KRAS和EGFR檢測與臨床應(yīng)用.ppt

KRAS和EGFR檢測與臨床應(yīng)用 匯報內(nèi)容 KRAS和EGFR的簡介及臨床意義ARMS PCR的基本原理和技術(shù)特點等位特異性引物設(shè)計KRAS試劑盒開發(fā)簡介 KRAS和EGFR的簡介及臨床意義 KRAS背景 KRAS是一種原癌基因 長約35kb 位于12號染色體 是RAS基因家族成員之一 編碼的蛋白主要參與PI3K PTEN AKT和RAF MEK ERK信號通路的調(diào)控 EGFR在通路中位于KRAS上游 配體與之結(jié)合后可以激發(fā)其酪氨酸激酶活性 導(dǎo)致KRAS的活化和通路中信號傳導(dǎo) KRAS是許多惡性腫瘤的常見突變基因 胰腺癌 65 90 結(jié)直腸癌 40 肺癌 20 卵巢癌 15 KRAS基因突變影響結(jié)直腸癌藥物療效 KRAS基因野生型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者能從EGF抗體 西妥昔單抗 帕尼單抗 治療中獲益 而基因突變的患者治療效果很差 KRAS突變型患者對西妥昔單抗無應(yīng)答 其總體生存期明顯低于KRAS野生型患者 KarapetisCS 2008 NEngJMed 結(jié)直腸癌患者檢測KRAS突變相關(guān)指南 歐洲藥品評估局 EMEA 2008 指出 KRAS野生型的進展期結(jié)直腸癌患者可能從帕尼單抗中受益 而突變型患者受益較少 美國臨床腫瘤學(xué)會 ASCO 2009 推薦 轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者應(yīng)檢測KRAS突變 如有KRAS12 13位突變 則不應(yīng)進行EGFR單克隆抗體治療 美國FDA指南推薦 在使用靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌前必須檢測KRAS基因的基因型 2012年7月6日批準(zhǔn)第一個用于結(jié)直腸癌的基因檢測 Qiagen 以判斷西妥昔單抗是否有效 美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò) NCCN 2014 指南說 轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者均應(yīng)進行RAS突變檢測 KRAS和NRAS 至少應(yīng)檢測KRAS第二外顯子的突變情況 KRAS或NRAS突變型的病人不應(yīng)采取西妥昔單抗或帕尼單抗治療 中國衛(wèi)生部于2010年10月14日發(fā)表了 結(jié)直腸癌診療規(guī)范 2010版 明確指出在患者確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌接受西妥昔單抗 帕尼單抗時 必須檢測腫瘤組織的K ras基因狀態(tài) 在晚期 轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療中 在治療前檢測腫瘤K ras基因狀態(tài) EGFR不推薦作為常規(guī)檢查項目 KRAS基因突變影響非小細胞肺癌藥物療效 KRAS基因野生型的非小細胞肺癌患者能從小分子酪氨酸激酶抑制劑 TKI 如吉非替尼 厄洛替尼 治療中獲益 而基因突變的患者易發(fā)生抵抗 KRAS突變型患者使用厄洛替尼聯(lián)合化療后 其無癥狀生存期和總生存期明顯低于野生型患者 圖中紅線所示 AndersonSM 2011 ExpertRev Mol DiagnEberhardDA 2005 JClinOncol 非小細胞肺癌患者檢測KRAS突變相關(guān)指南 美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò) NCCN 2009 指出 KRAS突變與非小細胞肺癌患者TKI抵抗有關(guān) KRAS基因測序有助于確定哪些病人適合TKI治療 當(dāng)KRAS基因發(fā)生了突變 則不建議病人使用厄洛替尼進行分子靶向治療 KRAS主要突變位點 在結(jié)直腸癌中 KRAS突變主要發(fā)生于codon12 80 codon13 15 20 codon61和146 5 在肺癌中 約97 的KRAS突變發(fā)生于codon12 13 其余位于codon61和146 EGFR突變背景 EGFR基因位于染色體7p11 2 大小約200kb 是上皮生長因子 EGF 細胞增殖和信號傳導(dǎo)的受體 EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相關(guān)信號通路中關(guān)鍵因子的活性或細胞定位異常 與腫瘤細胞的增殖 血管生成 腫瘤侵襲 轉(zhuǎn)移及細胞凋亡的抑制有關(guān) 非小細胞肺癌中EGFR突變率在北美和西歐為10 左右 而在東亞為30 50 其中在亞洲 女性 非吸煙 腺癌患者中EGFR突變率最高 達70 80 EGFR突變背景 研究發(fā)現(xiàn)EGFR突變與吉非替尼 厄洛替尼的療效密切有關(guān) 其中EGFR突變的患者對吉非替尼 厄洛替尼治療敏感 有效率在80 以上 而EGFR野生型的患者的有效率在10 以下 吉非替尼 厄洛替尼作為一線藥物治療非小細胞肺癌 相比傳統(tǒng)的化療可以取得更長的無進展生存期 PFS 且副作用相對較小 患者容易耐受 但總體生存期 OS 并未延長 EGFR TKI目前主要用于非小細胞肺癌一線 二線和維持治療 我國大部分醫(yī)生將其用于二線 69 4 治療 41 7 的醫(yī)生將其用于一線治療 27 8 的醫(yī)生將其作為維持治療藥物 EGFR突變影響肺癌藥物療效 研究表明EGFR突變型患者使用吉非替尼的療效要優(yōu)于卡鉑與紫杉醇組合治療 而在野生型患者中則相反 使用吉非替尼的療效不如卡鉑與紫杉醇組合治療 MokT S 2009 NEngJMedMaemondoM 2010 NEngJMed EGFR突變檢測相關(guān)指南 美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò) NCCN 2011版的癌癥治療指南中明確指出 EGFR突變 尤其是外顯子19的缺失突變和外顯子21的L858R突變 與腫瘤對TKIs如吉非替尼治療敏感性有重要關(guān)系 而部分EGFR TKI初始治療有效的患者后期會發(fā)生耐藥 與EGFR外顯子20突變密切相關(guān) 美國臨床腫瘤學(xué)會 ASCO 在JCO上發(fā)表報告 EGFR TKI是攜帶EGFR突變型的非小細胞肺癌病人的一線治療藥物 有益于進展期非小細胞肺癌患者的個體化治療 歐洲EMEA指出 易瑞沙 吉非替尼 僅對攜帶EGFR突變型的非小細胞肺癌患者有效 平均無進展生存期延長3 5月 美國FDA 2013 批準(zhǔn)對擬采用阿法替尼 厄洛替尼等EGFR TKI治療的患者進行EGFR突變檢測的試劑盒 therascreenEGFRRGQPCRKit和cobas EGFRMutationTest 我國 非小細胞肺癌臨床實踐指南 中也明確指出EGFR突變 尤其是19號外顯子缺失突變與腫瘤對酪氨酸激酶抑制劑 TKIs 的敏感度有重要關(guān)系 對腺癌 大細胞癌 非小細胞肺癌等肺癌組織學(xué)類型 EGFR檢測為一類推薦 EGFR突變位點 常規(guī)檢測29個 EGFR突變與EGFR TKI藥物療效關(guān)系 ADxEGFR試劑盒突變結(jié)果檢測 ARMS PCR的基本原理和技術(shù)特點 ARMS PCR原理 ARMS是AmplificationRefractoryMutationSystem 擴增阻礙突變系統(tǒng) 的縮寫 根據(jù)PCR過程中要求引物和模板間的嚴(yán)格互補配對來實現(xiàn)對突變位點的檢測 當(dāng)引物3 末端出現(xiàn)錯配時 產(chǎn)物將不能延伸 因此設(shè)計兩條上游 或下游 引物 使其3 末端分別與突變位點堿基匹配和錯配 共用下游 或上游 引物 分別擴增野生型和突變型目的片斷 ARMS PCR原理 TwoAllele Specific AS primers oneforeachalleleofaSNParedesigned TheASprimerscontainoneoftwopolymorphicnucleotidesattheprimer3 end Twosetsofprimers eitherforwardorreverseprimerscanbedesigned IfacommonreverseorforwardprimerisusedinaPCRreaction thereactioniscalledallele specificPCR AS PCR YouF M 2008 BMCBioinformatics PCR產(chǎn)物檢測 RealtimePCR 每個PCR循環(huán)檢測熒光信號 不同PCR產(chǎn)物 不同熒光信號相比凝膠電泳 更快 可定量 無PCR產(chǎn)物污染信號產(chǎn)生方法 Scorpion Qiagen 雙環(huán)探針 廈門艾德 Taqman Molecularbeacons Sybrgreen Yo pro Figure2ThesensitivityofQuanTAS PCRforquantifyingJAK2mutantalleles ZapparoliG V 2013 BMCCancer 應(yīng)用于Realtime PCR的ARMS PCR ARMS技術(shù)特點 優(yōu)點 靈敏度高 0 1 1 操作簡便周期短不產(chǎn)生PCR產(chǎn)物污染適用樣本類型多 如FFPE 精確突變類型 缺點 方法建立需時較長僅能檢測已知突變 測序法與ARMS法相比較 操作流程及數(shù)據(jù)解讀 檢測流程與質(zhì)量控制 標(biāo)本準(zhǔn)備 DNA抽提 突變檢測 分析報告 標(biāo)本種類標(biāo)本量 SOPOD260 280 新鮮組織 qPCR FFPE SOP陽性及陰性對照問題及解決 SOP報告標(biāo)準(zhǔn)判讀形式及檢查 使用ARMS的KRAS突變檢測試劑盒 使用ARMS的EGFR突變檢測試劑盒 等位特異性引物設(shè)計 KRAS基因序列和常見突變 KRAS序列 atgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggattcctacaggaagcaagtagtaattgatggagaaacctgtctcttggatattctcgacacagcaggtcaagag常見突變 三引物設(shè)計原理 YouF M 2008 BMCBioinformatics 三引物設(shè)計 Atgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggattcctacaggaagcaagtagtaattgatggagaaacctgtctcttggatattctcgacacagcaggtcaagag野生型引物 F 5 CTTGTGGTAGTTGGAGCTG 3 19nt 51 突變型引物 F 5 cttgtggtagttggagctA 3 19nt 49 下游引物 R 5 CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC 3 25nt 54 三引物設(shè)計 下游引物設(shè)計 ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG選擇序列 5 GACGAATATGATCCAACAATAGAGG 3 互補鏈 3 CTGCTTATACTAGGTTGTTATCTCC 5 下游引物 5 CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC 3 3 端增加錯配 如果3 端是弱錯配 C A或G T 則需要引入強的錯配 A G或C T 才可阻斷3 端的擴增 如果3 端是強錯配 A G或C T 則需要引入弱的錯配 C A或G T 或不需引入錯配即可阻斷3 端的擴增 當(dāng)3 端是中度錯配 A A C C G G或T T 則需要引入中度的錯配 野生型引物 F 5 CTTGTGGTAGTTGGAGCTG 3 突變型引物 F 5 cttgtggtagttggagcCT 3 下游引物 R 5 CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC 3 四引物設(shè)計 四引物設(shè)計 Atgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggattcctacaggaagcaagtagtaattgatggagaaacctgtctcttggatattctcgacacagcaggtcaagag內(nèi)引物 F 5 CTTGTGGTAGTTGGAGCTA 3 內(nèi)引物 R 5 ACTCTTGCCTACGCCACC 3 外引物 F 5 AtgactgaatataaaCT 3 外引物 R 5 CTCTTGACCTGCTGTGTCG 3 KRAS試劑盒開發(fā)簡介 KRAS突變探針和引物設(shè)計 KRAS序列 atgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggattcctacaggaagcaagtagtaattgatggagaaacctgtctcttggatattctcgacacagcaggtcaagag1 5 CTTGTGGTAGTTGGAGCTTA 3 12GGT GAT2 5 AAACTTGTGGTAGTTGGAGCGGT 3 12GGT GTT3 5 AACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC 3 12GGT GCT4 5 ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA 3 12GGT AGT5 5 AACTTGTGGTAGTTGGAGCGT 3 12GGT TGT6 5 ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCCC 3 12GGT CGT7 5 GTGGTAGTTGGAGCTGGTAA 3 13GGC GAC8 參照引物 5 CTGAATATAAACTTGTGGTAGTT 3 9 下游引物 5 ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC 3 TaqMan探針 5 FAM TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT BHQ1 3 鎖核酸阻滯探針 野生型 5 TGGAGCTGGTG