實驗項目二住骨髓間充質(zhì)干細胞的倍增時間與生長曲線的測定.doc

精品文檔 PMSCs生長曲線和倍增時間的測定【1】 來自豬脂肪間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及其成脂分化：取生長狀況良好的P1、P3、P5、P9代細胞，用0.25%胰酶消化液，在37消化1-3min，制成單細胞懸液，然后以5x104個/ml密度接種到30個直徑為35mm培養(yǎng)皿中，隨機分成10組，每組3皿，每天檢測一組中每皿的細胞總數(shù)，取3個皿的均值，如此至第10組結(jié)束，細胞技術(shù)如下(2004,司徒鎮(zhèn)強)即一天消化3個組，共消化10天。P1，P3,P5，P9均如此，每代30個皿，共計120個皿。細胞群體倍增時間（PDT）=(t-t0)lg2/(lgNt-lgN0) t0培養(yǎng)起始時間， t,培養(yǎng)終止時間；N0培養(yǎng)初始細胞數(shù)，Nt培養(yǎng)終止細胞數(shù)?！?】 增強型綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染豬骨髓間充質(zhì)干細胞特性觀察 用0.25%胰酶將轉(zhuǎn)染后的細胞克隆消化為單個細胞，用PBS洗2遍，1x105個細胞加入75l破膜劑，振蕩10s,加入PI染料700l,室溫避光30min,上機檢測；選同期培養(yǎng)的為轉(zhuǎn)染細胞為對照組，比較EGFP轉(zhuǎn)染對細胞增殖的影響，分別計算出靜止期G0/G1 ,增殖期S%,和G2/M【3】 兩種方法分離小型豬骨髓間充質(zhì)干細胞的比較分別取兩組0,1,3代細胞，制成1x103的細胞懸液，接種到96孔板，每孔細胞懸液200微升，置37、5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)孵育，各組每24小時分別取出4孔，每孔加入MTT（2mg/ml）20微升 37孵育，4h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150微升分析純的二甲基亞砜，移至酶聯(lián)免疫檢測儀上振蕩10min,用分光光度計在492nm波長處測定每孔的吸光度值（OD492），以O(shè)D(492)值為縱坐標，時間為橫坐標繪制生長曲線?！?】 人骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)及其生物學特性研究取不同代數(shù)細胞，調(diào)整細胞濃度為2x104/ml后，接種于96孔培養(yǎng)板，置37，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，用胰酶-EDTA進行消化，用臺盼藍拒染法計數(shù)活細胞，每天取12復(fù)孔，共7天；根據(jù)計數(shù)結(jié)果繪制細胞生長曲線。記錄測得的結(jié)果，即培養(yǎng)潛伏期持續(xù)多長時間（12-24h）,多長時間進入對數(shù)生長期（3天后），對數(shù)增殖期持續(xù)時間（3-5天）,鋪滿皿底所需時間（5-7天），細胞進入平臺期多長時間及持續(xù)多長時間，停止生長時間。【5】 來自;山羊骨髓間充質(zhì)干細胞體外分離與培養(yǎng)，選擇P1，P5，P9（即早、中、晚三代）作生長曲線，進行觀察，記錄各自的潛伏期，對數(shù)生長期，平臺期山羊BMSC原代培養(yǎng)生長曲線繪制。山羊BMSC P1、P5、P9代生長曲線。【6】 來自：胎豬骨髓間充質(zhì)干細胞核移植及核移植胚胎干細胞的分離 將傳至第4代生長旺盛pFMSCs(porcine fetal mesenchymal stem cells)細胞用0.25%胰酶+0.04%EDTA(稱取胰蛋白酶0.5g和EDTA0.08g,溶入200mlPBS中，常溫磁力攪拌器攪拌直至徹底溶解，用0.22m孔徑的濾膜過濾，無菌條件分裝成小瓶（4ml/瓶），-20凍存)消化3-5min,培養(yǎng)液中和，吹打成單個細胞，調(diào)整細胞濃度為2x104個/ml,接種在兩個12孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種1ml,再補加培養(yǎng)液1ml,混勻。38.5，5%CO2,飽和濕度的條件下培養(yǎng)。常規(guī)換液。每24h用0.25%胰酶+0.04%EDTA消化液消化3孔細胞，細胞計數(shù)板計算每孔細胞總數(shù)，每孔記2次，取平均值。細胞接種當天記為第0天，連續(xù)測定8天。以時間（d）為橫坐標，每天測定3孔細胞數(shù)的平均值為縱坐標，繪制生長曲線。 胎豬骨髓間充質(zhì)干細胞周期化處理：血清饑餓處理（當細胞生長到80%匯合時，將血清濃度由10%降成0.5%，繼續(xù)培養(yǎng)2-4天；或者是利用接觸抑制處理（當細胞生長至80%匯合時，繼續(xù)使用含10%NBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)2-3天。將上述處理的細胞常規(guī)消化離心，PBS重懸細胞，按每管106細胞分裝于10ml離心管，離心，0.5mlPBS重懸細胞，邊振蕩邊緩慢加入3ml預(yù)冷的75%乙醇，4過夜固定12h以上，離心去除乙醇，用含1%NBS的PBS重懸細胞，離心洗滌2遍，200lPBS重懸細胞，加入0.8mg/mlRNase 1ml,37，30min.離心，200微升PBS重懸細胞。加入含有100g/mlPI0.1%X-100的PBS 1ml,室溫下作用10-15min，100目濾沙過濾，上機檢測。進行流式細胞儀檢測。【7】 來自：豬骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)及其核移植胚胎發(fā)育潛能研究生長曲線測定：取第3代MSCs細胞，以每孔5.0x104個/ml接種到24孔培養(yǎng)板內(nèi)。在37.5，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天取2孔，連續(xù)7天，采用血球計數(shù)板計數(shù)法計算每孔的細胞數(shù)，取平均值，即細胞數(shù)/毫升原液=（5個大方格細胞數(shù)之和/5）x104.繪制生長曲線，重復(fù)實驗3次。貼壁率曲線的測定：取pMSCs第3代細胞，以每瓶5x104個/cm2密度接種到12個25ml培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，每2h取2瓶，倒掉培養(yǎng)液（未含貼壁細胞），0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞并計數(shù)，計數(shù)貼壁率，繪制貼壁率曲線。計算公式：貼壁率（%）=貼壁存活細胞數(shù)/接種細胞數(shù)x100%分裂指數(shù)測定：用0.25%胰蛋白酶消化第3代細胞，以1x104個/cm2密度接種鋪有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24h取出觀察一次，PBS清洗三遍后，95%乙醇固定10min,PBS清洗三遍，置于5g/ml DAPI內(nèi)染色10min,PBS清洗后，滴加甘油油滴，封片后在熒光顯微鏡下觀察，同倍鏡下取5個不同視野，計數(shù)分裂相細胞，取平均值。連續(xù)7天，以時間（天）為橫坐標，細胞分裂相的千分率（%）為縱坐標，繪制分裂指數(shù)曲線圖?！?】 來自：兩種培養(yǎng)方法在豬自體骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)的比較研究直接貼壁培養(yǎng)法原代培養(yǎng)時受紅細胞影響容易失敗，且培養(yǎng)時潛伏期較長，一般為11-13天，15-17天進入對數(shù)增長期，20天左右進入生長平臺期。密度梯度離心結(jié)合直接貼壁法培養(yǎng)原代細胞較單純直接貼壁法培養(yǎng)潛伏期較短，一般為7-9天，11-15天進入對數(shù)生長期，17天左右進入生長平臺期。【9】 來自：豬骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及核移植后重構(gòu)胚胎發(fā)育能力的研究生長曲線：取pMSCs和PF第3代細胞，分別以每孔密度5x104和6.5x104接種到24孔培養(yǎng)板內(nèi)，上述條件培養(yǎng)，每天取3孔，連續(xù)7天，采用血球計數(shù)板計數(shù)法計數(shù)每孔的細胞數(shù)，計算公式：細胞數(shù)/毫升原液=(5大格細胞數(shù)之和/5)x104,繪制生長曲線。pMSCs貼壁率曲線的測定:取pMSCs第3代細胞，以每瓶5x104密度接種到12個25ml培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，每2h取2瓶，倒掉培養(yǎng)液（含有未貼壁細胞），0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞并計數(shù)，計算貼壁率。計算公式：貼壁率（%）=貼壁存活細胞數(shù)/接種細胞數(shù)x100%.繪制貼壁率曲線。PMSCs分裂指數(shù)測定：用0.25%胰蛋白酶消化第3代細胞，以1x104密度接種鋪有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中37，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24h取出觀察一次，PBS三遍后，95%乙醇固定10min,PBS清洗三遍，置于5g/mlDAPI內(nèi)染色10min,PBS清洗后，蓋在滴有甘油的載玻片上，封片后在熒光顯微鏡下觀察，同倍鏡下取5個不同視野，計數(shù)分裂相細胞，取平均值。連續(xù)7天，以時間（天）為橫坐標，細胞分裂相的千分率（）為縱坐標，繪制分裂指數(shù)曲線圖?！?0】，來自：豬骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)參考【10】 來自：SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外分離培養(yǎng)的實驗研究大鼠MSCs生長曲線測定：為了定量測定大鼠BMSCs的生長狀況，對來源于同一動物的原代細胞進行連續(xù)培養(yǎng)。分別選取生長良好的P1、P3、P5代BMSCs消化后制備成細胞懸液，調(diào)整細胞密度為5x104/ml。接種到96孔板，每孔接種200l細胞懸液進行培養(yǎng)（每孔1x104細胞）。次日起每天選擇6個培養(yǎng)孔各自加入MTT溶液（5mg/ml）20l，37繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)，吸出孔內(nèi)上清，每孔加入150lDMSO,室溫振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解，于試驗孔平行設(shè)不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照1孔。在酶標儀上選擇570nm波長，以空白孔調(diào)零，測定各孔吸光度（A）值，連續(xù)測7天，以時間為橫軸，A值為縱軸繪制細胞生長曲線?！?1】 來自：多耐藥基因MOR1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染人胎盤源間充質(zhì)干細胞的研究生長曲線的繪制及對數(shù)生長期倍增時間的測定取對數(shù)生長期細胞，消化計數(shù)，用MSC培養(yǎng)基制成細胞懸液（2x104/ml）,0.5ml/孔在24孔板中培養(yǎng)。每天取3復(fù)孔，臺盼