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堿性成纖維細(xì)胞生長因子對癲癇大鼠海馬神經(jīng)元Caspase3表達(dá)的影響作者：劉君鵬，遲兆富，雷惠新，汪銀洲 作者單位：福州，福建省立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 濟(jì)南，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 【摘要】 目的 研究堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)對癲癇大鼠海馬神經(jīng)元的神經(jīng)保護(hù)作用及可能的機(jī)制。方法 戊四氮誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作后，腹腔分別注射生理鹽水(B組)和bFGF(C組)，與空白對照組(A組)按一定時段斷頭取腦，進(jìn)行HE染色和Caspase3免疫組織化學(xué)染色。觀察各組大鼠海馬神經(jīng)元的損傷以及Caspase3的表達(dá)。結(jié)果 HE染色：B組神經(jīng)元形態(tài)散亂，大量神經(jīng)元凋亡、壞死；C組可見散在的神經(jīng)元凋亡，變性壞死少見。Caspase3免疫組化染色：B組6 h可見海馬CA1、CA3和齒狀回門區(qū)部分細(xì)胞的胞漿和核內(nèi)有棕黃色沉淀物，24 h陽性細(xì)胞數(shù)及著色深度達(dá)到高峰，持續(xù)至72 h，120 h后表達(dá)減弱。C組陽性細(xì)胞數(shù)及染色度與B組有相似的時間依賴性，但總體表達(dá)較B組弱，組間各時間點(diǎn)中1272 h的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),6 h及120 h的差異則無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論 bFGF能顯著減輕癲癇所致的大鼠海馬神經(jīng)元損傷。 【關(guān)鍵詞】 癲癇；堿性成纖維細(xì)胞生長因子；Caspase3；大鼠 The effect of basic fibroblast growth factor on the expression of Caspase3 gene in hippocampal neurons of epileptic rats LIU Junpeng,CHI Zhaofu,LEI Huixin,et al.Department of Neurology,Fujian Provincial Hospital,Fujian,Fuzhou 350001, China 【Abstract】 Objective To investigate the neuronprotective function and the possible mechanism of basic fibroblast growth factor (bFGF) to hippocampal neurons of epileptic rat.Methods Epileptic seizure in rat model was induced by pentylenetetrazol and followed by normal saline(group B) or bFGFabdomeninjection(group C),normal rats without epilepsy were taken as blank control group (group A).HE staining and immunohistochemistry technique were carried out to observe the alteration of neurons and the expressions of Caspase3.Results HE staining:neuronal degeneration was observed in area CA1,CA3 and dentate hilus in both Group B and Group C,while cell degeneration and apoptosis in Group C was less than those in Group B.Caspase3 immunohistochemistry staining showed neuron apoptosis in Group C was less than those in Group B at different time points(P0.01).Conclusion The bFGF could reduce the hippocampal neuronal damage in epileptic rats significantly, which suggested that bFGF could regulate the expression of Caspase3 gene and sequentially protect neurons. 【Key words】 Seizure;Basic fibroblast growth factor;Caspase 3;Rats 癲癇是由多種病因引起的慢性腦部疾患，以腦神經(jīng)元過度放電所致的突然、反復(fù)和短暫的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征。癲癇腦損傷引起的神經(jīng)元死亡包括凋亡和壞死兩種形式。神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTF)是一類能促進(jìn)和維持特異性神經(jīng)元生長、存活和分化，并影響突觸可塑性的可溶性多肽因子，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)就是其中的一類。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，不同方式誘發(fā)的癲癇發(fā)作都可引起腦內(nèi)很多區(qū)域,包括大腦皮質(zhì)、海馬、齒狀回、內(nèi)嗅皮質(zhì)、嗅球等bFGF的升高1;同時，外源性bFGF能顯著抑制大鼠海馬內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的丟失，對癲癇誘導(dǎo)的長期行為缺陷也有明顯改善作用2。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用戊四氮化學(xué)點(diǎn)燃的方法誘導(dǎo)癲癇發(fā)作,通過Caspase3的表達(dá)觀察海馬各區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況,并用bFGF進(jìn)行干預(yù)，將其應(yīng)用后神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況與前者進(jìn)行對比，從而研究bFGF對癲癇所致的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。 1 材料與方法 1.1 大鼠分組 選用46周齡健康成年雄性Wistar大鼠36只(由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，體質(zhì)量260330 g，自由進(jìn)水、進(jìn)食，室溫1825飼養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：空白對照A組(6只)、戊四氮生理鹽水(NS)B組(12只)及戊四氮+bFGF C組(18只)。 1.2 實(shí)驗(yàn)方法 1.2.1 癲癇模型的建立： 用1.5%戊四氮做致癇劑，以50 mg/kg的劑量對B、C組大鼠進(jìn)行腹腔注射，數(shù)分鐘后即出現(xiàn)持續(xù)性全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作。并對A組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水做對照。 1.2.2 點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)： 根據(jù)Racine 6級評定標(biāo)準(zhǔn)3：0級：無任何發(fā)作跡象；I級：凝視、咀嚼或須動；II級：點(diǎn)頭或濕狗樣抖動、搔抓；III級：前肢局限性痙攣；IV級：伴有后肢站立的全身強(qiáng)直性發(fā)作；V級：伴有站立并摔倒的全身強(qiáng)直陣攣性發(fā)作。以IVV級發(fā)作持續(xù)35 min作為模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)。 1.2.3 bFGF干預(yù)： 達(dá)到點(diǎn)燃狀態(tài)后30 min，對C組給予0.5% bFGF 50 g/kg腹腔注射，B組大鼠給予等量NS腹腔注射。以后每天1次注射等量前述液體。 1.2.4 海馬組織標(biāo)本制作觀測： 按照6個亞組規(guī)定的時間(分別為癲癇發(fā)作后6、12、24、48、72 h、120 h)，將B、C組大鼠斷頭取腦，A組腹腔注射NS后30 min斷頭取腦。常規(guī)制備石蠟標(biāo)本，行HE染色及Caspase3免疫組織化學(xué)染色：標(biāo)本依次加一抗(兔抗鼠Caspase3)、二抗(生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG即用型抗體)，DAB顯色，4倍顯微鏡下觀察(515 min)，出現(xiàn)棕黃色陽性細(xì)胞時終止反應(yīng)。HE染色：光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1、CA3和齒狀回門區(qū)組織學(xué)改變；免疫組化染色結(jié)果應(yīng)用奧林巴斯TJTY400TC真彩色細(xì)胞圖像分析儀對切片進(jìn)行圖像分析。 1.3 觀測指標(biāo) (1)平均陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)(N)；(2)陽性反應(yīng)細(xì)胞平均光密度(D)；計算比較各自的表達(dá)量。 1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5軟件。計量數(shù)據(jù)以s表示，組間數(shù)據(jù)采用配對方差分析進(jìn)行多重比較。P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 2 結(jié) 果 2.1 HE染色 A組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)及齒狀回門區(qū)神經(jīng)元排列整齊緊密，邊緣清晰，胞漿透明，染色質(zhì)分布均勻，核仁清晰，形態(tài)正常；B組神經(jīng)元形態(tài)散亂，邊緣欠清晰，胞質(zhì)嗜伊紅，核固縮濃染，染色質(zhì)凝集成塊，邊集；也可見少量神經(jīng)元變性壞死，HE深染，呈現(xiàn)胞漿和胞核水腫，胞體增大。C組可見散在的神經(jīng)元凋亡，變性壞死少見。見圖1(插頁2)。 2.2 免疫組化Caspase3染色 A組各時間點(diǎn)均僅可見海馬內(nèi)有少量散在的Caspase3陽性細(xì)胞，著色不深；B、C組均在6h可見海馬CA1、CA3和齒狀回門區(qū)部分細(xì)胞的胞漿和核內(nèi)有棕黃色沉淀物，12 h可見陽性細(xì)胞數(shù)增多，染色較深，2448 h陽性細(xì)胞數(shù)及著色深度達(dá)到高峰，持續(xù)至72120 h后表達(dá)減弱。見圖2(插頁2)。 定量分析顯示，B組海馬內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)及染色度均為最高，而A組中Caspase3的表達(dá)始終維持在很低的水平，組間比較各組均有明顯差異(P0.01)；各時間點(diǎn)的比較顯示，B、C組在6 h和120 h時的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)，其余各時間點(diǎn)的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。見表1。 表1 大鼠癲癇發(fā)作后不同時間段海馬CA1區(qū)Caspase3基因的陽性表達(dá) 注：與A組比較，*P0.01；與B組同時點(diǎn)比較，#P0.05 3 討 論 近年研究發(fā)現(xiàn),在人類顳葉癲癇患者以及電點(diǎn)燃或化學(xué)點(diǎn)燃、局部或系統(tǒng)給予致癇劑等各種癲癇模型中,用形態(tài)學(xué)或生化的方法均證實(shí)癲癇發(fā)作,特別是癲癇持續(xù)狀態(tài)后,神經(jīng)元死亡具有典型的凋亡特征4,5。癲癇發(fā)作所致的神經(jīng)元損傷中凋亡普遍存在的另一證據(jù)是與凋亡有關(guān)的各種基因的表達(dá)在癲癇后出現(xiàn)了改變。 Caspase3是哺乳動物細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶,處于級聯(lián)反應(yīng)的核心位置,發(fā)揮非常重要的作用,被稱為死亡蛋白酶。如果在Caspase3激活之前進(jìn)行干預(yù),可以有效抑制凋亡的發(fā)生6。Li Wen等7研究證實(shí)，癲癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡與Caspase3 mRNA的表達(dá)密切相關(guān)，Caspase3在神經(jīng)元凋亡過程中起著重要作用，提示Caspase3參與了癲癇發(fā)作神經(jīng)元凋亡，其特異性抑制物能減輕癲癇發(fā)作導(dǎo)致的腦神經(jīng)元損害。 bFGF又稱細(xì)胞生長肽，是1974年由美國學(xué)者Gospodarowicz 首先從牛垂體中提取的一種分子量為12kD的多肽因子。bFGF在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用, 如促進(jìn)胚胎及成熟的腦組織中各種膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元前軀細(xì)胞的增生和分化，維持神經(jīng)元存活、促進(jìn)神經(jīng)元分化，對神經(jīng)元損傷起保護(hù)和再生作用。 本實(shí)驗(yàn)采用戊四氮腹腔注射的急性化學(xué)點(diǎn)燃模型,因既往組織學(xué)分析揭示，戊四氮點(diǎn)燃癲癇模型海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失和齒狀回苔蘚纖維發(fā)芽與人類癲癇極其相似，因此采用該大鼠癲癇模型對人類癲癇的研究具有一定的參考意義8。系統(tǒng)給藥與腦內(nèi)注射藥物或電點(diǎn)燃相比,可以避免人為腦部創(chuàng)傷所致的病理變化,有利于神經(jīng)化學(xué)和組織形態(tài)學(xué)方面的研究。另外，本實(shí)驗(yàn)采用癲癇后bFGF腹腔注射的方法，是因?yàn)檠芯恳炎C實(shí)，雖然在正常情況下，外源性bFGF不能通過血腦屏障，但當(dāng)腦組織受到各種損傷時，bFGF可以通過血腦屏障發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示6 h內(nèi)C組與B組陽性細(xì)胞數(shù)及染色度無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)，考慮原因?yàn)榧毙云谘X屏障破壞不完全，bFGF不能充分透過血腦屏障而發(fā)揮作用。因此腹腔給藥的方法有一定局限性，在以后的研究中，可采用側(cè)腦室注射藥物的方法進(jìn)行對比。120 h后2組間的差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義，則可能是由于癲癇所引起的病理變化已達(dá)到穩(wěn)定所致。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠癲癇發(fā)作后Caspase3的表達(dá)具有時間依賴性，2448 h達(dá)到高峰，證實(shí)了癲癇所致神經(jīng)元凋亡的高峰時段，與Henshall等9在致癇大鼠模型中用TUNEL法標(biāo)記細(xì)胞凋亡的結(jié)果相近。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平證實(shí)，bFGF對癲癇大鼠海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用，并有一定的時間依賴性。但因?qū)嶒?yàn)未深入到分子水平，因此仍不能就其作用機(jī)制作出合理解釋，需在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討研究。 目前雖有新的抗癲癇藥不斷面世，但仍有相當(dāng)一部分難治性癲癇患者不能用藥物控制發(fā)作。在我們了解了bFGF的對癲癇的神經(jīng)保護(hù)作用后，可做進(jìn)一步深入地研究，以期應(yīng)用于臨床抗癲癇的治療。現(xiàn)今bFGF已應(yīng)用于治療腦血管病、顱腦外傷和顱腦手術(shù)后遺癥、腦萎縮、腦血管病性震顫麻痹、脊髓病變及周圍神經(jīng)炎等各種疾病，并顯示出較好的療效，相信bFGF在癲癇治療領(lǐng)域一定會有廣闊的應(yīng)用前景。晉升網(wǎng)（）設(shè)有論文學(xué)院、考試學(xué)院、在線投稿等，本網(wǎng)站致力于成為醫(yī)務(wù)工作者晉升職稱心靈導(dǎo)師；是目前國內(nèi)收錄醫(yī)學(xué)期刊、醫(yī)學(xué)雜志最多最權(quán)威的醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)平臺；提供免費(fèi)醫(yī)學(xué)期刊在線閱讀；網(wǎng)羅和甄選海量優(yōu)秀醫(yī)學(xué)論文檢索，獨(dú)立研發(fā)醫(yī)學(xué)在線資源分享庫和醫(yī)學(xué)在線模擬考試庫；整合刊類、標(biāo)題、關(guān)鍵詞檢索及全文檢索，并獨(dú)家研發(fā)刊社管理和刊社加盟系統(tǒng)、在線投稿、在線查稿、在線閱讀、遠(yuǎn)程審稿、在線下載等系統(tǒng)；聚刊社力量，建服務(wù)平臺，讓晉升網(wǎng)通過“專業(yè)”走入每一個醫(yī)務(wù)人員的身邊是我們不懈的追求目標(biāo)【參考文獻(xiàn)】1 Erkanli G,Ercan F,Sirvanci S,et al.Timedependent changes in distribution of basic fibroblast growth factor immunoreactive cells in rat hippocampus after status epilepticusJ.Neurol Res，2007,29(8):816823.2 Liu Z,Holmes GL.Basic fibroblast growth factor is highly neuroprotective against 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