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基因SNP檢測技術(shù)比較 吳鵬超遺傳與健康產(chǎn)品線 基因多態(tài)性檢測技術(shù) 一DNA測序技術(shù) DNAsequence 二基因芯片 genemicroarray 技術(shù)三實時定量PCR RealtimePCR RT PCR 技術(shù) 一DNA測序技術(shù) 從1977年第一代DNA測序技術(shù) Sanger法 發(fā)展至今三十多年時間 測序技術(shù)已取得了相當(dāng)大的發(fā)展 從第一代到第三代乃至第四代 測序讀長從長到短 再從短到長 下面我們就一一介紹前三代測序技術(shù) 第一代測序技術(shù) Sanger法核心原理是 由于ddNTP的2 和3 都不含羥基 其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵 因此可以用來中斷DNA合成反應(yīng) 第二代測序技術(shù) 第一代測序技術(shù)的主要特點是測序讀長可達1000bp 但其測序成本高 通量低嚴重影響了真正大規(guī)模的應(yīng)用 而經(jīng)過不斷的技術(shù)開發(fā)和改進 以Roche公司的454技術(shù) illumina公司的Solexa Hiseq技術(shù)和ABI公司的Solid技術(shù)為標記的第二代測序技術(shù)誕生了 1 Illumina 1 DNA待測文庫構(gòu)建 2 Flowcell 3 橋式PCR擴增與變性 4 測序 2 Roche454 1 DNA文庫制備 2 EmulsionPCR 3 焦磷酸測序 第三代測序技術(shù) 以PacBio公司的SMRT和OxfordNanoporeTechnologies納米孔單分子測序技術(shù) 被稱之為第三代測序技術(shù) PacBioSMRT技術(shù) 基本原理 DNA聚合酶和模板結(jié)合 4色熒光標記4種堿基 即是dNTP 在堿基配對階段 不同堿基的加入 會發(fā)出不同光 根據(jù)光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型 OxfordNanoporeTechnologies 當(dāng)DNA堿基通過納米孔時 它們使電荷發(fā)生變化 從而短暫地影響流過納米孔的電流強度 靈敏的電子設(shè)備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基 二基因芯片技術(shù) 基因芯片的測序原理是雜交測序方法 即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法 在一塊基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探針 當(dāng)溶液中帶有熒光標記的核酸序列 與基因芯片上對應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時 通過確定熒光強度最強的探針位置 獲得一組序列完全互補的探針序列 據(jù)此可重組出靶核酸的序列 九 基因芯片檢測原理及簡要過程 三實時定量PCR技術(shù) 由于染料不能區(qū)分特異性PCR產(chǎn)物和引物二聚體等非特異產(chǎn)物 也不能區(qū)分不同探針 所以檢測的特異性始終不如后來出現(xiàn)的探針法 也不能做多重PCR檢測 Multiplex TaqMan技術(shù) TaqMan技術(shù) MGB技術(shù) 原理 針對Taqman探針熒光淬滅不徹底的問題 3 端采用了非熒光性的淬滅基因 大大降低了本底信號的干擾 此外 MGB探針的3 端還連接了一個二氫環(huán)化吲哚卟啉 三肽 可以大大穩(wěn)定探針與模板的雜交 而短探針的熒光報告基團和淬滅基團的距離更近 淬滅效果更好 熒光背景更低 使得信噪比更高 一個15bp的MGB探針的信噪比大于6 優(yōu)于理想狀態(tài)下的25bp的普通Taqman探針 信噪比約為1 5 允許采用更短的探針也簡化了探針的設(shè)計和成本 FRET技術(shù) 原理 探針由兩條和模版互補 且相鄰的特異探針組成 距離1 5bp 上游探針的3 端標記供體熒光基團 相鄰下游探針的5 端標記Red640受體熒光基團 當(dāng)復(fù)性時 兩探針同時結(jié)合在模板上 供體基團和受體基團緊密相鄰 激發(fā)供體產(chǎn)生的熒光能量被Red640基團吸收 使得檢測探頭可以檢測到Red640發(fā)出波長為640的熒光 當(dāng)變性時 兩探針游離 兩基團距離遠 不能檢測到640波長的熒光 FRET探針檢測的信號是退火時的實時信號 每次檢測信號始終嚴格對應(yīng)模版的數(shù)量 非累積信號 可以用于做Tm曲線和SNP檢測 兩個單標記探針的長短不影響信號的傳遞 而探針間的距離通常為1 5bp 分子信標技術(shù) 分子信標 Molecularbeacon MB 是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針 兩端的核酸序列