葉綠素?zé)晒夥治龇椒?doc

葉綠素?zé)晒夥治龇椒ㄈ~綠素?zé)晒夥治鼍哂杏^測手續(xù)簡便,獲得結(jié)果迅速,反應(yīng)靈敏,可以定量,對植物無破壞、少干擾的特點(diǎn)。它既可以用于葉綠體、葉片,也可以遙感用于群體、群落。它既是室內(nèi)光合基礎(chǔ)研究的先進(jìn)工具,也是室外自然條件下診斷植物體內(nèi)光合機(jī)構(gòu)運(yùn)轉(zhuǎn)狀況、分析植物對逆境響應(yīng)機(jī)理的重要方法。現(xiàn)在人們可以通過葉綠素?zé)晒夥治龉烙?jì)量子效率、光合能力,利用熒光參數(shù)計(jì)算光合電子傳遞速率、胞間CO2濃度,并且試圖利用熒光參數(shù)快速篩選遺傳變異的植物。有人甚至預(yù)言,將來熒光分析可能會(huì)代替氣體交換測定。20世紀(jì)80年代以來,調(diào)制熒光儀,特別是便攜式熒光儀的商品化,使熒光分析在光合作用研究中得到這樣廣泛的應(yīng)用,以至如果不懂熒光分析技術(shù),便很難看懂近年的光合作用研究文獻(xiàn)。1.基本原理光合機(jī)構(gòu)吸收的光能有三個(gè)可能的去向：一是用于推動(dòng)光化學(xué)反應(yīng),引起反應(yīng)中心的電荷分離及后來的電子傳遞和光合磷酸化,形成用于固定、還原二氧化碳的同化力(ATP和NADPH)；二是轉(zhuǎn)變成熱散失；三是以熒光的形式發(fā)射出來。由于這三者之間存在此消彼長的相互競爭關(guān)系,所以可以通過熒光的變化探測光合作用的變化(圖4-1)。實(shí)際上,以熒光形式發(fā)射出來的光能在數(shù)量上是很少的,還不到吸收的總光能的3%。在很弱的光下,光合機(jī)構(gòu)吸收的光能大約97%被用于光化學(xué)反應(yīng),2.5%被轉(zhuǎn)變成熱散失,0.5%被變成紅色(在體內(nèi),葉綠京的熒光發(fā)射峰在685nm左右)的熒光發(fā)射出來；在很強(qiáng)的光下,當(dāng)全部PSII反應(yīng)中心關(guān)閉時(shí),吸收的光能95%97%被變成熱,而2.5%5.0%被變成熒光發(fā)射l。在體內(nèi),由于吸收的光能多被用于光合作用,葉綠素a熒光的量子產(chǎn)額(即量子效率)僅僅為0.030.06。但是,在體外,由于吸收的光能不能圖4-1葉綠素分子的光激發(fā)被用于光合作用,這一產(chǎn)額增加到0.250.302。在室溫條件下,絕大部分熒光來自PS II天線1,3,而不是反應(yīng)中心的葉綠素a分子4,5。這是因?yàn)榉磻?yīng)中心的葉綠素分子僅占葉綠素總量的幾百分之一。葉綠素?zé)晒獍l(fā)射的高峰在685nm(天線色素)和695nm(反應(yīng)中心)。在體內(nèi),決定熒光產(chǎn)額的主要因素是電子的第一個(gè)穩(wěn)定的醌受體QA的氧化還原狀態(tài)。實(shí)際上,在暗適應(yīng)的健康葉片和良好的葉綠體,所有的QA都處于還原態(tài)時(shí)的最大熒光產(chǎn)額與所有的QA都處于氧化態(tài)時(shí)的最小熒光產(chǎn)額之比大致為566。然而,這個(gè)比值可以發(fā)生很大變化,取決于照光狀態(tài)和一些處理。多種因素影響熒光強(qiáng)度：激發(fā)光強(qiáng),反應(yīng)中心對激發(fā)能的捕獲和轉(zhuǎn)化速率,激發(fā)能以熱的形式耗散的程度和兩個(gè)光系統(tǒng)間能量的分配等。當(dāng)PS II的光化學(xué)反應(yīng)被阻止時(shí),最大熒光產(chǎn)額的減少是反應(yīng)中心和天線熱耗散增加的反映。由于可以測定完整葉片的熒光,葉綠素a熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)可以成為原位檢測PS II重要步驟的極好的探針5。1.1 葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)當(dāng)一片經(jīng)過充分暗適應(yīng)的葉片從黑暗中轉(zhuǎn)入光下后,葉片的熒光產(chǎn)額會(huì)隨時(shí)間發(fā)生規(guī)律性的變化,即kautsky效應(yīng)7,記錄下來的典型熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線上幾個(gè)特征性的點(diǎn)分別被命名為O、J、D、P、S、M和T8.9(圖4-2)。在照光的第一秒鐘內(nèi),熒光水平從O上升到P,這一段被稱為快相;在接下來的幾分鐘內(nèi),熒光水平從P下降到T,這一段被稱為慢相?？煜嗯cPS II的原初過程有關(guān),慢相則主要與類囊體膜上和間質(zhì)中的一些反應(yīng)過程包括碳代謝之間的相互作用有關(guān)。圖4-2 葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線熒光水平從O到I的上升已經(jīng)被歸因于不能將電子傳遞到PQ庫的失活的PS II中心10,這些中心具有有功能的水氧化系統(tǒng),但是對凈電子傳遞沒有明顯的貢獻(xiàn)。在飽和光下,當(dāng)反應(yīng)中心的電荷分離速率超過從QA到QB的電子傳遞速率時(shí),I水平大大提高11。從D到P的熒光增加是由于Fd-NADP氧化還原酶以前電子傳遞鏈中電子受體的還原4。熒光水平從FO到FP(當(dāng)光強(qiáng)不足以使全部PS II反應(yīng)中心關(guān)閉時(shí))的上升受多種因素的影響:PS II的協(xié)作性;PS II的異質(zhì)性;PQ庫的大小及其重新氧化的速率;PS II以外的電子傳遞速率,包括碳同化;向P680+供給電子的速率。熒光水平到達(dá)Fm表明QA已經(jīng)完全還原12。結(jié)合在D1蛋白上QB部位的DCMU能夠阻斷QA向PQ的電子傳遞,所以在這種抑制劑存在時(shí)比沒有它時(shí)從F。到Fm的熒光水平上升快得多。從F。上升到Fm所需要的時(shí)間的一半(T1/2)是估計(jì)PQ庫大小的一個(gè)簡單的指標(biāo)。與陽生葉相比,陰生葉具有大的葉綠素天線和小的PQ庫,因此表現(xiàn)出一個(gè)短的T1/213。葉齡從幼變老,P、M、T的水平降低,幼葉和老葉無M峰。M峰的出現(xiàn)意味著光合誘導(dǎo)期的結(jié)束,快速碳同化的開始。當(dāng)光合作用受到突然干擾(高光強(qiáng)、高CO2、磷缺乏等)時(shí)熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線會(huì)出現(xiàn)波動(dòng)。這時(shí),用葉圓片氧電極同時(shí)記錄下來的光合氧釋放和熒光兩條動(dòng)力學(xué)曲線大體上呈鏡像對稱,但是有一點(diǎn)相位差。這種波動(dòng)現(xiàn)象可能反映了條件急劇變化后同化力的產(chǎn)生與使用之間的不平衡以及為達(dá)到平衡而發(fā)生的快速調(diào)節(jié)過程。但是,在遭受環(huán)境脅迫的葉片看不到這樣的波動(dòng)14,可能是由于脅迫削弱了光合機(jī)構(gòu)的同化力生產(chǎn)和調(diào)節(jié)能力的緣故。1.2 低溫?zé)晒?77K)人們通常在植物正常生長的生理溫度(文獻(xiàn)中常稱之為室溫)下測定葉綠素?zé)晒狻５?有時(shí)為了某種研究的需要,也在液氮(即77K,-196)溫度下進(jìn)行觀測。在這樣的低溫下,任何與溫度有關(guān)的酶反應(yīng)和電子傳遞能力對熒光水平的影響都被避免,因此只有原初光化學(xué)反應(yīng)的變化被反映出來10,12。77K熒光是測定PS II光化學(xué)效率(Fv/Fm)的一個(gè)重要工具,多種維管束植物健康而未遭受環(huán)境脅迫的葉片的Fv/Fm值為0.8320.00415。77K熒光也常被用于研究兩個(gè)光系統(tǒng)之間的能量分配,因?yàn)樵谶@樣的低溫下,PS II和PS I分別在695nm和735nm處(高等植物)有各自的熒光發(fā)射峰6。PS I在735nm處的熒光增加往往是PS II向PS I增加激發(fā)能分配的結(jié)果(見第15章)。與室溫?zé)晒獠煌?在77K下,天線和核心復(fù)合體不同組分之間激發(fā)能的快速平衡是不可能的。因此,在關(guān)于天線和反應(yīng)中心組織結(jié)構(gòu)的研究中,77K熒光光譜分析具有重要的用途。1.3 調(diào)制熒光在用于葉綠素?zé)晒鉁y定和猝滅分析儀器上的一個(gè)革命性進(jìn)展,就是使用調(diào)制光于測定系統(tǒng)中16。在這樣的系統(tǒng)中,用于測定熒光的光源被調(diào)制,也就是使用以很高頻率不斷開關(guān)的光源。并且,在這樣的系統(tǒng)中,使用的檢測器通過選擇性放大僅僅檢測被這種調(diào)制光激發(fā)的熒光。因此,利用這樣的系統(tǒng),不僅可以大大提高信號(hào)/噪聲的比例,而且還可以在背景光,特別是在田間很強(qiáng)的太陽光存在的情況下測定相對的熒光產(chǎn)額。Schreiber(1986)17及其同事(1986)18研制的PAM熒光儀(德國Walz公司制造)就是這樣的調(diào)制式熒光測定系統(tǒng),用它可以測定Fo、Fo、Fm、Fm、Fs,計(jì)算Fv/Fm、(Fm-Fs)/Fm、NPQ、qp和qN等。1.4 熒光猝滅熒光猝滅就是熒光產(chǎn)額降低。一切使熒光產(chǎn)額低于其最大值的過程,都被稱為熒光猝滅過程。對于不同熒光猝滅組分的分辨,能夠提供關(guān)于光合機(jī)構(gòu)功能狀態(tài)的重要資料。熒光猝滅可分兩類:光化學(xué)猝滅,即由光化學(xué)反應(yīng)引起的熒光產(chǎn)額的降低,它有賴于氧化態(tài)QA的存在。非光化學(xué)猝滅,即由非光化學(xué)過程例如熱耗散過程引起的熒光產(chǎn)額的降低。它是植物體內(nèi)光合量子效率調(diào)節(jié)的一個(gè)重要方面19。非光化學(xué)猝滅涉及三個(gè)不同的機(jī)理20:qE依賴類囊體膜內(nèi)外的質(zhì)子濃度差,暗弛豫的半時(shí)間t1/21min,快相。QT依賴狀態(tài)1向狀態(tài)2的轉(zhuǎn)換,PS II的捕光復(fù)合體磷酸化,脫離PS II,從類囊體的基粒區(qū)遷移到間質(zhì)片層區(qū),從而減少激發(fā)能向PS II的分配,增加激發(fā)能向PS I的分配,t1/2=8min,中間相。它比qE和qI小得多,強(qiáng)光下qE和qI增加,而qT受抑制。QI與光合作用的光抑制有關(guān),它常表現(xiàn)為可變熒光與最大熒光比值的降低,t1/2=40min,慢相。關(guān)于這后一種非光化學(xué)猝滅,有三種假說。假說一：這種非光化學(xué)熒光猝滅起源于PS II的反應(yīng)中心,部分PS II中心發(fā)生變化,雖然還能捕捉激發(fā)能,但不能進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng),而把能量變成熱。假說二：這種非光化學(xué)熒光猝滅起源于PS II的天線色素,它通過非輻射能量耗散消耗激發(fā)能,與葉黃素循環(huán)過程中生成的玉米黃素有關(guān)。假說三:這種非光化學(xué)熒光猝滅與D1蛋白(曾用名QB蛋白)的失活和降解有關(guān)。2 熒光參數(shù)關(guān)于各種熒光參數(shù)的命名和定義,在不同時(shí)期和不同作者的文章中很不一致。對于Fo、Fi、Fp、Fs、Fm、Fm、Fo、Fv和Fv,這里采用的基本上是van kooten和Snel(1990)19統(tǒng)一的命名。2.1 基礎(chǔ)參數(shù)Fo有多種名稱,最小(minimal)、基底(ground)、暗(dark)、初始(initial)和不變(un-changed,constant)熒光強(qiáng)度等。它是已經(jīng)暗適應(yīng)的光合機(jī)構(gòu)全部PS II中心都開放時(shí)的熒光強(qiáng)度,qp=1,qN=0。絕大部分學(xué)者都認(rèn)為,Fo熒光來自天線葉綠素(Chl)a12。Fi熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線O-I-D-F-T中I水平的熒光強(qiáng)度。Fp熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線O-I-D-P-T中P水平的熒光強(qiáng)度。Fs熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線O-I-D-P-T中T水平的熒光強(qiáng)度。Fm黑暗中最大(maximum)熒光,它是已經(jīng)暗適應(yīng)的光合機(jī)構(gòu)全部PS II中心都關(guān)閉時(shí)的熒光強(qiáng)度,qp=0。這時(shí)所有的非光化學(xué)過程都最小,qN=0,這是標(biāo)準(zhǔn)的(classical)最大熒光。Fm光下最大熒光,在光適應(yīng)狀態(tài)下全部PS II中心都關(guān)閉時(shí)的熒光強(qiáng)度,qp=0,qNO。Fm受非光化學(xué)猝滅的影響,而不受光化學(xué)猝滅的影響4。Fo光下最小熒光,在光適應(yīng)狀態(tài)下全部PSII中心都開放時(shí)的熒光強(qiáng)度,qp=1,qN0。為了使照光后所有的PSII中心都迅速開放,一般在照光后和測定前應(yīng)用一束遠(yuǎn)紅光(波長大于680nm,幾秒鐘)。Fv黑暗中最大可變(variable)熒光強(qiáng)度,Fv=Fm-Fo。Fv光下最大可變熒光強(qiáng)度, Fv=Fm-Fo。2.2 表明PSII光化學(xué)效率的參數(shù)Fv/Fm沒有遭受環(huán)境脅迫并經(jīng)過充分暗適應(yīng)的植物葉片PSII最大的或潛在的量子效率指標(biāo),它是比較恒定的,一般在0.800.85之間。有時(shí),Fv/Fm也被稱為開放的PSII反應(yīng)中心的能量捕捉效率1。Fv/Fo是Fv/Fm的另一種表達(dá)方式12,Fv/Fo=(Fv/Fm)/(1-Fv/Fm)。盡管Fv/Fo不是一個(gè)直接的效率指標(biāo),但是它對效率的變化很敏感。因?yàn)橐恍┨幚硪鸬腇v/Fo變化的幅度比Fv/Fm變化的幅度大得多,所以Fv/Fo在一些情況下是表達(dá)資料的好形式。此外,Fm/Fo也是Fv/Fm的另一種表達(dá)方式,因?yàn)镕m/Fo=(Fv+Fo)/Fo=Fv/Fo+1。當(dāng)Fv/Fm為0.860.90時(shí),Fm/Fo則相應(yīng)地為7106。(Fm-Fs)/Fm作用光存在時(shí)PSII的實(shí)際的量子效率,即PSII反應(yīng)中心電荷分離的實(shí)際的量子效率6。這里,Fs是穩(wěn)態(tài)熒光水平,Fm是在作用光存在時(shí)一個(gè)飽和光脈沖激發(fā)的熒光水平。計(jì)算這個(gè)參數(shù)不需要準(zhǔn)確測定Fo,因此它不受Fo變化的影響21。PSII實(shí)際的電子傳遞的量子效率這個(gè)參數(shù)PSII=(Fm-Fs)/Fm不僅與碳同化有關(guān),也與光呼吸及依賴O2的電子流有關(guān)22。由于它是PSII光化學(xué)反應(yīng)的量子效率,所以可以利用它計(jì)算非循環(huán)電子傳遞速率(J)以及體內(nèi)的總光合電子傳遞能力22,23:J=PSIIPFDa0.5這里,PFDa是被吸收的光通量密度(molm-2s-1),0.5代表光能在兩個(gè)光系統(tǒng)間的分配系數(shù)。如果假設(shè)入射到葉片表面的光能平均有84%被葉片吸收,并且平均分配給兩個(gè)光系統(tǒng),則上式可以寫成6:J=PSIIPFD0.42。Fv/Fm開放的PSII反應(yīng)中心的激發(fā)能捕獲效率24。由它可以計(jì)算某PFD下量子效率的相對限制或光合功能的相對限制L(PFD)22:qp和Fv/Fm的降低。只有當(dāng)qp=1和Fv/Fm=0.83時(shí),L(PFD)=0,即不存在限制。DemEnig-Adams等(1996)提出25,使用Fv/Fm來估計(jì)光合機(jī)構(gòu)吸收的光能被用于光化學(xué)反應(yīng)和天線熱耗散的相對份額,兩者分別為:前者P=Fv/Fmqp,后者D=1-Fv/Fm。熱耗散的速率為:(1-Fv/Fm)PFD。有證據(jù)表明,在自然生境中,陸生植物Fv/Fm的日變化一般是由PS II天線復(fù)合體熱耗散水平的變化引起的。這和Fv/Fm的變化與NPQ的變化成比例的結(jié)果相一致25。我們在一個(gè)葉綠素缺乏的大麥突變體觀察到,突變體光系統(tǒng)II光化學(xué)效率(Fv/Fm)比其野生型高,并提出其可能的原因是光系統(tǒng)II向光系統(tǒng)I傳遞的激發(fā)能少26,27。2.3 熒光猝滅參數(shù)qp=(Fm-Fs)/(Fm-Fo),光化學(xué)猝滅系數(shù)21。這里,(Fm-Fs)代表光化學(xué)猝滅的熒光。qp是表示總PSII反應(yīng)中心中開放的反應(yīng)中心所占比例的指標(biāo),而1-qp則是關(guān)閉的反應(yīng)中心所占比例,反映QA的還原程度,有時(shí)被稱為PSII的激發(fā)壓(excitation pressure)28。因?yàn)檠趸瘧B(tài)的QA是PSII電子傳遞的原初醌受體,它決定PSII的激發(fā)能捕獲速率,所以光化學(xué)猝滅也被稱為Q猝滅。qp和Fv/Fm、PSII之間有如下關(guān)系23:Fv/Fm=PSII/qp。qN=1-(Fm-Fo)/(Fm-Fo)=1-Fv/Fv。實(shí)際上,qN是一個(gè)定量非光化學(xué)猝滅的舊術(shù)語,它的計(jì)算以測定Fo和Fo為前提,而Fo和Fo的測定不準(zhǔn)確會(huì)造成計(jì)算結(jié)果的偏差。NPQ=(Fm-Fm)/Fm=Fm/Fm-1。這里(Fm-Fm)代表非光化學(xué)猝滅的熒光6,22,23,29。NPQ的變化反映熱耗散的變化。這個(gè)計(jì)算不需要測定Fo和Fo,但是必須測定一個(gè)充分暗適應(yīng)葉片的參比值Fm,最好是經(jīng)過一個(gè)夜晚暗適應(yīng)的黎明時(shí)刻的Fm值,這時(shí)光化學(xué)效率最大,而熱耗散最小。3 測定與分析3.1 光源熒光測定和猝滅分析需要幾種不同的光源:(1)檢測光綠光,光強(qiáng)PPFD小于10molm-2s-1,用于測Fo。(2)作用光通常用白光,用于推動(dòng)光合作用的光化學(xué)反應(yīng),光強(qiáng)可因?qū)嶒?yàn)?zāi)康牟煌兓?3)飽和脈沖光通常用自光,光強(qiáng)PPFD大于3000molm-2s-1,確保QA全部還原,用于測Fm和Fm。(4)弱遠(yuǎn)紅光(或暗)以便PSI推動(dòng)QA氧化,測Fo前使用。3.2 基本步驟在植物對各種環(huán)境脅迫響應(yīng)的分子機(jī)理研究中,為了獲得未遭受任何環(huán)境脅迫的對照葉片的基本熒光參數(shù),首先需要讓對照葉片經(jīng)過一個(gè)充分的暗適應(yīng)過程。最好是經(jīng)過一個(gè)黑暗的夜晚。首先,給一個(gè)經(jīng)過充分暗適應(yīng)的葉片照射檢測光,經(jīng)過一小段時(shí)間(12min)熒光水平穩(wěn)定后得到熒光參數(shù)Fo。接著,給一個(gè)飽和脈沖光,一個(gè)脈沖后關(guān)閉,得到熒光參數(shù)Fm,于是得到熒光參數(shù)Fv/Fm(Fv=Fm-Fo),即潛在的PS II的光化學(xué)效率。其次,打開可以引起葉片光合作用的作用光,一般PPFD為幾百molm-2s-1,可因植物生長條件或?qū)嶒?yàn)?zāi)康牟煌兓?幾分鐘到幾十分鐘后葉片光合作用達(dá)到穩(wěn)態(tài),得到熒光參數(shù)Fs(圖4-3)。這時(shí)再給飽和脈沖光一個(gè)脈沖后關(guān)閉,得到熒光參數(shù)Fm,于是可以計(jì)算作用光存在時(shí)PS II的實(shí)際的量子效率(Fm-Fs)/Fm和熒光的非光化學(xué)猝滅系數(shù)NPQ即(Fm-Fm)/Fm。再次,關(guān)閉作用光,立即打開遠(yuǎn)紅光,幾秒鐘后關(guān)閉,這時(shí)得到熒光參數(shù)Fo,于是可以計(jì)算熒光的光化學(xué)猝滅系數(shù)qp,即(Fm-Fs)/(Fm-Fo)。如果想?yún)^(qū)分非光化學(xué)猝滅的三個(gè)不同的組分,可以按Quick和Stitt(1989)20的方法進(jìn)行測定和計(jì)算。我們使用這項(xiàng)技術(shù)發(fā)現(xiàn),在小麥葉片發(fā)育期間這三個(gè)組分的相對貢獻(xiàn)發(fā)生規(guī)律性的變化:在剛剛完全展開的旗葉和開始衰老的旗葉qN是類似的。但是在晴天中午,前者中間組分明顯降低,而后者的中間組分保持較高水平,并且前者快組分明顯高于慢組分,而后者快組分則明顯低于慢組分。這些結(jié)果說明,保護(hù)光合機(jī)