兒童患者中檢出產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的耐藥性和基因分型.doc

兒童患者中檢出產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的耐藥性和基因分型【摘要】目的了解本地區(qū)兒童患者臨床分離的產(chǎn)超廣譜-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌的耐藥基因型別和耐藥性的變化情況。方法收集自兒童患者分離鑒定的大腸埃希菌株1 327株，通過K-B法作藥敏試驗,采用美國NCCLS1999年推薦的抑制劑增強(qiáng)紙片法確認(rèn)產(chǎn)ESBLs株，并對ESBLs進(jìn)行初步基因分型。結(jié)果檢出產(chǎn)ESBLs菌株702株，檢出率為52.9%，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對青霉素類、氨曲南及頭孢菌素類抗生素耐藥率為55.5%95.0%；PCR初步分型結(jié)果,單獨(dú)攜帶TEM型基因的占56.7%，單獨(dú)攜帶SHV型基因的占15.0%，攜帶兩種基因的占25.8%。結(jié)論產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌檢出率逐年上升，具有多重耐藥的特點；產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌主要攜帶TEM型和SHV型-內(nèi)酰胺酶基因，其中絕大部分產(chǎn)TEM型-內(nèi)酰胺酶。 【關(guān)鍵詞】 超廣譜-內(nèi)酰胺酶(ESBLs) 大腸埃希菌 耐藥性 基因分型Analysis of drug resistance and gen typing of ESBLs-producing Escherichia coli isolated from infants.SHI Sheng, XIONG Yan.(Department of Clinical Laboratory, Jiangmen Municipal People’s Hospital, Jiangmen 529000, Guangdong, P.R.China) Abstract：Objective To investigate current resistant status and genetype of ESBLs-producing Escherichia coli in child patients. Methods There were 1 327 Escherichia coli strains isolated in clinic, and the ESBLs-producing isolates were identified by K-B method. The DNA of ESBLs-producing Escherichia coli were genetyped by polymerase chain reaction (PCR). Results There were 702 ESBLs-producing isolates with a positive rate of 52.9%. The resistant rates of ESBLs-producing Escherichia coli isolates to penicillins,aztreonam and the third generation cephalosporins were from 55.5% to 100%. The results of PCR showed that the rates of TEM type, SHV type and TEM with SHV type in ESBLs-producing Escherichia coli isolates were 56.7%,15.0% and 25.8%, respectively. Conclusion The incidence of ESBLs-producing Escherichia coli isolates was increased year by year, and they were multi-resistant. Most of the ESBLs-producing Escherichia coli isolates carry TEM related genes or/and SHV related genes, and the TEM related genes were the most. Key words：Extended spectrumβ-lactamases( ESBLs); Escherichia coli; Resistance; Gene typing大腸埃希菌是臨床常見的病原菌，也是醫(yī)院感染的常見細(xì)菌之一。近年來，隨著第三代頭孢菌素的廣泛使用，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（Extended spectrumβ-lactamases, ESBLs）大腸埃希菌感染日益增多。ESBLs由質(zhì)粒介導(dǎo)，易在同種屬甚至不同種屬細(xì)菌間傳遞造成暴發(fā)流行，給臨床治療帶來許多困難。兒童患者由于免疫機(jī)能還不健全，抵抗力較低，是產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的易感人群。為了解兒童患者中檢出的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的耐藥情況和基因型，以便采取有效措施加以控制，我們對2004年1月2006年12月間從兒童患者臨床分離的大腸埃希菌進(jìn)行了耐藥性和基因型檢測分析，現(xiàn)報告如下。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 菌株 收集本醫(yī)院2004年1月2006年12月自兒童患者臨床分離鑒定的1 327株大腸埃希菌。選擇其中120株ESBLs陽性菌株進(jìn)行初步基因分型。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。1.1.2 藥敏紙片 包括頭孢他啶等頭孢菌素類藥物和亞胺培南、氨曲南、慶大霉素、復(fù)方新諾明等共17種，均來源于英國Oxoid公司產(chǎn)品。1.1.3 主要試劑 API鑒定系統(tǒng)（法國Bio-Merieux公司）、TriPure Isolation Regent(Roche公司)、dNTP、Taq酶（Sigma公司）。1.1.4 主要儀器 Biofuge 22R型高速低溫離心機(jī)、PTC-100PCR儀、DYY-2C型電泳儀、GDS-8000凝膠成像分析儀。1.2 方法1.2.1 ESBLs檢測 采用美國NCCLS1999年推薦的抑制劑增強(qiáng)紙片法(表型確認(rèn)試驗)進(jìn)行和判定結(jié)果。1.2.2 ESBLs陽性菌株的藥敏試驗 采用K-B紙片法。取單個菌落配制成0.5號麥?zhǔn)瞎軡舛鹊木?，將配好的菌液均勻涂布于M-H瓊脂培養(yǎng)基上，并貼上藥敏紙片，在36.5下孵育1824h，測量各紙片抑菌圈直徑。1.2.3 產(chǎn)ESBLs菌株基因分型 利用TriPure提取ESBLs陽性菌的DNA，-20保存。采用PCR對ESBLs進(jìn)行基因分型，其中擴(kuò)增引物：TEM-f：5’-CCGTGTCGCCCTTATTCC-3’，TEM-r：5’-AGGCACCTATCTCAGCGA-3’；SHV-f：5’-ATTTGTCGCTTCTTTACTCGC-3’，SHV-r：5’-TTTATGGCGTTACCTTTGACC-3’。50μl PCR反應(yīng)體系為：DNA 100ng、25mmolL MgCl2、0.44mmolL dNTP、0.4pmolL引物和2.5U Taq酶。擴(kuò)增條件為94 30s、55 30s、72 30s，35個循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物在含2EB瓊脂糖凝膠中電泳，在紫外燈下觀察結(jié)果。2 結(jié)果2.1 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的檢出率 1 327株大腸埃希菌中檢出ESBLs陽性702株，檢出率為52.9%。20042006年每年的檢出率分別為47.9%、52.0%、58.8%。2.2 產(chǎn)酶菌株ESBLs基因PCR檢測結(jié)果 PCR檢測120株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌株中，68株(56.7)攜帶TEM型ESBLs基因，18株(15.0)攜帶SHV型ESBLs，31株(25.8)同時攜帶以上2種ESBLs基因。另外有3株（2.5%）未知基因型(沒有檢測出)。2.3 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥情況 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對青霉素類、氨曲南及頭孢菌素類抗生素耐藥率高達(dá)55.5%95.0%，具有多重耐藥特點,詳見表1。表1 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對常用抗生素的耐藥率（略）3 討論 近年來，隨著第三代頭孢菌素的廣泛使用，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌感染日益增多。ESBLs是β-內(nèi)酰胺酶基因(主要為SHV、TEM)發(fā)生突變導(dǎo)致氨基酸的改變而形成的，由于ESBLs可由質(zhì)粒攜帶，通過結(jié)合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等形式使耐藥基因在細(xì)菌中傳遞擴(kuò)散，從而造成醫(yī)院內(nèi)的交叉感染和院外耐藥基因的擴(kuò)散。由產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌引起的院內(nèi)感染爆發(fā)流行在國外均有報道13。兒童患者由于免疫器官發(fā)育還不健全，抵抗力較低，極易引起感染，感染后又常接受三代頭孢菌素的治療。多種因素使得兒童患者易感染產(chǎn)ESBLs菌。本結(jié)果產(chǎn)ESBLs株在檢出的大腸埃希菌中的檢出率高達(dá)52.9 ，與文獻(xiàn)報道相近4,5。 檢出的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對大多數(shù)抗生素耐藥率較高，且多重耐藥現(xiàn)象較為嚴(yán)重,尤其是對第三代頭孢耐藥率較高。但從各年的耐藥率看大多數(shù)有逐年下降的趨勢，這可能與近年來臨床醫(yī)生越來越規(guī)范用藥有關(guān)。 本結(jié)果檢出產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌主要攜帶TEM型和SHV型基因，其中以TEM型為主,與國內(nèi)大多數(shù)地區(qū)的報道基本一致，但所占比率略有差別6,與國外有關(guān)報道不盡相同7。今后我們尚需繼續(xù)關(guān)注產(chǎn)ESBLs株的耐藥性及基因型的變化,為臨床提供參考?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Johann D. D. Pitout, Patrice Nordmann, et al. Emergence of Enterobacteriaceae producing extended-spectrum -lactamases (ESBLs) in the communityJ. J. Antimicrob. Chemother.,2005, 56:5259.2 Joseph Gangou-Piboji, Branka Bedenic, et al. Extended-Spectrum-Lactamase-Producing Enterobacteriaceae in Yaounde, CameroonJ. J. Clin. Microbiol., 2005,43:32733277.3 Nicola A. C. Potz, Russell Hope, Marina Warner,et al. Prevalence and mechanisms of cephalosporin resistance in Enterobacteriaceae in London and South-East EnglandJ. J. Antimicrob. Chemother., 2006, 58: 320326.4 Ellen S. Moland, Nancy D. Hanson, Jennifer A. Black, et al. Prevalence of Newer -Lactamases in Gram-Negative Clinical Isolates Collected in the United States from 2001 to 2002J. J. Clin. Microbiol., 2006, 44: 33183324.5 Jess Oteo, Carmen Navarro, Emilia Cercenado, et al. Spread of Escherichia coli Strains with High-Level Cefotaxime and Ceftazidime Resistance between the Community, Long-Term Care Facilities, and Hospital InstitutionsJ. J. Clin. Microbiol., 2006, 44: 23592366.6 張曉兵，府偉靈，廖揚(yáng)，等臨床產(chǎn)ESBLs細(xì)菌的耐藥特征和基因分型的研究J中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2005,15(4):386389.7 Ma