實驗三 微生物檢定法測定硫酸慶大霉素的效價.docx

實驗三 微生物檢定法測定硫酸慶大霉素的效價一、概述 由于抗生素多為結構復雜的多組分物質，異構體多，且不穩(wěn)定，容易產生降解雜質，故各國藥典均以微生物檢定法為主要含量測定法，因為抗生素藥品的醫(yī)療作用主要是它的抗菌活力，而微生物檢定法正是以抗生素的抗菌活力為指標來衡量抗生素效價的一種方法，其測定原理與臨床要求相一致，能直接反映抗生素醫(yī)療價值，因此一直為各國藥典所采用的主要測定方法。 微生物檢定法測定抗生素效價，一般可分為稀釋法、比濁法和瓊脂擴散法三類。以瓊脂擴散法應用最廣泛，為目前國際上測定抗生素效價的通用方法。瓊脂擴散法，亦稱管碟法。系采用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內的擴散作用，采用量反應平行線原理的設計，比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產生抑菌圈的大小，以測定供試品效價的一種方法。二、基本設備、用具和試驗材料1. 基本設備(1) 抗生素效價測定實驗室：室內應為半無菌，裝有紫外線燈，有固定的效價測定臺，臺面要求水平、防震。該室應與稀釋抗生素溶液的工作室隔離，以防止空氣、地面污染抗生素。(2) 超凈工作臺：超凈工作臺應放置在潔凈工作室或半無菌室內。(3) 抑菌圈面積測量分析儀：該儀器裝有微處理機，可自動測量抑菌圈面積，并打印出統(tǒng)計分析的各種數(shù)據(jù)。2.用具（1） 玻璃雙碟：為硬質玻璃制品，碟底內徑約90mm，碟高16-17mm，碟底面應平，厚薄均勻無凹凸現(xiàn)象。新購的雙碟應按上述要求進行檢查。檢查時可將雙碟底平放在水平臺上，每碟內加入2ml染料液，仔細觀察碟底反映的顏色深淺是否一致，挑選底部平的雙碟，洗凈晾干，置高溫烘箱內140-160干熱滅菌2小時后備用。(2) 陶瓦圓蓋：應平，無凹凸現(xiàn)象。(3) 不銹鋼小管：外徑7.80.1mm，內徑6.00.1mm，高10.00.1mm，重量差異不超過25mg，鋼管內外壁要求光潔，管壁厚薄要一致，兩端面要平坦光潔。(4) 小鋼管放置器：四孔，一臺。(5) 游標卡尺：精密度0.02mm。(6) 滴管：管口應細長平滑，不得有缺口。3. 試驗材料(1) 培養(yǎng)基I：取胨5g、牛肉浸出粉3g、磷酸氫二鉀3g和蒸餾水1000ml，加熱融化，混合，調節(jié)pH使其值比最終的pH值略高0.2-0.4，加入瓊脂20g，加熱溶化過后，調節(jié)pH值使滅菌后為7.8-8.0，在115滅菌30分鐘。(2) 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：取胨10g、氯化鈉5g和肉浸液1000ml，混合，調節(jié)pH使比最終的pH值略高0.2-0.4，加入瓊脂15-20g，加熱溶化過后，調節(jié)pH值使滅菌后為7.2-7.4，分裝，在115滅菌30分鐘，趁熱斜放使凝固成斜面。(3) 磷酸鹽緩沖液（pH7.8）：取磷酸氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀0.41g，加蒸餾水使成1000ml，在115滅菌30分鐘。(4) 試驗用菌種：短小芽孢桿菌(CMCC(B)63 202). 短小芽孢桿菌菌懸液的制備和保存：取短小芽孢桿菌試驗用菌種斜面1支，按無菌操作要求加入滅菌水2ml，將菌苔洗下，搖勻，取出1ml接種于盛有30ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的100ml 三角瓶中，在35-37培養(yǎng)7日，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應有芽孢85%以上，用滅菌水20ml將芽孢洗下，制成懸液，在65水浴中加熱30分鐘，即得，置5冰箱中保存，可使用6個月。4. 雙碟的制備：取直徑約90mm、高16-17mm的平底雙碟，分別注入加熱融化的培養(yǎng)基I 20ml,使在碟底內均勻攤布，放置水平臺上使凝固，作為底層。另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，放冷至50-60，加入菌懸液適量（能得清晰的抑菌圈為度）,搖勻，在每1雙碟中分別加入5ml，使在底層上均勻攤布，作為菌層。放置水平臺上冷卻后，在每1雙碟中以等距離均勻安置不銹鋼小管（內徑6.00.1mm，高10.00.1mm，外徑7.80.1mm）4個，用陶瓦圓蓋覆蓋備用。三、二劑量檢定法取照上述方法制備的雙碟不得少于4個，在每1雙碟中對角的2個不銹鋼小管中分別滴裝高濃度及低濃度的標準品溶液，其余2個小管中分別滴裝相應的高低兩種濃度的供試品溶液；高、低濃度的劑距為2：1或4：1。在35-37條件下培養(yǎng)14-16小時后，測量各個抑菌圈的直徑（或面積），照生物檢定統(tǒng)計法中的(2.2)法進行可靠性測驗及效價計算。四、硫酸慶大霉素的效價測定：1. 標準品溶液的配制：精密稱取硫酸慶大霉素標準品適量，加乙醇溶解后，用滅菌水制成每1ml中含1000單位的溶液，作為貯備液，置5以下的冰箱中保存，可使用7日。將貯備液加pH7.8磷酸鹽緩沖液稀釋，使標準品高劑量溶液和低劑量溶液每ml中分別含硫酸慶大霉素10U和5U。2. 供試品溶液的配制：取硫酸慶大霉素腸溶片4片，研細，用乙醇適量（硫酸慶大霉素約0.25g，用乙醇25ml），分次研磨使硫酸慶大霉素溶解，并用水稀釋成每1ml中約含1000單位的溶液，搖勻，靜置，精密量取上清液適量，按（1）法 同法配制，使供試品高劑量溶液和低劑量溶液按標示量計算每ml中含硫酸慶大霉素分別為10U和5U。3. 測定法：按二劑量檢定法測定效價，計算出供試品中含硫酸慶大霉素相當于標示量的百分數(shù)。附錄：生物檢定統(tǒng)計法中的（2.2）法 抗生素微生物檢定法是以微生物為工具，不可避免地存在著較大的生物差異性，因此，必須借助于生物統(tǒng)計方法來減少生物差異對檢定結果的影響，使結果達到一定的精確度。英、美、日等國家藥典附錄中都詳細地制定了生物檢定方法的實驗設計和統(tǒng)計分析，并根據(jù)生物統(tǒng)計的要求規(guī)定了各個品種的誤差范圍。中國藥典從1985年版起增加了生物檢定法的實驗設計和可靠性測驗及誤差估計等內容，這對判斷檢驗質量及促使檢驗方法的改進等方面都具有重要意義。1.可靠性測驗 抗生素微生物檢定法按照觀察的方法和生物反應的類型屬量反應，即觀察每一反應本身所表現(xiàn)的程度，可以用量來表示。實驗設計采用供試品（T）和已知效價的標準品（S）對比試驗的平行線原理。由于平行線測定的計算原理是在一定劑量范圍內T和S的對數(shù)劑量與反應或反應的特定函數(shù)呈直線關系以及在T和S兩條直線互相平行（當T和S的活性組分基本相同時）的基礎上，因此，可靠性測驗就是運用統(tǒng)計方法來驗證實驗結果是否符合量反應的平行線設計原理，是否顯著偏離了直線性和平行性，以便評價實驗結果的可靠性。對不是顯著偏離平行偏離直線（在一定的概率水平下）的實驗結果，認為可靠性成立，方可按有關公式計算供試品的效價和可信限。(1)可靠性測驗的統(tǒng)計方法抗生素微生物檢定法的可靠性測驗采用F測驗，即實驗結果的方差分析。方差分析為測驗多組均數(shù)之間的差別是否顯著。通過統(tǒng)計運算求得試品間、回歸、偏離平行、劑間及碟間項的方差，并以統(tǒng)計得的以上各項方差和誤差項方差（S2）的比值稱F值（各項F值=）作為指標來觀察其差別的顯著性程度。將實驗結果求得的F值，按相應各項的自由度及誤差項的自由度查F值表來判斷實驗結果求得的F值是大于還是小于F值表上和的F值。若大于的F值，則P0.05,表示差別有顯著意義。若大于的F值，則P0.05,表示差別無顯著意義。P稱概率，即某一事件在一定條件下可能發(fā)生的機會，P就是機會的定量表現(xiàn)形式，用數(shù)量的形式來反映出事情必然性的規(guī)律，它是生物統(tǒng)計的基礎，一般在統(tǒng)計中評定實驗結果的可靠程度以P表示，P=0.05，即表示可靠性有95%的把握，P=0.01，即表示可靠性有99%的把握?？煽啃詼y驗一般分為下述兩個步驟：實驗結果的方差分析：從實驗數(shù)據(jù)的總變異差方和中分出劑間變異和碟間變異的差方和后，即為誤差項的差方和，其方差以S2表示。首先按劑量組將各反應值y（抑菌圈的直徑）列成方陣見表1。表1 實驗結果雙碟數(shù)劑 量 組總 和總和平方(1)(2)(3)（K）ymym2123my1(1)y2(1)y3(1)ym(1)y1(2)y2(2)y3(2)ym(2)y1(3)y2(3)y3(3)ym(3)y1(k)y2(k)y3(k)ym(k)y1y2y3ymy12y22y32ym2總 和y(k)y(1)y(2)y(3)y(k)y總 和ym2總和平方y(tǒng)(k)2y(1)2y(2)2y(3)2y(k)2總 和y(k)2y2的總和y2表1中，K為S和T的劑量組數(shù)，m為各組內y的個數(shù)（即雙碟數(shù)），各組的m應相等，n為反應的總個數(shù)，n=mk。各項變異的差方和及自由度（f）的計算差方和（總）=y2 f(總)=n 1式中 =校正數(shù)差方和（劑間）= 校正數(shù) f(劑間)=K1差方和（碟間）= 校正數(shù) f(碟間)=m 1差方和（誤差）=差方和（總）差方和（劑間）差方和（碟間） f(誤差)=f(總)f(劑間)f(碟間)=（k1）（m1）方差=S2=或S2=劑間變異的分析：劑間變異的顯著性測驗主要包括S和T試品間、回歸、平行性及直線性等變異內容。各項變異的差方和及自由度（f）按表2二劑量法和表3三劑量法可靠性測驗正交多項系數(shù)表計算。表2 二劑量法可靠性測驗正交多項系數(shù)表變異來源y(k) 差 方 和自 由 度S1S2T1T2正交多項系數(shù)（Ci）試 品 間-1-1111回 歸-11-111偏離平行1-1-111表中正交多項系數(shù)用Ci表示，y（k）為各劑量組反應值之和。各項變異的差方和=，除以該項的自由度即等于方差。以各變異項的方差與誤差項的方差（S2）的比值作為指標，進行F測驗，以判斷各項變異來源差異是否有顯著意義。（2）可靠性測驗結果分析 試品間：驗證標準品（S）和供試品（T）的結果是否有差別，如P0.05，即表示差別無顯著意義。 回歸：驗證S和T兩條對數(shù)劑量反應直線是否偏離直線性，因實驗設計采用的劑量間距是等比級數(shù)，故反應應隨劑量的增加而有規(guī)律的增加，若各反應點均勻的分布在一條直線上，就表明實驗的直線性好，當該項統(tǒng)計得的P0.05，即證明偏離平行不顯著，從而說明S和T兩條直線互相平行。 劑間：二劑量法和三劑量法，各有二個劑量和三個劑量，不同劑量所致的反應應有明顯的差別，如無差別則說明劑量反應不在直線范圍內，應重新調整劑量進行實驗，使該項統(tǒng)計得的P0.05時，則表示無顯著差別。但在一般情況下，雙碟之間的差別總是存在的，故在統(tǒng)計公式中已適當?shù)姆殖g差異。綜上所述，實驗最可靠的結論歸納如下：試品間差別不顯著，P0.05?；貧w顯著，0.05。二次曲線與反向二次曲線均不顯著，0.05。劑間差異顯著，0.05。.效價計算測得供試品的效價單位數(shù)（U/mg或ml）；供試品的標示量效價或估計效價； 測得的供試品（）的效價相當于的百分率。 log-1M M=：高、低劑量比值的對數(shù)二劑量法： （）（）本法計算所得效價，如低于估計效價的或高于估計效價的時，則應調整其估計效價，重新進行測定。.可信限計算由于生物差異性的存在，生物檢定的實驗誤差一般都比較大，故實驗結果只是對于真正結果的一個估計值，它對真正結果還有一段距離，可信限（L）就是對真正結果的一個估計范圍。因此，可信限是精密度的一個標志，常用來表示實驗誤差，一般以概率水平0.95時實驗結果的可信限高限和低限的范圍來表示，即“實際結果可信限”，在生物檢定中，每個品種，根據(jù)所規(guī)定的檢驗方法，都可總結出一個正常的可信限率（如英國藥典規(guī)定抗生素生物檢定法的可信限