血凝及血凝抑制實(shí)驗(yàn).ppt

實(shí)驗(yàn)二血凝及血凝抑制實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?血凝試驗(yàn) 滴定病毒的血凝效價(jià) 病毒的凝集價(jià) 采用一定的病毒量 通常采用4個(gè)血凝單位 血凝抑制試驗(yàn) 應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)病毒液測(cè)定血清中的相應(yīng)抗體或應(yīng)用特異性抗體鑒定新分離的血凝性病毒 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)用雞群有無(wú)病毒感染和監(jiān)測(cè)雞的免疫狀態(tài) 掌握基本操作技術(shù) 了解其實(shí)用價(jià)值 實(shí)驗(yàn)原理 流感病毒結(jié)構(gòu)模式圖 刺突 亞型特異性抗原 易變異 血凝素 HA 從H1 H15 呈柱狀功能 吸附細(xì)胞 與細(xì)胞上受體結(jié)合 使病毒侵入細(xì)胞 凝集多種動(dòng)物的紅細(xì)胞 血凝試驗(yàn) 具抗原性 其抗體能中和病毒 中和抗體抑制血凝 血凝抑制試驗(yàn) 血凝試驗(yàn)原理 血凝素 hemagglutininHA 由病毒基因編碼的糖蛋白刺突 與病毒吸附和傳入宿主細(xì)胞有關(guān) HA能與人或其它動(dòng)物多種紅細(xì)胞表面N 乙酰神經(jīng)氨酸酶受體結(jié)合引起紅細(xì)胞凝集 為病毒的紅細(xì)胞凝集反應(yīng)或血凝反應(yīng) 血凝原理 血凝抑制原理 血凝抑制試驗(yàn)原理病毒引起的血凝現(xiàn)象能被相應(yīng)的抗血凝素抗體所抑制 即抗體與病毒結(jié)合后 血凝素?zé)o法吸附于紅細(xì)胞表面的受體上 用免疫血清阻止紅細(xì)胞凝集的現(xiàn)象 稱為血凝抑制 實(shí)驗(yàn)材料器材 U型或V型微量反應(yīng)板 微量移液器 槍頭試劑 1 雞紅細(xì)胞 NDIV血凝素 NDIV抗血清 生理鹽水 實(shí)驗(yàn)步驟1 取96孔V型反應(yīng)板1塊置于水平實(shí)驗(yàn)臺(tái)上 在第1排1 10孔內(nèi)加入25ul生理鹽水 第11孔不加 第12孔加25ul生理鹽水2 在第1孔內(nèi)加入血凝素25ul 混勻后吸出25ul加入第2孔內(nèi) 再混勻后吸出25ul加入第3孔內(nèi) 依次類推至第10孔時(shí)棄掉25ul 第12孔不加作陰性對(duì)照孔 3 在1 12孔均加入25ul的生理鹽水 4 在每孔內(nèi)加入25ul1 的雞紅細(xì)胞懸液 震蕩 室溫靜止感作15 30min 每5min觀察一次結(jié)果 5 計(jì)算血凝效價(jià) 稀釋使成為四價(jià)備用 血凝試驗(yàn)結(jié)果判定 效價(jià)判定 凝集特別顯著 凝集現(xiàn)象次之 凝集清楚可見 稍顯凝集者 血凝效價(jià) 呈 凝集時(shí)的最高稀釋度 此時(shí)的稀釋度即為1個(gè)血凝單位 結(jié)果判定1 在各組對(duì)照均正確的情況下 按下列標(biāo)準(zhǔn)判定血凝反應(yīng)強(qiáng)度示意圖 4 紅細(xì)胞呈片狀凝集 均勻布滿孔底 邊緣有時(shí)不整齊或皺縮 3 紅細(xì)胞呈片狀凝集 但面積略小于 4 2 紅細(xì)胞呈片狀凝集 但有少許沉積孔底中部呈小圓點(diǎn)狀 紅細(xì)胞大部分沉于孔底中央 周圍有少量散在凝集顆粒 紅細(xì)胞均沉于孔底呈小圓點(diǎn)狀 邊緣整齊 2 對(duì)照孔正常的情況下 紅細(xì)胞凝集100 的稀釋度為判定血凝價(jià)的終點(diǎn) 凡能使雞紅細(xì)胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)為病毒的凝集價(jià) 血凝抑制1 取96孔V型反應(yīng)板1塊置于水平實(shí)驗(yàn)臺(tái)上 在第1排1 10孔內(nèi)加入25ul生理鹽水 第11孔不加 第12孔加25ul生理鹽水 2 在第1孔內(nèi)加入被檢血清25ul 混勻后吸出25ul加入第2孔內(nèi) 再混勻后吸出25ul加入第3孔內(nèi) 依次類推至第10孔時(shí)棄掉25ul 第12孔不加作陰性對(duì)照孔 3 在1 12孔內(nèi)均加入 四價(jià) 血凝素25ul 震蕩后 室溫靜止作用5min 4 在1 12孔內(nèi)均加入1 的雞紅細(xì)胞懸液25ul 震蕩 室溫感作15 30min 每5min觀察一次結(jié)果 5 觀測(cè)結(jié)果 記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果判定 測(cè)定孔R(shí)BC沉于孔底中心 呈紐扣狀 凝集 病毒對(duì)照孔 凝集RBC對(duì)照孔 無(wú)自凝血凝抑制試驗(yàn)效價(jià) 呈完全血凝抑制使的最高血清稀釋度 思考題1 病毒凝集紅細(xì)胞是不是一種特異的抗原體反應(yīng) 為什么 2 血凝抑制實(shí)驗(yàn)是不是特異的抗原抗體反應(yīng) 為什么 3 血凝試驗(yàn)中為什么要加補(bǔ)充液 4 為什么加病