PCR引物設(shè)計(jì)原則PPT課件.pptVIP

引物設(shè)計(jì) 引物引物的重要性引物設(shè)計(jì)的原則引物與PCR引物設(shè)計(jì)軟件如何使用PrimerPremier5 0引物同源性分析 1 引物 primers 引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列 一個(gè)引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ) 另一個(gè)引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ) 3 3 5 5 Senseprimer Antisenseprimer 2 引物的重要性 在整個(gè)PCR體系中 引物占有十分重要的地位 PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合 不與其他非目的DNA結(jié)合 PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能對(duì)引物進(jìn)行有效的延伸 可見引物設(shè)計(jì)好壞與PCR結(jié)果密切相關(guān) 3 引物設(shè)計(jì)原則 引物長(zhǎng)度堿基分布的均衡性Tm值引物二級(jí)結(jié)構(gòu)引物3 端引物5 端引物的內(nèi)部穩(wěn)定性引物的保守性與特異性擴(kuò)增區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu) 4 引物長(zhǎng)度 一般為15 30個(gè)核苷酸 在做長(zhǎng)片段PCR或做某些特殊的PCR時(shí)應(yīng)使用較長(zhǎng)的引物 但最多不超過50個(gè)核苷酸 5 堿基分布的均衡性 同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過5個(gè)GC含量一般40 60 GC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低 使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴(kuò)增 6 引物Tm值 一般要求 55 65 計(jì)算 對(duì)于低于20個(gè)堿基的引物 Tm值可根據(jù)Tm 4 G C 2 A T 來粗略估算對(duì)于較長(zhǎng)引物 Tm值則需要考慮熱動(dòng)力學(xué)參數(shù) 從 最近鄰位 的計(jì)算方式得到 這也是現(xiàn)有的引物設(shè)計(jì)軟件最常用的計(jì)算方式 Tm H S R ln C 4 16 6log K 1 0 7 K 273 15 7 引物二級(jí)結(jié)構(gòu) 引物二聚體盡可能避免兩個(gè)引物分子之間3 端有有較多堿基互補(bǔ)發(fā)夾結(jié)構(gòu)尤其是要避免引物3 端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu) 否則將嚴(yán)重影響DNA聚合酶的延伸 8 引物3 端 引物的延伸從3 端開始 因此3 端的幾個(gè)堿基與模板DNA均需嚴(yán)格配對(duì) 不能進(jìn)行任何修飾 否則不能進(jìn)行有效的延伸 甚至導(dǎo)致PCR擴(kuò)增完全失敗 考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性 引物3 端最后一個(gè)堿基最好不與密碼子第三個(gè)堿基配對(duì) 9 引物5 端 引物5 端可以有與模板DNA不配對(duì)堿基 在5 端引入一段非模板依賴性序列 5 端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)序列 酶切位點(diǎn)5 端加上適當(dāng)數(shù)量的保護(hù)堿基 5 端的某一位點(diǎn)修改某個(gè)堿基 人為地在產(chǎn)物中引入該位點(diǎn)的點(diǎn)突變以作研究 5 端標(biāo)記放射性元素或非放射性物質(zhì) 如生物素 地高辛等 10 引物的內(nèi)部穩(wěn)定性 過去認(rèn)為 引物3 端應(yīng)牢牢結(jié)合在模板上才能有效地進(jìn)行延伸 故3 端最好為G或C 現(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為 引物的5 端應(yīng)是相對(duì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu) 而3 端在堿基配對(duì)的情況下最好為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu) 即3 端盡可能選用A或T 少用G或C 僅僅3 端幾個(gè)堿基與非特異位點(diǎn)上的堿基形成的低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)是難以有效引發(fā)引物延伸的 如果3 端為富含G C的結(jié)構(gòu) 只需3 端幾個(gè)堿基與模板互補(bǔ)結(jié)合 就可能引發(fā)延伸 造成假引發(fā) 11 引物的保守性與特異性 保守性 通用引物 檢測(cè)同一類病原微生物盡可能多的型別特異性 避免非特異性擴(kuò)增 12 擴(kuò)增區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu) 模板DNA的某些區(qū)域具有高度復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu) 在選擇引物時(shí) 應(yīng)使擴(kuò)增區(qū)域盡可能避開這些區(qū)域 擴(kuò)增區(qū)域的自由能 G 小于58 61kJ mol引物Tm值與PCR產(chǎn)物Tm值相差一般不超過30 Tmproduct 81 5 16 6log K 1 0 7 K 0 41 G C 500 lengt 13 引物與PCR 引物濃度 一般為0 1 0 5umol L引物濃度 uM nOD 33 A 312 C 288 G 328 T 303 61 VH2OVH2O 單位 L 退火溫度最適退火溫度 TaOpt 0 3 Tmofprimer 0 7 Tmofproduct 25一般采用較引物Tm值低5 作為PCR退火溫度 14 引物設(shè)計(jì)軟件 PrimerPremier5 0生物軟件網(wǎng)下載安裝后 用文本編輯器打開WIN INI 將vspace DU改為vspace PU便可以使用全部功能 Oligoprimer3ThePrimerGeneratorNetPrimer 15 如何使用PrimerPremier5 0 引物設(shè)計(jì)一般引物設(shè)計(jì)5 帶酶切位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)巢式PCR引物設(shè)計(jì)多重PCR引物設(shè)計(jì)探針設(shè)計(jì)引物評(píng)析 16 引物同源性分析 用Blastn軟