p53基因的功能和研究進(jìn)展.doc

P53基因功能及前沿研究現(xiàn)狀一P53基因的功能p53 基因是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因之一,是當(dāng)前腫瘤分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。自1979年Lane等1 發(fā)現(xiàn)p53 基因以來,人們對(duì)它的認(rèn)識(shí)經(jīng)歷腫瘤抗原、癌基因、抑癌基因三個(gè)階段。近年的深入研究表明p53作為一種抑癌基因發(fā)揮著越來越重要的作用。人類50以上p53都發(fā)生了突變，導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生。2P53基因定位于染色體17p13.1,長(zhǎng)20kb,含有11個(gè)外顯子，編碼393個(gè)氨基酸組成的相對(duì)分子量為53*103的蛋白質(zhì)。P53蛋白是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等。主要執(zhí)行DNA損傷“檢查點(diǎn)”功能，若DNA受損，p53蛋白水平迅速升高并激活其下游的p21/WAF1/CIP1基因表達(dá)，這是一組周期素依賴蛋白激酶的抑制劑，使細(xì)胞停滯于G1期，執(zhí)行DNA修復(fù)。若修復(fù)失敗，p53則通過激活BAX基因通路誘導(dǎo)凋亡。約50%的人類腫瘤與p53基因的等位失活或突變有關(guān)。突變型P53則具有癌基因的作用，促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。P53基因的突變常發(fā)生在結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤。P53基因功能失活機(jī)制有以下幾種：1、P53基因自身突變，導(dǎo)致P53蛋白喪失與DNA結(jié)合的能力，這是P53基因失活的重要機(jī)制。2、MDM2癌基因的負(fù)調(diào)節(jié)。MDM2是P53蛋白的靶基因，P53蛋白刺激MDM2基因的表達(dá)，而MDM2蛋白可與P53蛋白結(jié)合，一直P53蛋白接到的反式激活、增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的功能，同時(shí)MDM2蛋白可以催化p53蛋白的降解，從而形成一個(gè)反饋調(diào)節(jié)環(huán)，負(fù)調(diào)節(jié)p53蛋白的活性。3、p53蛋白與癌蛋白之間的相互作用可能是其失活的另一個(gè)重要原因。DNA腫瘤病毒蛋白如SV40大T抗原、腺病毒E1B轉(zhuǎn)化蛋白，人乳頭瘤病毒E6蛋白等，均可以和P53蛋白結(jié)合，抑制其功能活性并促進(jìn)其降解。由于p53基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及診斷治療中的重要作用，目前科學(xué)家正致力于尋找和發(fā)現(xiàn)其相關(guān)基因以及應(yīng)用于基因治療的有效方法。肝癌是一種發(fā)病率和病死率較高的惡性疾病，全世界每年約有600 000名肝癌新增患者，P53基因是一種重要的抑癌基因，與肝癌有密切的聯(lián)系，兩者之間的關(guān)系一直是人們研究的熱點(diǎn)。下面以肝癌為例研究P53基因的前沿進(jìn)展。二、P53基因與肝癌1.P53基因突變與肝癌發(fā)生的關(guān)系Ding等3 用PCR方法測(cè)得來自6個(gè)國家的239例肝癌組織標(biāo)本中P53基因第7外顯子的突變情況，發(fā)現(xiàn)總突變率84% (20239)，各國突變率分別為：日本(11.7% )、中國(11.2% )、西班牙(10.5 %)、美國(8.7 %)、朝鮮(4.8% )、越南(O)，也有人報(bào)道埃及P53基因突變率為40.0% 4。Huang等5也對(duì)我國啟東縣肝癌患者的血清中P53基因突變進(jìn)行了研究，結(jié)果表明P53基因第7外顯子第249位密碼子的突變率為40.0 %，類似的結(jié)果也見于廣西肝癌高發(fā)區(qū)(占調(diào)查樣本的64.3% )，而低發(fā)區(qū)P53基因的突變率也達(dá)l4.3 %，但呈散發(fā)性6。因此，P53基因突變?cè)诟伟┲衅毡榇嬖?，?duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)肝癌具有重要意義。p53基因突變的一個(gè)特點(diǎn)是引起蛋白質(zhì)功能改變的錯(cuò)義突變及無義突變或終止突變，在肝癌中p53基因點(diǎn)突變是最為頻發(fā)的事件，p53等位基因雜合型缺失頻率可達(dá)2560，這些突變主要位于p53基因DNA結(jié)合域，有些突變具有腫瘤特異性，如p53249Arg-rSer突變?yōu)镻HC特有的并且p53的異常在PHC中普遍存在。249突變損傷p53的機(jī)制可能與p53 249突變位于p53 DNA結(jié)合域有關(guān)，249突變后可能直接影響p53作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游腫瘤相關(guān)基因的功能，p53功能的喪失使細(xì)胞不受細(xì)胞周期G1S限制點(diǎn)的控制而持續(xù)增殖，這可能是其在PHC發(fā)生發(fā)展中起作用的重要機(jī)制之一。p53中249突變與HBV及AFB1緊密相關(guān)，HBV和AFB1可協(xié)同導(dǎo)致抑癌基因p53 249編碼子突變，HBV可以整合到肝細(xì)胞基因組中引起基因的異常表達(dá)或突變 7。HBV增加了細(xì)胞的增殖，使含AFB1誘導(dǎo)的p53 249突變得以擴(kuò)增，HBV增加了AFB1代謝酶如P450的水平，HBV通過結(jié)合修復(fù)蛋白或結(jié)合損傷的DNA來抑制核苷酸切除修復(fù)，使AFB1一DNA加合物持續(xù)存在，從的頻率，HBV增加氧化自由基可導(dǎo)致p53突變，HBX通過抑制p53的活性減少p21 Wall的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，同時(shí)該蛋白可增加p53突變的整體幾率，使p53突變率高達(dá)80.0 86.0 。但有研究8表明249編碼子的突變并沒有影響p53蛋白的表達(dá)，提示249突變對(duì)p53影響是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。吳智群 9等做動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單純的p53基因249突變可能并不足以引起肝細(xì)胞癌變，當(dāng)用含二乙基亞硝胺(DEN)溶液讓含p53 249突變的小鼠自由飲用30周后解剖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)90 的小鼠發(fā)現(xiàn)肝臟有腫瘤長(zhǎng)出，經(jīng)病理切片染色提示腫瘤為肝細(xì)胞肝癌，而對(duì)照組不含p53 249突變的小鼠很少能夠誘發(fā)肝細(xì)胞癌，說明p53 249突變可以增敏DEN對(duì)肝細(xì)胞的癌變作用。朱剛劍等10發(fā)現(xiàn)血吸蟲感染對(duì)原發(fā)性肝癌組織中p53突變蛋白的過量表達(dá)有一定的促進(jìn)作用，可能對(duì)肝細(xì)胞癌患者p53腫瘤抑制基因突變有影響，這對(duì)探索血吸蟲病與原發(fā)性肝癌的關(guān)系有一定意義。HSP70家族與突變或野生型p53蛋白結(jié)合在調(diào)控p53蛋白功能方面可致PHC的發(fā)生，李三峰等11的研究結(jié)果，提示p53蛋白與HSP70共同表達(dá)可能與肝癌的發(fā)生有關(guān)。2.p53基因與肝癌基因治療p53基因應(yīng)用于肝癌的基因治療，是以正常的野生型p53基因替代肝細(xì)胞中突變的p53基因。利用基因轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，尋找高效、導(dǎo)向性的載體系統(tǒng)成為肝癌基因治療臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。目前，向肝癌細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)人外源基因的方法主要有病毒法和非病毒法兩種。2.1 病毒法常用的病毒以逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒作載體，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只感染處于分裂期的細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞，而對(duì)高分化不分裂的細(xì)胞就不能實(shí)施基因轉(zhuǎn)移。腺病毒載體則對(duì)各期的細(xì)胞均可感染，所以目前腺病毒載體更常用作p53轉(zhuǎn)移的載體，腺病毒介導(dǎo)的p53基因治療已廣泛開展。ReisetM等12通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)：腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移可有效地將p53基因?qū)四[瘤細(xì)胞中；以GFP為報(bào)告基因，觀察到了腺病毒對(duì)肝癌細(xì)胞BEL402、HLE及HuH 7均有很高的轉(zhuǎn)染率，腺病毒能有效地將目的基因?qū)敫伟┘?xì)胞中并高效表達(dá) J。BIY2102腺病毒載體轉(zhuǎn)染后能顯著提高p53突變的HIE和HUH27細(xì)胞對(duì)順鉑和絲列霉素2C的敏感性，增強(qiáng)了化療藥物對(duì)HIE和HUH27細(xì)胞的殺傷作用，這為以腺病毒為載體將目的基因?qū)烁伟┘?xì)胞提供了前提。有資料顯示：用野生型p53病毒載體經(jīng)肝動(dòng)脈注射治療轉(zhuǎn)移性肝癌的臨床試驗(yàn) ，野生型p53基因?qū)烁伟┘?xì)胞中，可以發(fā)揮殺滅或抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。Terence等以受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)介導(dǎo)野生型p53轉(zhuǎn)染含突變p53的肝癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)能明顯抑制瘤細(xì)胞的生長(zhǎng) ，通過表達(dá)wtp53重組腺病毒載體，將p53基因?qū)烁伟┘?xì)胞株一PLE/PRE/5細(xì)胞，通過誘導(dǎo)其凋亡和細(xì)胞周期阻滯可抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。2.2 非病毒法脂質(zhì)體載體脂質(zhì)體(1iposome)是磷脂依靠疏水締合作用在水中自發(fā)形成的一種分子有序組合體，為多層囊泡結(jié)構(gòu)，每層均為類脂雙分子膜，層問和脂質(zhì)體內(nèi)核為水相，雙分子膜為油相。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移具有以下優(yōu)勢(shì)：脂質(zhì)體是非病毒性載體，轉(zhuǎn)染過程方便易行，重現(xiàn)性好，與細(xì)胞膜融合將目的基因?qū)爰?xì)胞后，脂質(zhì)體即被降解，無毒，無免疫原性；DNA或RNA可得到保護(hù)，不被滅活或被核酸酶降解；脂質(zhì)體攜帶的基因可能轉(zhuǎn)運(yùn)至特定部位； 體外和體內(nèi)試驗(yàn)都表明，接近染色體大小的DNA片段也能被轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主基因組中并增長(zhǎng)。運(yùn)用脂質(zhì)體作為載體較單純導(dǎo)人基因具有更高的轉(zhuǎn)染效率，在一定范圍內(nèi)，基因的量與轉(zhuǎn)染效率成正比，同時(shí)宿主體不會(huì)出現(xiàn)外源性病毒基因所致的特異性免疫反應(yīng)，表達(dá)時(shí)間較腺病毒載體長(zhǎng)、分裂期及非分裂期細(xì)胞均可被轉(zhuǎn)染等特點(diǎn)。研究表明轉(zhuǎn)鐵蛋白能增強(qiáng)脂質(zhì)體一基因轉(zhuǎn)染13 。三p53基因研究現(xiàn)狀隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)和生物信息學(xué)飛速發(fā)展,p53的突變分析日趨完善。早期p53 研究主要采用免疫組織化學(xué)技術(shù),但p53的半衰期極短,此方法檢測(cè)結(jié)果往往不準(zhǔn)確?，F(xiàn)代分子生物學(xué)方法并不著眼于p53是野生型還是突變體,而是直接從空間構(gòu)型上識(shí)別堿基錯(cuò)配。片段分析可以完整精確的檢測(cè)出p53 的突變類型,最新的自動(dòng)片段分析技術(shù)還有利于研究者采集片段信息。某些生物技術(shù)及其產(chǎn)品也在p53 介導(dǎo)的腫瘤治療方面發(fā)揮日益重要的作用。研究人員將野生型的p53基因cDNA片段克隆進(jìn)腺病毒載體并轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞,但遺憾的是轉(zhuǎn)染后基因無法適時(shí)、適地、適量地調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。另外,研究人員通過ON YX2015系統(tǒng)對(duì)含有高表達(dá)p53變異基因的細(xì)胞進(jìn)行靶向定位,直接殺死含有變異p53基因靶細(xì)胞,而對(duì)表達(dá)野生型p53基因的細(xì)胞無殺傷作用。也有研究人員試圖將突變型p53 蛋白轉(zhuǎn)化為野生型p53 蛋白,治療腫瘤。研究人員已開發(fā)出一種類似p53的多肽,用于干擾p53-MDM2復(fù)合物的形成,促進(jìn)p53 釋放并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯或促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這些小的肽段可以結(jié)合到抗原決定簇,防礙p53和MDM2之間的相互作用,治療腫瘤14。研究人員把人和小鼠體內(nèi)糖-膽固醇復(fù)合物當(dāng)p53 的信號(hào)通路來促使細(xì)胞凋亡。研究人員發(fā)現(xiàn)糖-膽固醇的去泛素化作用可以增加p53穩(wěn)定性,引發(fā)細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡。另外,該復(fù)合物還可激活p53通路(p53 at ser 46) ,包括p53 兩個(gè)家族成員,p63和p73。最后,該復(fù)合物還可激活Pin1 ,全面的活化p53,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。盡管目前糖2膽固醇的抑癌機(jī)理還在探索中,但確定的是p53通過不可逆的抑制細(xì)胞生長(zhǎng),引起細(xì)胞凋亡。最近Svane IM等15還研制結(jié)合p53 肽段的樹突狀細(xì)胞疫苗,臨床期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在接種疫苗后,約1/3的患者病情穩(wěn)定或者出現(xiàn)病情的輕度消退,同時(shí)伴隨p53 的高表達(dá)。這些新的治療方法讓人們看到人類攻克癌癥的新希望。1 Lane DP ,Crawford LV1 T antigen is bound to a host protein inSV402t ransformed cellsJ1Nature ,1979 ,278 (5701) :261-2632 趙金香，張強(qiáng)，李耀華 腫瘤抑制基因p53與自噬 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué) 2011，19（9）：1896-18993Ding X,Park YN,Taltavull TC,et a1.Geographic characterization of hepatitis virus infections，genotyping of hepatitis B virus，and p53 mutation in hepatocellular carcinoma analyzed by in situ detection of viral genomes from carcinoma tissues：comparison among six 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