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elisa試劑盒Elisa試驗(yàn)是一種敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法。由于其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果判斷較客觀等因素，已廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)檢驗(yàn)的各領(lǐng)域中。ELISA檢測(cè)試劑盒是用于體外定性檢測(cè)人血清或血漿中的抗人類戊型肝炎（HEV）病毒 IgM 抗體ELISA檢測(cè)。目 錄1elisa試劑盒簡(jiǎn)介2優(yōu)點(diǎn)3回收率4發(fā)展5使用方法6制備方法7影響8檢測(cè)原理9操作步驟10試劑器材elisa試劑盒簡(jiǎn)介ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。 ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。然而，影響Elisa試驗(yàn)結(jié)果的因素很多，故加強(qiáng)各個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量保證才能充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn)。2優(yōu)點(diǎn)一、高效、靈敏、特異的抗體；二、穩(wěn)定的重復(fù)性和可靠性；三、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相載體；四、適用血清、血漿、組織勻漿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、尿液等等多種標(biāo)本類型；五、節(jié)省實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)。3回收率elisa試劑盒回收率是反應(yīng)待測(cè)物在樣品分析過(guò)程中的損失的程度，損失越少，回收率越高，如果作標(biāo)液1PPM，就是1毫克/升，而作出標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)為0.99毫克/升，就是說(shuō)你的回收率是99%，這個(gè)與真實(shí)成分有密切的關(guān)系，說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度。比如水中總無(wú)機(jī)氯含量測(cè)定，樣品水中含有無(wú)機(jī)氯20mg/L，取100mL被測(cè)水樣品，加入0.1mL濃度為10mg/mL的含無(wú)機(jī)氯標(biāo)準(zhǔn)樣品，測(cè)定時(shí)忽略體積變化，如果測(cè)定出樣品中無(wú)機(jī)氯為2.98mg/L，則認(rèn)為回收率為99%。4發(fā)展臨床測(cè)定技術(shù)的發(fā)展主要在于方法學(xué)的發(fā)展，而方法學(xué)的發(fā)展依托于試劑生產(chǎn)技術(shù)不斷進(jìn)步更新和型標(biāo)記物的應(yīng)用。目前，分子生物學(xué)正在并最終肯定會(huì)讓我們對(duì)整個(gè)生命科學(xué)有一個(gè)全面而徹底的認(rèn)識(shí)，其對(duì)免疫測(cè)定技術(shù)發(fā)展的影響也是直接而又有效的，它使我們對(duì)以前一些難以檢測(cè)的生物活性物質(zhì)的測(cè)定變得輕而易舉，并且大大提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性。5使用方法1、 血清：操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000g離心10分鐘將血紅細(xì)胞迅速小心地分離。2、 血漿：EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測(cè)。1000g離心30分鐘去除顆粒。3、 細(xì)胞上清液：1000g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。4、 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000g離心10分鐘，取上清液。5、 保存：如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測(cè)前先離心或過(guò)濾。不要在37或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。6制備方法包括以下步驟：1)抗原表位的計(jì)算機(jī)篩選；2)抗原的制備；3)血清的采集；4)間接ELISA方法的建立；5)間接ELISA方法的敏感性和特異性驗(yàn)證；6)試劑盒的穩(wěn)定性驗(yàn)證；7)對(duì)屠宰場(chǎng)進(jìn)行臨床檢測(cè)。該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性合格、重復(fù)性好。應(yīng)用本發(fā)明制得的試劑盒能有效檢出感染豬的戊型肝炎病毒，適用于大批量發(fā)病樣本的檢測(cè)，可用于豬戊肝的快速診斷，并預(yù)防、控制豬戊肝病毒的流行和阻斷戊肝病毒由豬向人傳播。7影響免疫測(cè)定技術(shù)的基礎(chǔ)在于抗原抗體之間的特異結(jié)合反應(yīng)，所以任何優(yōu)質(zhì)的診斷試劑離不開優(yōu)質(zhì)的原料，如抗原抗體，酶等。以前用于免疫測(cè)定的抗原通常為各種純化抗原，而抗體則為純化抗原免疫動(dòng)物后獲得的多克隆抗體和使用雜交瘤技術(shù)得到的單克隆抗體，而抗原或抗體的標(biāo)記物如酶標(biāo)結(jié)合物則通過(guò)各種化學(xué)合成方法制備。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，使用基因工程方法制備各種特殊的抗原或抗體及其酶結(jié)合物等免疫測(cè)定試劑幾成為現(xiàn)實(shí)的新一代試劑，各種新型使用的測(cè)定方法也不斷出現(xiàn)。HBsAg試劑特點(diǎn)（檢測(cè)模式：臨床抗體夾心法）：包被抗體為山羊多抗。多抗具有高親和性和對(duì)抗原各種表位的反應(yīng)性。酶表抗體為與HBsAg有不同結(jié)合位點(diǎn)的鼠復(fù)合單位，可測(cè)得HBsAg變異樣品，提高檢測(cè)的特異性（99.98%）提高檢測(cè)的靈敏度，應(yīng)用Parl Ehrich 學(xué)說(shuō)（PEI）HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)ad標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度為0.05ng/ml對(duì)ay標(biāo)準(zhǔn)品靈敏度為0.025ng/ml8檢測(cè)原理ELISA檢測(cè)試劑盒應(yīng)用定性?shī)A心免疫檢測(cè)技術(shù)，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板條，這些多肽是中國(guó)型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很強(qiáng)的肽段，分別來(lái)自于該毒株的開放閱讀框2和開放閱讀框3。將樣品或標(biāo)準(zhǔn)品加入孔中并孵育，如果其中存在HEV IgM抗體，這些抗體就會(huì)與HEV 的多肽抗原結(jié)合，并固定在上面，洗板除去其它非特異性抗體和樣品中的其它成份。然后加入羊抗人IgM-HRP（辣根過(guò)氧化物酶）酶結(jié)合物，經(jīng)第二次孵育后，酶結(jié)合物就會(huì)與第一次孵育結(jié)合上的HEV IgM抗體相結(jié)合，洗板除去未結(jié)合的酶結(jié)合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育時(shí)會(huì)發(fā)生酶-底物反應(yīng)，只有那些含有HEV IgM抗體和酶結(jié)合物所形成的復(fù)合物的孔才會(huì)發(fā)生顏色變化，加入硫酸溶液終止酶和底物間的反應(yīng)，并在波長(zhǎng): 450nm處測(cè)量O.D.值,按照本HEV IgM抗體elisa試劑盒的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn), O.D.值大于或等于Cut-Off值的樣品被認(rèn)為是初試陽(yáng)性。9操作步驟方法一雙抗體夾心法1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為110g/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4 過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡(jiǎn)稱洗滌，下同）。2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37 孵育1小時(shí)。然后洗滌。（同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔）。3.加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37 孵育0.51小時(shí)，洗滌。4.加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37 1030分鐘。5.終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。6.結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。方法二間接法1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至110g/ml，每孔加0.1ml，4過(guò)夜；2.次日洗滌3次；3.加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37孵育1小時(shí),洗滌；4.（同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照）于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml；5.37孵育35-60分鐘，洗滌；6.最后一遍用DDW洗滌。其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。10試劑器材試劑（1）包被緩沖液（PH9.60.05M碳酸鹽緩沖液）:Na2CO3 1.59克NaHCO3 2.93克加蒸餾水至1000ml（2）洗滌緩沖液（PH7.4PBS）：0.15MKH2PO4 0.2克Na2HPO412H2O2.9克NaCl8.0克KCl0.2克Tween-200.05%0.5ml加蒸餾水至1000ml（3）稀釋液：牛血清白蛋白（BSA） 0.1克加洗滌緩沖液至100ml或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成510%使用。（4）終止液（3MH2SO4）：蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸（98%）21.7ml。（5）底物緩沖液（PH5.0磷酸棗檸檬酸）:0.2MNa2HPO4（28.4克/L）25.7ml0.1M檸檬酸（19.2克/L） 24.3ml加蒸餾水50ml。（6）TMB（四甲基聯(lián)苯胺）使用液:TMB（10mg/5ml無(wú)水乙醇）0.5ml底物緩沖液（PH5.5） 10ml0.75%H2O2 32l（7）ABTS使用液:ABTS0.5mg底物緩沖液（PH5.5） 1ml3%H2O2 2l（8）抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。（9）正常人血清和陽(yáng)性對(duì)照血清。器材（1）聚苯乙烯塑料板（簡(jiǎn)稱酶標(biāo)板）40孔或96孔，ELISA檢測(cè)儀，50l及100l加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。（2）小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。（3）4冰箱，37孵育箱。11注意事項(xiàng)做好對(duì)照正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說(shuō)明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。實(shí)驗(yàn)條件的選擇在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括:（1）固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。（2） 包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.09.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4 1824小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10g/ml等）進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽(yáng)性標(biāo)本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為110g/ml。（3）酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定（見(jiàn)酶標(biāo)記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。（4）酶的底物及供氫體的選擇：對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無(wú)色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。12清洗試驗(yàn)原理試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）.已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。先將生物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過(guò)的HRP。再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中的濃度呈比例關(guān)系。自備材料1 蒸餾水。2 加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。3 振蕩器及磁力攪拌器等。安全性1 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請(qǐng)盡快用水沖洗。2 實(shí)驗(yàn)中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。3 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。操作注意事項(xiàng)1 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說(shuō)明書儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過(guò)后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。2 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。3 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。4 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器。5 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。6 洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。7 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長(zhǎng)時(shí)間打開蓋子。底物B對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。8 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。9 按照說(shuō)明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。13應(yīng)用ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測(cè)定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認(rèn)為ELISA法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來(lái)測(cè)定抗體，而且也可用于測(cè)定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，可概括四個(gè)方面：1、免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。2、研究抗酶抗體的合成。3、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。4、定量檢測(cè)體液中抗原或抗體成份。14進(jìn)口分裝進(jìn)口分裝：檢測(cè)范圍和靈敏度不同，用量少時(shí)，可使用分裝，前期是它的長(zhǎng)久性不是很好。試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)OD 值均在2.00.2，零孔的OD 值都控制在0.10以下。試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R0.98。試劑盒重復(fù)性好，板內(nèi)、板間變異系數(shù)均9 %。試劑的組份都多給20%的富余量，確保完成48/96孔的檢測(cè)，避免分次檢測(cè)可能造成試劑量不足的情況。檢測(cè)抗體及酶結(jié)合物的稀釋度合適(均為1:30), 方便試驗(yàn)操作者準(zhǔn)確地做稀釋工作，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。白介素6是一種細(xì)胞因子,已被證實(shí)為B細(xì)胞分化因子.它是一種抗體形成系統(tǒng),它的生理特性,如肝細(xì)胞急性蛋白合成的誘導(dǎo)和基于和白介素3協(xié)同作用的生長(zhǎng)刺激等,也備受關(guān)注. 并且已證實(shí)白介素-6與病理學(xué)