甲型肝炎病毒IgM抗體測(cè)定.ppt.ppt

甲型肝炎病毒IgM抗體的測(cè)定 捕獲法 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) ELISA法 將抗體 抗原 包被在固相表面后 按不同的步驟加入待測(cè)抗原 抗體 和酶標(biāo)抗體 抗原 充分反應(yīng)后用洗滌的方法 使固相上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分離 洗去游離的酶標(biāo)抗體 抗原 最后加入底物 根據(jù)酶對(duì)底物催化的顯色反應(yīng)程度 而對(duì)標(biāo)本中的抗原 抗體 進(jìn)行定性或定量 ELISA類(lèi)型 夾心法間接法測(cè)抗體競(jìng)爭(zhēng)法捕獲法 捕獲法測(cè)IgM抗體 血清中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在 后者會(huì)干擾IgM抗體的測(cè)定 因此測(cè)定IgM抗本多用捕獲法 1 包被抗體 用抗人 鏈抗體包被固相載體上 形成固相抗人 鏈 2 加入病人的血清標(biāo)本 3 加入特異性抗原試劑 4 加入針對(duì)特異性抗原的酶標(biāo)抗體 5 加底物顯色 免疫球蛋白的結(jié)構(gòu) 一 基本結(jié)構(gòu) 四肽鏈結(jié)構(gòu) 由兩條相同的輕鏈 LightChain 和兩條相同的重鏈 Heavychain 通過(guò)鏈間二硫鍵連結(jié)形成 分子式為 H2L2 四條肽鏈兩端游離的NH2和COOH方向一致分別命名為N端和C端 一 輕鏈和重鏈 輕鏈 L鏈 鏈 鏈輕鏈決定型別 型 型正常人 2 1 重鏈 H鏈 根據(jù)其抗原性的差異 人類(lèi)Ig的H鏈分為 鏈 鏈 鏈 鏈 鏈 重鏈決定Ig類(lèi)別IgGIgAIgMIgDIgE 捕獲法 主要用于血清中某種抗體亞型成分 如IgM 的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)原理 用抗人 鏈抗體包被酶標(biāo)板 用以捕獲血清中IgM類(lèi)抗體 然后用特異性HAVAg與IgM抗體結(jié)合 再加酶標(biāo)抗HAV抗體 最后加底物顯色 顯色深淺與HAVIgM的含量成正相關(guān) 試劑盒組成 1抗 鏈包被干板條4 12孔2抗 HAVIgM陰性對(duì)照1ml 1瓶3抗 HAVIgM陽(yáng)性對(duì)照1ml 1瓶4HA Ag2 6ml 1瓶5酶結(jié)合物2 6ml 1瓶6濃縮洗滌液20ml 1瓶 用蒸餾水1 20稀釋 7顯色劑A3ml 1瓶8顯色劑B3ml 1瓶9終止液3ml 1瓶 操作步驟 1 將微孔條固定在支架上 按順序編號(hào) 2 分別將待測(cè)標(biāo)本 陰 陽(yáng)性對(duì)照100 l 2滴 加入相應(yīng)的孔中 設(shè)空白對(duì)照孔 置37 20分鐘 3 洗滌 甩去孔內(nèi)液體 用洗滌液注滿各孔 靜置5秒 共三次 每次洗后均需扣干 4 每孔加HA Ag50 l 酶結(jié)合物50 l 空白對(duì)照除外 振蕩混勻 置37 20分鐘 5 洗滌 重復(fù)上述36 顯色 每孔加顯色劑A液50 l 再加顯色劑B液50 l 振蕩混勻 置37 15分鐘 7 每孔加終止液50 l 結(jié)果判定 酶標(biāo)儀讀數(shù) 450nm波長(zhǎng)630nm副波長(zhǎng)讀數(shù) 臨界值 陰性對(duì)照孔OD均值 2 1 陰性對(duì)照OD小于0 05以0 05計(jì)算 結(jié)果判定 S CO 1為HAV IgM陽(yáng)性 S CO 1為HAV IgM陰性 Cutoffvalue 臨界值 Cutoffvalue 臨界值 陰陽(yáng)性判斷值 簡(jiǎn)稱CO值 夾心法 若S CO值 1 為陽(yáng)性 S CO值1 為陰性 HAVHBV肝炎病毒 HCVHDVHEV其他 HGV TTV SEN TLMV 甲型肝炎急性期血清標(biāo)志物出現(xiàn)過(guò)程 要點(diǎn) 1 HAV的傳播途徑 糞 口 2 HAV的潛伏期 30天 2周 3 血清標(biāo)志物出現(xiàn)的規(guī)律4 免疫學(xué)檢測(cè)指標(biāo) HAVAg抗HAV總抗體抗HAV IgM 臨床意義 血清中抗HAVIgM出現(xiàn)于感染的早期 發(fā)病后數(shù)日 抗體的效價(jià)很快升到峰值并持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間 2 4周 經(jīng)1 2個(gè)月后抗體的效價(jià)和陽(yáng)性率明顯不降 于3個(gè)月后消失 因此抗HAVIgM陽(yáng)性 尤其是效價(jià)較高時(shí) 表明處于感染的早期 被公認(rèn)為