身體脂肪總量和胰島素耐受性。對無菌小鼠和正常飼養(yǎng)小鼠的研究表明微生物促進(jìn)了腸道內(nèi)的單糖吸收，最終誘導(dǎo)了肝臟脂肪的新合成。禁食誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞因子（Fiaf），一種血管生成素樣蛋白，在正常飼養(yǎng)小鼠的腸上皮細(xì)胞中被選擇性的抑制。對無菌小鼠和正常飼養(yǎng)小鼠，普通小鼠和Fiaf基因敲除小鼠的分析表明，F(xiàn)iaf是一種循環(huán)脂蛋白脂肪酶抑制劑，它的抑制作用對由微生物引發(fā)的脂肪細(xì)胞中三酸甘油酯的沉積必不可少。對Rag1/動(dòng)物的研究表明這些宿主反應(yīng)并不需要成熟的淋巴細(xì)胞。我們的發(fā)現(xiàn)證明了腸道微生物對宿主從飲食中獲取能量起著重要作用。目前世界上有超過5億人超重，其中有2.5億人屬于肥胖。這種增長的流行病威脅著不管是發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家，同時(shí)引起了一些并發(fā)癥，包括II型糖尿病、高血壓、心血管疾病和非酒精性脂肪性肝炎。在美國，64%的成年人超重或肥胖，促使衛(wèi)生局把這種狀況看作是如今公眾健康最大的威脅。大多數(shù)人無法做到終身的、對體重控制有意義的飲食習(xí)慣改變。因此，改進(jìn)食物成分或者發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)來減少能量的攝取、吸收和儲(chǔ)存對公眾的健康有長足的重要性。人類的腸道中含有數(shù)量巨大的微生物群。這些群落至少包含著1013個(gè)細(xì)菌，主要是厭氧菌，大約有5001000個(gè)種類，他們總的基因組大概是人類的100倍。我們可以把微生物看作是新陳代謝的器官，這個(gè)器官能精確的調(diào)控我們的生理機(jī)能但是我們自身卻沒有進(jìn)化出這個(gè)器官。這個(gè)器官能處理我們食物中其他難以消化的部分，比如植物多糖。明確微生物控制的信號通路為找到新的作用靶點(diǎn)以促進(jìn)人類的健康提供了機(jī)會(huì)。在目前的研究中，我們使用正常小鼠和轉(zhuǎn)基因無菌小鼠來驗(yàn)證一個(gè)假設(shè)微生物通過一條完整的信號通路來調(diào)節(jié)宿主的能量儲(chǔ)存。材料和方法動(dòng)物. C57BL/6J (B6)野生型和Rag1-/-小鼠購買自Jackson實(shí)驗(yàn)室。B6過氧化物酶體增殖物激活受體（Ppara）-/-小鼠由F. J. Gonzales提供。禁食誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞因子（Fiaf）+/-雜合子由B6:129/Sv混合產(chǎn)生（在后面描述）。同窩出生的Fiaf+/+、Fiaf+/-、Fiaf-/-小鼠，由Fiaf+/-雜合子雜交得到。動(dòng)物的基因增殖使用PCR。正常飼養(yǎng)的野生型小鼠（CONVR）和基因敲除小鼠接收時(shí)和無菌（GF）小鼠處于相同狀態(tài)。GF小鼠喂養(yǎng)在無菌隔離器中，并處于嚴(yán)格的12小時(shí)循環(huán)光照下，同時(shí)用高壓蒸汽處理的食物喂養(yǎng)，任期自由采食。所有對小鼠的操作都是在華盛頓大學(xué)動(dòng)物委員會(huì)規(guī)定的條款之下進(jìn)行。無菌小鼠的養(yǎng)殖. 八周齡的CONVR小鼠的盲腸內(nèi)容物經(jīng)過10毫升無菌磷酸鹽緩沖液再懸浮后，取2毫升涂抹在7到10周齡GF小鼠的皮毛上。產(chǎn)生的小鼠(CONV-D)在無菌隔離器中飼養(yǎng)1028天，和GF小鼠條件相同。CONVR小鼠飼養(yǎng)在細(xì)菌隔離籠中，處于無特定病原體的狀態(tài)，喂養(yǎng)高壓蒸汽處理過的飼料。它們在810周齡的時(shí)候被轉(zhuǎn)移到無菌隔離器中飼養(yǎng)2周，以模擬GF和CONVD的生活環(huán)境。810周齡的GF小鼠口服移植109個(gè)多形擬桿菌VPI-5482。在腸末梢、盲腸、結(jié)腸的移植密度為1081011個(gè)/mL，由37下于BHI血瓊脂中培養(yǎng)的腸腔細(xì)菌測得。總脂肪和代謝速率（氧氣消耗量）的測量。 小鼠的總脂肪在使用氯胺酮（10mg/kg）和塞拉嗪（10mg/kg）腹腔注射麻醉5分鐘后測量。雙能X線吸收計(jì)量法的操作見文獻(xiàn)（9）的描述。氧氣消耗量在小鼠意識(shí)清醒、自由采食的條件下逐個(gè)測量，使用開路間接量熱法。小鼠在測量前適應(yīng)新陳代謝箱20分鐘，每次30s，共測1h。以綠色熒光染料為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)的定量反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈鎖反應(yīng)（qRT-PCR）。 RNA按照支撐材料描述的方法分離出來，并且通過反轉(zhuǎn)錄酶和短dT15引物實(shí)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)按照文獻(xiàn)10的方法實(shí)施，除了25ul的反應(yīng)包含的cDNA相當(dāng)于1ng的總RNA和900nM的基因特異性引物。所有的實(shí)驗(yàn)都通過ABI棱鏡7700序列檢測器實(shí)施3次。L32 RNA的數(shù)據(jù)都進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化分析。脂蛋白脂肪酶（LPL）實(shí)驗(yàn) LPL在附睪脂肪組織中的活性通過參考文獻(xiàn)11的方法檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異使用t檢驗(yàn)。超過兩組小鼠的數(shù)據(jù)通過單因素方差分析得到比較。結(jié)果和討論腸道微生物導(dǎo)致成年GF小鼠身體總脂肪含量忽略食物消耗的快速增長的介紹。 810周齡飼養(yǎng)在無菌環(huán)境（GF）和出生就生活在微生物環(huán)境（CONVR）的雄性B6小鼠的比較顯示CONVR多含有42%的身體總脂肪，通過雙能X線吸收計(jì)量法測得(Fig. 1A)。附睪脂肪的重量也要高47%( Fig. 1B)。一個(gè)有趣的現(xiàn)象是，高脂肪含量的CONVR小鼠的飼料(57% 碳水化合物, 5% 脂肪)消耗量比GF小鼠低29%(Fig. 1C)。 810周齡的雄性GF B6小鼠以成年CONVR小鼠腸道末梢（盲腸）的不加分離的微生物處理，正常飼養(yǎng)14天，身體總脂肪上升了57%(Fig. 1A)，附睪脂肪上升了61%( Fig. 1B)。然而去脂體重減少了7%，導(dǎo)致了兩組之間總的體重沒有明顯差別。GF組和CONVD組小鼠禁食后的血清三酸甘油酯水平相近。在一個(gè)10天的短期正常飼養(yǎng)中，小鼠的總脂肪含量有相近的增長（66%，與14天比較）。一個(gè)28天的長期飼養(yǎng)并沒有使身體總脂肪含量和附睪脂肪含量進(jìn)一步增長。在14天的正常飼養(yǎng)中，脂肪含量的增長卻同時(shí)伴隨著飼料消耗量的減少（比GF低27%，( Fig. 1C）。這些現(xiàn)象并不只是出現(xiàn)在雄性上：CONV-D B6雌性小鼠表現(xiàn)出了85%的總脂肪增長和9%的去脂體重減少，這和相同年齡的雄性小鼠沒有顯著差異。此外，脂肪儲(chǔ)存的表現(xiàn)并不局限于B6近交系小鼠：一次對8周齡NMRI近交系小鼠的常規(guī)飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，其身體總脂肪含量增加了90%，附睪脂肪增加了31%（與GF比較）。對盲腸微生物的基于序列的16S rDNA列舉研究表明CONVR組和CONV-D組的主要腸道微生物種類具有高度相似性。在人體中，擬桿菌和梭菌是最普遍的細(xì)菌。在人體腸道末梢微生物區(qū)中，多形擬桿菌是一類突出的、能捕獲和講解植物多糖的細(xì)菌（12）。例如，它的蛋白質(zhì)組包含172個(gè)糖基水解酶，能裂解食物中的大多數(shù)的糖苷鍵。對GF小鼠移植多形擬桿菌的研究表明它的多糖降解作用和誘導(dǎo)宿主單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)（13）。因此，我們對8周齡的GF B6小鼠移植了2周的已測序的VPI-5482菌株來明確單一的可分解糖的細(xì)菌能否僅通過它自身對宿主的脂肪儲(chǔ)存產(chǎn)生影響。VPI-5482菌株的移植對身體總脂肪含量產(chǎn)生了顯著性影響，盡管增加的量低于未分離的微生物（分別為23%和57%）。CONVD組的代謝速率高于GF組 微生物對脂肪含量的增長作用并不是因?yàn)槭澄锵牧吭黾恿?，開路間接測熱法被用來確定是否減少了能量消耗。當(dāng)我們發(fā)現(xiàn)在14天正常飼養(yǎng)后，較瘦的GF小鼠比相同年齡和性別的小鼠代謝速率低27%，這個(gè)假設(shè)被排除了（Fig. 1D)。耗氧量的增加可以反映宿主的代謝活動(dòng)或者新植入的微生物群落的代謝活動(dòng)增加了。沒有有效的方法可以測量體內(nèi)微生物的代謝活動(dòng)。然而，對冷凍的腓腸肌和肝臟的微量分析的生化試驗(yàn)顯示，CONZD組的三羧酸循環(huán)中間體高于GF組。除了循環(huán)活性增加外，組織中的高能磷酸的含量并沒有重大改變。耗氧量的增加而并不伴隨高能磷酸儲(chǔ)存量的增加，意味著存在一個(gè)和生物化學(xué)相關(guān)的無用的無效新陳代謝循環(huán)。瘦素是一種脂肪細(xì)胞分泌的荷爾蒙，它的表達(dá)和脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)含量有關(guān)。此外，瘦素還能減少小鼠食物的攝入、增加能量的消耗(Fig. 2A)。它的增加和身體脂肪的增加成比例。脂肪含量的增加伴隨著空腹血糖和胰島素水平的升高(Fig. 2A)，以及葡萄糖耐受性和胰島素耐受性的增加(Fig. 2 B and C)。微生物促進(jìn)肝臟產(chǎn)生三酸甘油酯 葡萄糖和胰島素能誘導(dǎo)肝臟脂肪生成酶的表達(dá)。對CONVD小鼠14天的正常飼養(yǎng)使肝臟的三酸甘油酯水平上升了23倍(Fig. 3 A and B)，但是游離脂肪酸和膽固醇并沒有變化。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)表明小鼠肝臟mRNA編碼的，和脂肪酸從頭合成通路有關(guān)的兩個(gè)關(guān)鍵性酶乙酰輔酶A羧化酶（Acc1）、脂肪酸合成酶（Fas），其水平顯著增高(Fig. 3C)。固醇反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1(SREBP-1)和碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(ChREBP)是兩種基本的螺旋-環(huán)-螺旋/亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂肪對胰島素和葡萄糖的應(yīng)答，表現(xiàn)出協(xié)同作用。Acc1和Fas都是已知的ChREBP和SREBP-1的靶點(diǎn)。肝臟RNA的qRT-PCR實(shí)驗(yàn)表明飼養(yǎng)提高了肝臟的ChREBP mRNA水平，小幅度的提高了SREBP-1的水平(Fig. 3C)。ChREBP被絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶PP2A脫去磷酸后，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核。PP2A被5-磷酸木酮糖（Xu5P，磷酸己糖支路的中間體）活化。對小鼠移植了微生物后，肝臟的Xu5P水平相對GF組升高，細(xì)胞核中的ChREBP也增加(Fig. 3D)。我們發(fā)現(xiàn)了直接的生物化學(xué)證據(jù)證明微生物的存在促進(jìn)了腸道中單糖的吸收。GF組小鼠和CONVD組小鼠灌胃了100ul的含有5mM葡萄糖和0.2mM 2-脫氧葡萄糖，15min后處死，測量了它們腸末梢的2-脫氧葡萄糖-6-磷酸的水平，結(jié)果顯示CONVD組高兩倍。一旦進(jìn)入了小腸，單糖到門脈循環(huán)的轉(zhuǎn)移得到了微生物的促進(jìn)。我們之前的研究證明了CONVD組小腸絨毛上皮組織的毛細(xì)血管中2-脫氧葡萄糖-6-磷酸濃度比CONVR組高兩倍。微生物通過抑制腸道LPL抑制因子的表達(dá)，促進(jìn)脂肪細(xì)胞中三酸甘油酯的儲(chǔ)存。GF組和CONV-D組的附睪脂肪組織DNA并沒有明顯的不同。這個(gè)發(fā)現(xiàn)，聯(lián)系到組織化學(xué)研究，使我們推斷微生物誘發(fā)的附睪脂肪組織重量增加是由于脂肪細(xì)胞肥大(Fig. 4A)。對脂肪組織的RNA的qRTPCR分析表明脂肪細(xì)胞的生物標(biāo)記(aP2 and PPAR-)和脂質(zhì)生成(Acc1 and Fas)都沒有發(fā)生變化(Fig. 4B)。肌肉中的脂蛋白含有大量三酸甘油酯，LPL是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)脂蛋白釋放脂肪酸的因子。脂肪細(xì)胞LPL活性的增加導(dǎo)致了脂肪細(xì)胞對脂肪酸攝取的增加和三酸甘油酯的積累。在白色脂肪中，LPL根據(jù)營養(yǎng)狀況后被轉(zhuǎn)錄：禁食減少酶的活性，再投食后又增加酶的活性。有趣的是，在14天的飼養(yǎng)中我們發(fā)現(xiàn)附睪脂肪組織的LPL活性增加了122%(Fig. 4C)。而且，這種作用并不僅限于脂肪：酶的活性在心臟中也增加了99%(Fig. 4C)。胰島素水平的上升使肌肉中LPL的活性降低。因此，我們的發(fā)現(xiàn)表明微生物誘導(dǎo)的LPL水平的上升是通過其他的機(jī)制。Fiaf是一種已知的血管生成素類蛋白4，由棕色脂肪、白色脂肪、肝臟、腸產(chǎn)生。這種分泌蛋白是一種體外LPL抑制劑IC50 = 200 nM。對剛出生后GF小鼠腸道的Fiaf表達(dá)的qRT-PCR實(shí)驗(yàn)表明，在哺乳期到斷奶期的轉(zhuǎn)換中，小鼠的基因被誘導(dǎo)了。這種誘導(dǎo)并不只出現(xiàn)在GF小鼠上，較低水平的Fiaf mRNA在CONV-R體中發(fā)現(xiàn)。在哺乳期到斷奶期的轉(zhuǎn)換中，食物從富含脂肪和乳糖的母乳轉(zhuǎn)換為低脂肪和高糖分的飼料，與此同時(shí)，微生物從兼性菌轉(zhuǎn)變?yōu)閷Ｐ詤捬蹙?。這些發(fā)現(xiàn)表明Fiaf能提供一個(gè)和宿主能量變換有關(guān)的信號。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)表明成年GF小鼠抑制回腸Fiaf的表達(dá)，但是并不在肝臟和白色脂肪中產(chǎn)生抑制(Fig. 4D)。隨后對激光捕獲的微切割的腸腺和腸絨毛上皮細(xì)胞、絨毛間質(zhì)的qRT-PCR研究表明，微生物對Fiaf的抑制發(fā)生在已分化的不同的絨毛上皮細(xì)胞。綜合這些發(fā)現(xiàn)，顯示出微生物刺激肝臟的三酸甘油酯產(chǎn)生，通過轉(zhuǎn)錄因子如ChREBP的調(diào)節(jié)作用。并促進(jìn)LPL指導(dǎo)的三酸甘油酯進(jìn)入脂肪細(xì)胞，通過抑制腸道上皮細(xì)胞基因編碼的LPL抑制因子。我們用沒有Fiaf等位基因(Fig. 4E)的來驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)。8周齡雄性GF Fiaf/小鼠比同窩的有Fiaf等位基因的野生型小鼠附睪脂肪組織LPL活性高67%，確定了Fiaf是一個(gè)重要的體內(nèi)脂肪酶抑制因子。在GF基因敲除小鼠的飼養(yǎng)中沒有發(fā)現(xiàn)其他脂肪組織或心臟中的LPL活性有明顯變化。GF Fiaf/小鼠和相同年齡相同性別的CONV-D（Fiaf被抑制）同窩野生型小鼠由等量的身體總脂肪（12.8%和14.2%）。而且，對Fiaf基因缺陷GF小鼠的14天飼養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)總脂肪量只有少量增長（10%和55% Fig. 4F）。Fiaf+/-雜合子有一個(gè)中等量的增長(33%)。這些結(jié)果表明了Fiaf在微生物調(diào)節(jié)周邊脂肪的儲(chǔ)存中起著重要作用。微生物在Fiaf的表達(dá)和脂肪儲(chǔ)存中起的作用不依靠成熟的淋巴細(xì)胞和PPAR-。在養(yǎng)殖斑馬魚的時(shí)候，我們發(fā)現(xiàn)斑馬魚和小鼠相當(dāng)?shù)腇iaf基因被微生物抑制了，說明了這種應(yīng)答在脊椎動(dòng)物的進(jìn)化中被高度保留了。我們用了兩種方法來明確這個(gè)人類、小鼠、大鼠、斑馬魚和河豚的10kb的DNA序列5到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的保守的調(diào)節(jié)機(jī)制。首先，我們用PHYLOCON軟件尋找異常的序列。兩個(gè)顯著的序列被發(fā)現(xiàn)：一個(gè)和PPAR結(jié)合位點(diǎn)重疊部分；另一個(gè)包含E-box，和Heb結(jié)合位點(diǎn)相似。其次，我們用PATSER在TRANSFAC數(shù)據(jù)庫中搜尋了466種特定脊椎動(dòng)物的轉(zhuǎn)錄因子得分矩陣來尋找人和小鼠保守區(qū)的5個(gè)Fiaf同源基因的高得分結(jié)合位點(diǎn)。超過40個(gè)矩陣滿足這兩個(gè)選擇標(biāo)準(zhǔn)，包含一些由幾個(gè)釵頭函數(shù)因子（比如HNF3, HNF4和FKH8）和IFN控制的應(yīng)答元素確定的位點(diǎn)。Fiaf在篩選肝臟PPAR-因子的時(shí)候被辨認(rèn)出來。PPAR-是一個(gè)能量代謝的重要調(diào)節(jié)因子，存在于一系列組織中，如腸、肝臟、心臟和腎臟。我們發(fā)現(xiàn)和GF小鼠相比，CONV-D組小鼠小腸中的PPAR- mRNA水平減少了（1.70.2倍），但是肝臟和脂肪組織中的水平?jīng)]有變化。為了直接測試PPAR-在微生物引起的脂肪含量改變和Fiaf抑制中起的作用，B6 Ppara基因敲除GF小鼠被繁衍。810周齡雄性Ppara/小鼠與同窩的GF野生型小鼠有相同的總脂肪含量。而且Ppara/小鼠由微生物引起的脂肪含量增加并沒有減少。最后，從GF組、CONV-D組野生型和Ppara/小鼠腸道分離的RNA的qRT-PCR實(shí)驗(yàn)表明PPAR-基因的缺失不妨礙Fiaf的轉(zhuǎn)錄抑制。我們認(rèn)為宿主脂肪儲(chǔ)存對微生物的應(yīng)答并不需要PPAR-。而可作