實(shí)驗(yàn)二十二 甲殼素和殼聚糖的制備及測(cè)定.doc

實(shí)驗(yàn)二十二甲殼素和殼聚糖的制備及測(cè)定目的要求（1）了解和掌握甲殼素和殼聚糖的制備方法。（2）掌握殼聚糖的測(cè)定方法。原 理甲殼素（Chitin，譯音幾?。┯址Q甲殼質(zhì)、殼多糖、幾丁質(zhì)等。它是在1811年，被法國科學(xué)家HBraconnot在進(jìn)行蘑菇研究的，從霉菌發(fā)現(xiàn)的。在蟹等硬殼中，含甲殼素1520，碳酸鈣75。甲殼素是聚-2-乙酰胺基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖，以-（14）糖苷鍵連接而成，是一種線性的高分子多糖，即天然的中性粘多糖。它的分子結(jié)構(gòu)與纖維素有些相似，基本單位是殼二糖（chitobiose），其結(jié)構(gòu)式如下：甲殼素若經(jīng)濃堿處理，進(jìn)行化學(xué)修飾去掉乙?；吹玫綒ぞ厶牵–hitosa）又稱脫乙酰基殼多糖、脫乙酰甲殼素。 在一般條件下，甲殼素不能被生物降解，不溶于水和稀酸，也不溶于一般有機(jī)溶劑。食品工業(yè)及水產(chǎn)加工地區(qū)有大量蝦皮、蝦頭，蟹殼等下腳，可以利用來制備甲殼素和殼聚糖等。殼聚糖具有廣泛的用途：在食品工業(yè)上，把殼聚糖在溫和的條件下，局部水解后粉碎成末，得到的殼聚糖產(chǎn)品稱為微晶殼聚糖，可用作冷凍食品（冷肴、湯汁、點(diǎn)心）和室溫存放食品（蛋黃、醬等）的增稠劑和穩(wěn)定劑。用水解方法可以制得純的N-乙酰氨基葡萄糖。N-乙酰氨基葡萄糖是腸道中雙叉乳酸桿菌的生長因子，因此可作為嬰兒食品的保健添加劑。在醫(yī)藥工業(yè)上，由于殼聚糖是類似纖維狀的高分子化合物，和生物體有良好的親和作用，在生物體內(nèi)可被分解吸收，所以用它可制作手術(shù)線，傷好后線與肉長在一起 ，可免去拆線之苦；用它做人造皮膚，植入受傷傷口，可長出新的不帶疤痕的表皮；還可用于制作人造血管、人工腎；用殼聚糖制成的微型膠囊，放入藥劑，植入人體內(nèi)，很容易結(jié)合在一起，使藥物緩慢地釋放，起到長期治療的效果；用它還可制成透析膜、超濾膜和脫鹽的反滲透膜，與纖維素等的交聯(lián)復(fù)合體可作為分子篩，用作藥物的載體，具有緩釋、特效的優(yōu)點(diǎn)，國外正研究作許多藥物的緩釋劑。若以戊二醛等作交聯(lián)劑，可與許多酶或微生物細(xì)胞固定化，如固定化天門冬酰胺酶；殼聚糖是堿性多糖，有止酸、消炎作用，可抑制胃潰瘍；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，還可降低膽固醇、血脂，國外已報(bào)道用作心血管系統(tǒng)降低膽固醇的藥物；經(jīng)分子修飾制得肝素類似結(jié)構(gòu)物，具抗血栓作用。據(jù)報(bào)道，由殼聚糖可制備抗凝血素，防止凝血酵素原轉(zhuǎn)化為凝血酵素，抑制血液中纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白而不呈凝血現(xiàn)象。殼聚糖是一種天然高分子螯合物，用它處理含金屬的廢水，既可凈化污水，又可回收金屬，它還可以同具有陽離子的活性泥、蛋白質(zhì)及一些固體微粒結(jié)合，因此一些肉類加工廠、食品廠和釀酒廠利用它處理廢水，使廢水排放達(dá)到一般標(biāo)準(zhǔn)。在日化工業(yè)上，殼聚糖可作為化妝品和護(hù)發(fā)素的添加劑，增強(qiáng)保護(hù)皮膚、固定發(fā)型的作用。在農(nóng)業(yè)上，用殼聚糖處理的植物種子，可以增強(qiáng)抗病蟲害的能力，提高產(chǎn)量。在水果加工中，殼聚糖溶劑可使水果保鮮度延長數(shù)月。 甲殼素都是與大量的無機(jī)鹽和殼蛋白緊密在一起的。因此，制備甲殼素主要有脫鈣和脫蛋白兩個(gè)過程。用稀鹽酸漫泡蝦、蟹殼，然后再用稀堿液浸泡，將殼中的蛋白質(zhì)萃取出來，最后剩余部分就是甲殼素。采用不同的方法可以獲得不同脫乙酰度的殼聚糖。最簡(jiǎn)單、最常用的是采用堿性液處理的脫乙酰方法。即將已制備好的甲殼素用濃的氫氧化鈉在較高溫度下處理，就可得到脫乙酰殼多糖。 測(cè)定甲殼素脫乙酰基的程度，實(shí)際上可以通過測(cè)定殼聚糖中自由氨基的量來決定。殼聚糖中自由氨基含量越高，那么脫乙酰程度就越高，反之亦然。殼聚糖中脫乙酰度的大小直接影響它在稀酸中的溶解能力、黏度、離子交換能力和絮凝能力等，因此殼聚糖的脫乙酰度大小是產(chǎn)品質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)。脫乙酰度的測(cè)定方法很多，如酸堿滴定法、苦味酸法、水楊醛法等。本實(shí)驗(yàn)采用苦味酸法測(cè)定殼聚糖的乙酰度。苦味酸通常用于不溶性高聚物的氨基含量的測(cè)定。在甲醇中苦味酸可以與游離氨基在堿性條件下發(fā)生定量反應(yīng)。同樣，苦味酸也可以與甲殼素和殼聚糖中游離氨基發(fā)生反應(yīng)。由于甲殼素和殼聚糖均不溶于甲醇，而二異丙基乙胺能與結(jié)合到多糖上的苦味酸形成一種可溶于甲醇的鹽，這種鹽能從多糖上釋放出來。該鹽在358 nm的吸光值與其濃度（0115molL）呈線性關(guān)系。通過光吸收法測(cè)定這種鹽的濃度，即可推算出甲殼素和殼聚糖上氨基的數(shù)量，進(jìn)而計(jì)算出樣品的乙酰度。此法的優(yōu)點(diǎn)是：適用于從高乙酰度到不含乙酰度的寬范圍，無需復(fù)雜設(shè)備。其樣品量只需數(shù)毫克至數(shù)十毫克。 原料、試劑和器材、原料 新鮮蝦殼。二、試劑110 mo1L苦味酸甲醇液：稱取苦味酸（picric acid，又稱三硝基苯酚）2290.0g，定容于1L甲醇液中。0.1 molL和0.1 mmolL苦味酸甲醇液由10 molL液稀釋得到。20.1 molL二異丙基乙胺（DIPEA）甲醇液：稱取10.1g二異丙基乙胺定容于1L的甲醇液中。3無水乙醇 這里用于調(diào)節(jié)pH值，選用分析純?cè)噭ˋR ）。4甲醇 這里用于調(diào)節(jié)pH值，選用分析純?cè)噭ˋR ）。510鹽酸 這里用于調(diào)節(jié)pH值，選用化學(xué)純?cè)噭–P）。640%氫氧化鈉。這里用于調(diào)節(jié)pH值，選用化學(xué)純?cè)噭–P）。一、 器材1粉碎機(jī)2玻璃燒杯 2000mL43低溫減壓干燥機(jī)4紫外分光光度計(jì)5層析柱（內(nèi)徑0.5cm10cm）6抽濾瓶。7玻璃試管 16160mm108移液管 0.5mL2、1mL4、10mL2甲殼素和殼聚糖的制備一甲殼素的制備1操作路線2操作步驟1）清洗處理 收集對(duì)蝦頭及外殼，去掉槍刺，用水洗凈，曬干或烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎過篩得蝦頭皮粉。2）脫鈣 將蝦頭皮粉倒入玻璃燒杯中，加入25倍量的10的鹽酸，在室溫條件下，攪拌3h，然后抽濾，用水洗濾渣至pH為7.0，干燥后即得脫碳酸鹽蝦頭皮粉 3）脫脂 將脫碳酸鹽蝦頭皮粉移入另玻璃燒杯內(nèi)，加入2倍量的4的氫氧化鈉溶液，加熱至85，恒溫?cái)嚢?4h，然后抽濾，收集濾渣，用水洗濾渣至中性,干燥即得甲殼素粗品。4）酸處理 將甲殼素粗品移玻璃燒杯入中，加入23倍的 10的鹽酸，加熱到60，攪拌15min左右，然后抽濾，濾液用水洗至中性，干燥即得甲殼素產(chǎn)品。二殼聚糖的制備1工藝流程2操作步驟1）脫乙酰基 將甲殼素倒入玻璃燒杯中，加入2倍量的40的濃氫氧化鈉溶液，加熱到110以上，攪拌反應(yīng)1h，濾除堿液，用水洗至中性。依脫乙酰度的不同要求，重復(fù)用濃堿處理12次，濾除堿液，水洗至中性，壓擠至干，吊干產(chǎn)品。2）干燥 將吊干的濕產(chǎn)品置于石灰缸或干燥器中干燥，即得殼聚糖產(chǎn)品。三、殼聚糖的乙酰度測(cè)定1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制配制五種不同濃度的二異丙基乙胺苦味酸的甲醇溶液。每份吸取0.1molL的二異丙基乙胺甲醇溶液1.0mL，分別添加0.10.20.30.40.50mL的100molL苦味酸甲醇液，再用甲醇液補(bǔ)充至10.0mL，DIPEA-苦味酸濃度分別為：10，20，30，40，50molL。混勻后在波長358nm處測(cè)出相應(yīng)的吸光值（A）。以吸光值為縱坐標(biāo)，DIPEA-苦味酸的濃度（molL）為橫坐標(biāo)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2殼聚糖乙酰度的測(cè)定準(zhǔn)備一支小玻璃層析柱（內(nèi)徑0.5cm10cm），并精確稱重，然后將殼聚糖樣品（530 mg）粉碎成細(xì)末后裝填到小層析柱內(nèi)，再精確稱重。兩次稱量值之差即為樣品質(zhì)量（mg）。用0.1 molL二異丙基乙胺的甲醇溶液緩慢流過小層析柱，共用15 min，再用10 mL，甲醇液淋洗，除去多糖樣品上殘留的鹽。然后將0.51.0mL的0.1 molL苦味酸的甲醇溶液慢慢地加入柱中，室溫下苦味酸與樣品中的氨基反應(yīng)6h，形成苦味酸多糖復(fù)合物，接著用速度為0.5mLmin的甲醇液30 mL淋洗，使沒有結(jié)合到氨基上的苦味酸完全被淋洗出來。再用0.1 molL二異丙基乙胺的甲醇液0.51.0mL緩慢地加入柱內(nèi)，保持30 min，然后用約8mL甲醇液淋洗柱子，收集洗脫液，并用甲醇液準(zhǔn)確地補(bǔ)足到10 mL。測(cè)定收集的可溶性DIPEA-苦味酸甲醇溶液在358 nm的吸光值（必要時(shí)作適當(dāng)稀釋），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得知其濃度。該甲醇鹽溶液摩爾消光系數(shù)為15650L（molcm），也可以利用此值直接計(jì)算出其濃度。3乙酰度的計(jì)算根據(jù)下式計(jì)算出樣品的乙酰度（degree of Nacetylation，d.a.）：m161n乙酰度（da.）M+42n式中，m為樣品質(zhì)量（mg）；n為從樣品上洗脫出來的苦味酸的物質(zhì)的量（mmol）；161表示D-葡萄糖胺殘基的摩爾質(zhì)量（mgmmol）；42為N乙酰-D-葡萄糖胺摩爾質(zhì)量減去D-葡萄糖胺摩爾質(zhì)量的差值（mgmmol）。思 考 題1.甲殼素和殼聚糖在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有何異同點(diǎn)？2.殼聚糖有何用途？ 參考文獻(xiàn)1.陳來同，41種生物化學(xué)產(chǎn)品生產(chǎn)技術(shù)，175181.北京，金盾出版社，1994.10.2王風(fēng)山，凌沛學(xué)，生花藥物研究，357361，人民衛(wèi)生出版社，1997.12.3單虎，王寶維，張麗等，甲殼素及殼聚糖提取工藝的研究食品科學(xué)，1997，18（10）：14154盧鳳琦，曹宗順制備條