（分析化學專業(yè)論文）secmspr聯(lián)用技術研究硫蛋白與金屬離子的相互作用.pdf

碩士學位論文摘要 摘要 金屬硫蛋白( m e t a l l o t h i o n e i n ，m t ) 是一類能夠調(diào)節(jié)必需金屬 代謝和重金屬解毒的金屬蛋白質(zhì)，它對金屬離子的捕獲，釋放和轉(zhuǎn) 移行為都是動態(tài)的細胞過程。實時監(jiān)測這一系列過程中蛋白質(zhì)的結(jié) 構(gòu)變化對研究這類蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間的關系具有深遠的生物 學意義。 本文我們引入掃描電化學顯微鏡( s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a l m i c r o s c o p y ，s e c m ) 表面等離子體激元共振( s u r f a c ep l a s m o n r e s o n a n c e ，s p r ) 聯(lián)用技術，實時研究了表面固定的硫蛋白與c u 2 + 的相互作用過程。結(jié)果表明，這一新型聯(lián)用技術不僅能夠控制金屬 鍵合的程度，還能檢測硫蛋白與金屬離子的結(jié)合情況以及相關動力 學過程。本文對脫金屬硫蛋白( a p o m e t a l l o t h i o n e i n ，a p o - m t ) 捕獲 c u 2 + 以及m t 釋放c u 2 + 的分步過程進行了解釋，說明了三個穩(wěn)態(tài)結(jié) 構(gòu)所包含的不同金屬離子個數(shù)5 、9 、1 2 ，并對結(jié)合過程進行了動力 學分析。另外，由于在固體電極上原始狀態(tài)下的m t 的伏安信號通 常不明顯，因此，本文的研究使這一聯(lián)用技術的應用范圍也得到了 拓展，即可對不具電化學活性的蛋白質(zhì)進行研究。 在此基礎上，我們將這一研究模型應用到檢測a p o m t 與h 9 2 + 的結(jié)合作用。實驗測得a p o m t 對h 9 2 + 的飽和結(jié)合數(shù)為1 8 ；當h 9 2 + 的量為a p o m t 的1 2 0 倍時，m t 結(jié)構(gòu)遭到破壞。 關鍵詞：掃描電化學顯微鏡一表面等離子體激元共振聯(lián)用技術，金屬 硫蛋白，銅離子，汞離子，動力學 碩士學位論文 a bs t r a c t m e t a l l o t h i o n e i n sa r eac l a s so fm e t a l l o p r o t e i n st h a t p l a y a n i m p o r t a n t r o l ei ne s s e n t i a lm e t a lr e g u l a t i o na n dh e a v ym e t a l d e t o x i f i c a t i o n t h ea c t i v i t yo fm e t a li o ns e q u e s t r a t i o n ，r e l e a s e ，a n d t r a n s f e rb ym t sa l ed y n a m i cc e l l u l a rp r o c e s s e s d e t e c t i n gt h es t r u c t u r e c h a n g e sd u r i n gt h ed y n a m i cp r o c e s s e s i so fi m m e n s eb i o l o g i c a l i m o o r t a n c ef o ru n r a v e l i n gt h ep r o t e i ns t r u c t u r e f u n c t i o nr e l a t i o n s h i p h o w e v e r , m a n yt r a d i t i o n a lt e c h n i q u e sm o n i t o r i n gc h a n g e se i t h e r i n s o l u t i o no ri nt h es o l i ds t a t ea r en o ta m e n a b l ef o rs t u d i e so fr a p i d f u n c t i o n a la n dd y n a m i cc h a n g e so fp r o t e i n sa tt h es o l i d l i q u i di n t e r f a c e f u r t h e r m o r e t h e r ea r ec e r t a i ni n h e r e n tl i m i t a t i o n s 、ed e s c r i b e h e r e i nt h er e a l t i m es e c m s p rd e t e c t i o no f i n t e r a c t i o nb e t w e e nc o p p e ri o na n ds u r f a c e c o n f i n e dm t i ti ss h o w n t h a tn o to n l yd i dt h ec o u p l et e c h n i q u ee n a b l eu st oc o n t r o lt h ee x t e n to f m e t a lb i n d i n g ，b u ta l s oa l l o w e dt h eb i n d i n gs t o i c h i o m e t r ya n dd y n a m i c s t ob eq u a n t i t a t i v e l yd e t e r m i n e d i tr e v e a l st h a tc o p p e ri o ns e q u e s t r a t i o n b ya p o m ta n dc o p p e ri o nr e l e a s eb ym t a r eb o t hs t e p w i s ep r o c e s s e s ， l e a d i n gt ot h r e es t a b l es t r u c t u r e sc o n t a i n i n gd i f f e r e n tn u m b e r so fm e t a l i o n s ，w h i c ha r ec u 5 - m t ，c u 9 - m t ，c u l 2 一m t ，r e s p e c t i v e l y s i n c em t si n t h e i rn a t i v e s t r u c t u r e g e n e r a l l y d on o te x h i b i tw e l l d e f i n e d v o l t a m m o g r a m s a ts o l i de l e c t r o d e s ，o u rw o r ke x p a n d st h ea p p l i c a t i o no f s e c n 卜- s p rf r o ms t u d i e so fr e d o xp r o t e i n st op r o t e i n st h a td on o t u n d e r g of a c i l ee l e c t r o nt r a n s f e rr e a c t i o n s a f t e rt h i s ，t h er e s e a r c ha p p r o a c hi sa p p l i e dt od e t e c tt h ep r o c e s so f m e r c u r ys e q u e s t r a t i o nb ya p o m t i ts h o w st h a tm tr e a c h e s t h e s a t u a t i o ns t a t e ，w h e nt h em o l a rr a t i oo fh g + m ti su pt o18 w h e nt h e r a t i oi sb e y o n d12 0 ，t h es t r u c t u r e s c o m p o s i t i o n so fm tt u r no u tt ob e d e s t r o y e d k e yw o r d s ：s e c m - s p rm e t a l l o t h i o n e i n ，c o p p e ri o n ，m e r c u r yi o n ， k i n e t i c s i i 原創(chuàng)性聲明 本人聲明，所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工 作及取得的研究成果。盡我所知，除了論文中特別加以標注和致謝的 地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包 含為獲得中南大學或其他單位的學位或證書而使用過的材料。與我共 同工作的同志對本研究所作的貢獻均已在論文中作了明確的說明。 作者簽名： 霉速砼日期：茸年五月五日 學位論文版權使用授權書 本人了解中南大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有 權保留學位論文并根據(jù)國家或湖南省有關部門規(guī)定送交學位論文，允 許學位論文被查閱和借閱；學?？梢怨紝W位論文的全部或部分內(nèi) 容，可以采用復印、縮印或其它手段保存學位論文。同時授權中國科 學技術信息研究所將本學位論文收錄到中國學位論文全文數(shù)據(jù)庫， 并通過網(wǎng)絡向社會公眾提供信息服務。 作者簽名：扭導師簽名姐日期：班月幽 碩士學位論文第一章緒論 第一章緒論 聯(lián)用分析技術是當前儀器分析的重要發(fā)展方向，它將幾種方法結(jié)合起來，匯 集了各自的優(yōu)點、彌補了各自的不足，從而更好的完成試樣的分析任務。在表面 分析方面，掃描電化學顯微鏡( s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y ，s e c m ) 和表面等離子體激元共振( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ，s p r ) 都是較為成熟的分 析技術，他們各自在生物、化學、醫(yī)學、制藥等領域都有著較為廣泛的應用，是 表面微區(qū)檢測強有力的工具。迄今為止，它們曾分別與多種分析技術相結(jié)合。 就s e c m 而言，它在開始應用的階段，就已經(jīng)與多種表面分析技術聯(lián)用， 用于研究氧化還原誘導的表面反應、吸附劑的性質(zhì)以及所選技術的性能評估【l - 9 ， 如s e c m 一石英晶體微天平【1 ，3 ，4 1 、s e c m - 電化學發(fā)光【2 1 和s e c m 光學顯微鏡【5 1 、 s e c m 光電化學顯微鏡 1 0 j 、s e c m 原子力顯微鏡【6 】、s e c m - 電化學隧道顯微鏡【1 1 】 和s e c m 微電極電位測定法【9 】等。推動這種聯(lián)用技術發(fā)展的動力來源于在獲得電 化學信息的同時需要對界面現(xiàn)象進行尋址，以及實現(xiàn)s e c m 探針電極在誘導局 部反應并可控地制造微型表面圖樣方面的普適性的需求【1 2 】。 近年來，與s p r 相關的聯(lián)用技術迅速發(fā)展起來，如流動注射s p r 【1 3 】、近紅 外s p r 成像技術【1 4 1 、s p r 熒光光譜法【1 5 】、s p r - 石英晶體微天平【1 6 1 、電化學 ( e l e c t r o c h e m i s t r y ，e c ) s p r 【1 7 1 、s p r - 質(zhì)譜【1 8 】等。其中，表面等離子體激元共 振技術與電化學相結(jié)合( e c s p r ) 為探測吸附物的光學與電學特性提供了可行 的途徑，并為定量分析伴隨氧化還原反應發(fā)生的超薄薄膜的厚度變化提供了靈敏 的檢測方法。然而，在經(jīng)典電化學- s p r 實驗中，施加在s p r 基底表面的電位會 改變基底電子密度并造成s p r 共振角位穢1 0 2 , 1 0 3 】。 s e c m - s p r 新型聯(lián)用技術【1 2 1 的建立正是為了避免在s p r 基底施加電位而引 起電子密度或s p r 共振角位移變化，而利用s e c m 電化學技術誘導基底表面的 局部反應，使這一聯(lián)用技術能夠避免某些表面參數(shù)發(fā)生變化，從而使數(shù)據(jù)分析簡 化。 1 1 掃描電化學顯微鏡表面等離子體激元共振聯(lián)用技術 掃描電化學顯微鏡一表面等離子體激元共振( s e c m s p r ) 作為一種新型表 面分析聯(lián)用技術【1 2 1 ，利用了s e c m 的微米級空間分辨率、表面電化學活性測量 等功能和s p r 的亞埃米級厚度檢測限的優(yōu)點，同時彌補了s e c m 靈敏度低，不 碩士學位論文第一章緒論 能獲得表面吸附的分子構(gòu)型變化信息，以及e c s p r 的金屬基底電場變化對等離 子體激元密度影響等方面的不足，將溶液中微區(qū)選擇性誘導和表面高靈敏檢測相 結(jié)合，從而實現(xiàn)高選擇、原位、動態(tài)的現(xiàn)場研究。 1 1 1聯(lián)用技術的發(fā)展概況 電化學表面等離子體激元共振( e c s p r ) 是電極溶液界面實時表征和處理 的有力工具【1 9 。2 1 1 自1 9 8 0 年g o r d o n 等人1 9 】揭示了在電解質(zhì)溶液中銀電解質(zhì)溶液 界面上的s p 共振與電極電位呈函數(shù)關系，并討論了影響共振位移的影響因素以 來，s p r 技術在界面電化學領域的研究得到了較大的發(fā)展。尤其是最近十年，很 多研究組對e c s p r 技術應用更為深入。 董紹俊院士的研究組以s p r 傳感片上的金膜作為電化學測定的膜電極，將 s p r 技術與循環(huán)伏安、電化學阻抗聯(lián)用，從不同的角度分析發(fā)生在電極表面的及 其附近的化學和物理過程，在表征表面的氧化還原過程、單層及雙層膜的形成、 物質(zhì)沉積和吸附、離子的檢測等表面過程方面進行了大量工作【2 2 。2 4 】，并分別對聚 苯胺的電化學聚合行為、聚苯胺膜在電化學氧化還原過程中膜的溶脹收縮行為 以及陰離子的摻雜去摻雜行為原位地進行了詳細的考察 2 4 ，2 5 1 。此后，他們又通 過還原溶解氧，以原位電生成媒介物h 2 0 2 作為氧化劑，在金電極表面陰極合成 的聚苯胺膜，并且利用s p r 檢測多晶金電極和金電極基底上聚苯胺膜的平均增 長速率。結(jié)果顯示此種方法制得的膜厚易于控制在分子水平，有潛力應用到納米 元件領域【2 6 1 。該課題組還利用e c s p r 探索了金電極表面上導電聚合物聚吡咯膜 的電化學合成【1 0 4 1 。 最近，他們將e c s p r 技術應用在生物分子領塒2 7 1 。王建龍等應用e c s p r 技術，通過在金膜上催化沉積金屬離子檢測小生物分子。由于抗壞血酸的濃度可 以影響在金膜上銀的沉積量，從而導致不同程度的s p r 信號增強，并且沉積在 金膜上的銀可以通過溶出實現(xiàn)s p r 傳感表面再生，因此，為電化學方法檢測抗 壞血酸濃度提供了可行性【2 8 1 。在d n a 方面，研究了復合物膜( 帶負電的小牛胸 腺雙鏈d n a 和帶正電的z r 4 + 離子交替多層組裝膜) 和血紅素蛋白細胞色素c 間 的相互作用f 2 9 】，考察了電場激發(fā)多層膜( 層層組裝d n a 和z r 4 + 的膜) 的分解。 通過控制施加電位來控制膜分解速率，從而實現(xiàn)可控的釋放d n a ，并能夠保證 連續(xù)電化學釋放出的d n a 仍然具有完整性和基因轉(zhuǎn)染活性【2 7 】。 1 w a s a k i 等利用e c s p r 技術表征了膜電極表面發(fā)生的表面反應【3 0 。3 2 1 。磷酸 鹽電介質(zhì)溶液中的探針離子f e ( c n ) 6 3 - 4 - 在金電極表面的氧化還原過程可以通過 循環(huán)伏安和s p r 進行表征【3 1 1 ，由于探針離子的氧化還原導致分子的電子結(jié)構(gòu)的 變化，在電子傳輸過程中導致金電極表面的介電常數(shù)的變化，因此引起s p r 信 2 碩士學位論文 第一章緒論 號的改變，s p r 信號對時間的導數(shù)與電流變化相關。在使用低濃度的f c ( c n ) 6 3 - 4 時，在電極表面吸附的磷酸鹽離子被探針離子替代的過程可以從s p r 圖譜上觀 察到。在使用高濃度的f e ( c n ) 6 3 - 4 - 孓j - ，s p r 信號的變化反映的是f e ( c 6 3 攤的氧 化還原態(tài)的不同導致的折射率的變化。在持續(xù)的進行電壓掃描的情況下，s p r 信 號相對于電壓的變化的圖譜完全改變了，而循環(huán)伏安曲線沒有變化，s p r 信號表 明電極表面形成了層膜，但是電化學數(shù)據(jù)顯示這層膜并不影響電子的傳輸反 應。另外，1 w a s a l d 等將辣根過氧化物酶( h r p ) 鋨( o s ) 聚乙烯吡啶修飾電極用 于固定葡萄糖氧化酶，采用電化學s p r 技術研究了h r p 對葡萄糖氧化酶電活性 的影響，并將此電極用于葡萄糖的檢測【3 2 1 。 b a b a 等建立電化學方法與原位表面等離子體共振( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e s p e c t r o s c o p y ，s p r s ) 和表面等離子體場增強光散射( s u r f a c ep l a s m o n f i e l d e n h a n c e dl i # ts c a t t e r i n g ，s p f e l s ) 的聯(lián)用技術。由于基底施加循環(huán)的電位 會導致基底上發(fā)生苯胺的電聚合，隨著聚苯胺膜的形貌變化膜的介電常數(shù)和膜厚 發(fā)生變化，產(chǎn)生明顯的電子震蕩，因此可利用s p r s 和s p f e l s 檢測苯胺的電聚 合過程和隨后形成聚苯胺膜的摻雜去摻雜過程，同時由循環(huán)伏安法獲得苯胺的電 聚合信息，實現(xiàn)金電極上聚苯胺膜的光學和電化學性質(zhì)的同時獲得【1 0 5 。此后， b a b a 等利用e c s p r s s p f e l s 技術同時檢測了層層自組裝導電超薄聚合物膜的 光學和電化學性質(zhì)。以聚苯胺和磺化聚苯胺分別為導電層層自組裝膜的聚陽離子 和聚陰離子。由e c s p r s s p f e l s 監(jiān)測在不同聚苯胺磺化聚苯胺膜厚情況下?lián)?雜去摻雜過程，獲得了聚苯胺磺化聚苯胺層層自組裝薄膜不同膜厚對應的介電 常數(shù)和同時發(fā)生的形貌變化的原位信，息【3 3 】。2 0 0 3 年，b a b a 等又利用e c s p r 研 究了苯胺或聚( 3 ，4 乙烯基二羥基噻吩p e d o t ) 的聚合作用中陰離子摻雜去摻 雜過程，膜沉積作用和電致變色性質(zhì)，精確地確定了不同摻雜程度下導電聚合物 超薄膜的復雜的介電常數(shù)和光學傳導率【1 7 】。還比較了在裸金電極上和表面修飾十 八烷基硫醇( o c t a d e c a n c t h i o l ，o d t ) s a m 的金電極上電聚合生成聚吡咯的過程， 說明了裸金電極上吡咯電聚合過程需要金電極和吡咯單體間的電子轉(zhuǎn)移來實現(xiàn)， 而o d ts a m 修飾的金電極中，由于o d ts a m 是一層絕緣層，吡咯的電聚合受 到阻礙【2 l 】。 此外，在電聚合方面，g u 等應用e c s p r 波譜研究金膜上的聚( 4 硝基1 ， 2 苯二胺) 的電聚合過程及其氧化還原態(tài)的變遷【3 4 1 。w a n g 等也應用了此聯(lián)用技 術檢測膜摻雜和去摻雜時電聚合和離子捕獲過程中，聚合物膜厚變化引起的反射 率改變【3 5 】。t a r a n c k a r 等應用e c s p r 研究了共聚作用電化學光學性質(zhì)【3 6 】。 在酶化學方面，s c h l e r e t h 等應用e c s p r 研究了表面固定的酶的電化學催化 行為【3 7 1 。r a i t m a n , o a 等【4 3 1 和t i a n , s 等【3 8 】應用在沉積聚合物的電聚合過程或陰 3 碩士學位論文 第一章緒論 離子摻雜除雜過程中對電致變色性質(zhì)的膨脹和收縮行為的原位檢測技術，整合 氧化還原酶和導電聚合物作為生物電催化膜，拓展了生物傳感器的種類。 s i m o n i a n 等研制了一種納米復合材料薄膜的靜電組裝方法。采用e c s p r 實 時檢測傳感元件的組裝并原位的電化學檢驗酶加入到多層膜( 由金屬有機電子交 換聚合物( r p ) 和氧化還原酶、葡萄糖氧化酶( g o x ) 、乳酸氧化酶( l o x ) 和丙酮酸氧化酶( p y x ) 交替鋪層制得) 納米結(jié)構(gòu)上時基底電流的變化，說明了 酶的活性和在氧化還原聚合物和酶之間的電子遷移【3 9 1 。t a n g 等基于酶生物催化 沉淀物放大抗體一抗原相互作用，制備了抗體抗原一堿性磷酸酶( a p ) 標記的二 級抗體三明治結(jié)構(gòu)，將酶生物催化產(chǎn)品沉積在免疫傳感器電極表面，用s p r 放 大信號檢測共振角位移和f e ( c n ) 1 6 3 - 4 氧化還原電對的法拉第電子阻抗。這一方法 可用于其他三明治免疫分析并可檢測其他低濃度抗體抗原相互作用免疫分析。 在生物電化學方面，電化學s p r 技術能夠監(jiān)測生物分子在電極表面的吸附 行為，可利用其研究生物分子的電化學氧化還原過程【4 1 - 4 3 , 1 0 3 】。s c h l e r e t h 等【4 1 1 將 s p r 與電化學循環(huán)伏安法聯(lián)用研究了細胞色素c 、細胞色素c 氧化酶在烷基硫醇 修飾金電極表面的吸附過程，并對兩種蛋白質(zhì)在修飾電極表面的覆蓋度和電化學 氧化還原過程進行了探討。長春應化所楊秀榮【4 2 】等在巰基丙酸單分子層修飾金 電極表面固定鐵蛋白，利用s p r 和循環(huán)伏安法對電極的組裝過程和鐵蛋白的直 接電化學氧化還原進行了研究。r a i t l n a n 等 4 3 】將聚苯胺聚丙烯酸膜修飾電極用 于葡萄糖氧化酶和乳酸脫氫酶的固定。電化學s p r 研究結(jié)果表明：聚合膜氧化 態(tài)( p a n 2 + ) 和還原態(tài)( p a n ) 之間的可逆轉(zhuǎn)換對葡萄糖氧化酶、乳酸脫氫酶的電化學 氧化還原過程有一定的促進作用；此修飾電極用于葡萄糖和乳酸的檢測具有很 好的響應特性。此外b o u s s a a d 等人【1 0 3 】也證實s p r 光譜技術能夠用于氧化還原蛋 白質(zhì)在電極表面的構(gòu)象變化及其氧化還原電子傳遞過程的研究。l i u 等【4 4 】在縮氨 酸修飾電極表面固定生物素標記的互補d n a 鏈，再吸附二茂鐵親和素復合物。 采用電化學s p r 檢測了d n a 雜交時放大的s p r 響應和基于二茂鐵增強的電化 學響應信號。 而納米材料方面，l i n g 等用e c s p r 檢測f e r r o c e n y ld e n d r i m e r sa n dp - c d 功 能金納米粒子在分析印制板上原位吸附和脫附現(xiàn)象。通過在納米粒子膜的特殊領 域應用電化學氧化物，可以檢測局部納米粒子的脫附。非氧化區(qū)域，納米粒子保 持很強的表面吸附能力，而在電化學氧化區(qū)域，納米粒子完全消失【4 s 】。h i e p 等 應用e c s p r 研究核殼結(jié)構(gòu)納米粒子。即，制備了一種新型金膜基底( 核殼結(jié) 構(gòu)納米粒子) 來傳感信號s p r 檢n - - 氧化硅納米粒子的核大小和沉積的金殼厚 度。結(jié)果顯示保持核大小為常數(shù)，當殼厚度增加，s p r 波譜的峰波長移向短波， 并且在某一特定的殼厚度處出現(xiàn)最大峰強度。應用這種結(jié)構(gòu)，我們用膜基底納米 4 碩士學位論文 第一章緒論 傳感器光學檢測混合雙分子層與蜂毒肽的鍵合，并用電化學技術確定溶液濃度對 膜的干擾。拓寬了一個領域：通過在微流體上結(jié)合芯片和采用多列形式，實現(xiàn)功 能上檢測類似蛋白質(zhì)毒素和其他膜靶多肽【釣j 。 然而，在上述的s p r 與電化學聯(lián)用的實驗中，人們都不可避免地遇到了一 個問題：施加在s p r 基底的電位改變了基底電子密度并造成s p r 共振角位移【7 5 1 。 這個固有干擾在極小厚度變化時將成為一個突出的問題。盡管有人認為氧化還原 反應可以通過引入電活性物質(zhì)誘導，但溶液成分( 折射率) 的劇烈變化也會導致 s p r 共振角位移。為此，x i a n g 等引入s e c m 的表面電化學活性測量功能，利用 s e c m 探針產(chǎn)生的氧化還原物種來誘導s p r 基底上電活性物質(zhì)( 細胞色素c ( c y t c ) 分子) 的氧化還原，從而避免了對基底施加電位而引起的s p r 角度偏移，并 由s p r 檢測表面固定細胞色素c ( c y tc ) 分子的構(gòu)象變化引起的膜厚變化【1 2 】。 此前，s z u n e r i t s 等也曾將這兩種表面分析技術( s e c m 、s p r ) 聯(lián)用，探索 s e c m - s p r i 技術在固液界面電聚合方面的應用，同時提出了該技術還可應用于 檢測基底上伴隨著氧化態(tài)變化的反應及其動力學研究【7 j 。隨后，他們又將該聯(lián)用 技術應用于固液界面上d n a 雜交過程的研剄4 7 j 。 一天忑= 崎 圖i - is e c m s p r i 的裝11 至tt n ，圖中，c e 一對電極，r e 一參比電極 h g 1 1s e c m s p r is y s t e m 刀，c ec o u n t e re l e c t r o d e ，r er e f e r e n c ee l e c t r o d e 不同的是，s z u n e r i t s 等建立的聯(lián)用技術，仍以s p r 基底為工作電極，s e c m 探針為對電極，從而既保證了s p r 對基底上沉積的電聚合產(chǎn)物厚度進行檢測， 又保證了導電聚合物在微區(qū)內(nèi)沉積。 s e c m s p r 聯(lián)用技術作為生物傳感和表面分析領域里的一種新型界面分析 技術，因其兼有s e c m 的高分辨率和s p r 的高靈敏度的優(yōu)勢而具有很強的生命 力，同時，其拓展的“讀寫并行理念將為發(fā)展新型界面分析技術提供更為人性 化的思維空間。不過，作為剛剛起步的新型聯(lián)用技術，s e c m s p r 系統(tǒng)有其不足 之處需要不斷完善，如空間分辨能力和靈敏度仍待提高。 s 驢 咿印 陌 碩士學位論文第一章緒論 1 1 2聯(lián)用技術的工作原理 s e c m s p r 聯(lián)用技術利用s e c m 的微米級空間分辨率、表面電化學活性測 量等功能和s p r 的亞埃米級厚度檢測限的優(yōu)點，同時彌補s e c m 靈敏度低，并 且不能獲得表面吸附的分子構(gòu)型變化信息，以及e c s p r 的金屬基底電場變化對 等離子體激元密度影響等方面的不足，將溶液中微區(qū)選擇性誘導和表面高靈敏檢 測相結(jié)合，從而實現(xiàn)高選擇、原位、動態(tài)的現(xiàn)場研究。聯(lián)用技術的工作原理可以 從以下兩個方面介紹： 1 ) s e c m 基本原理 s e c m 裝置如圖1 2 所示，主要由電化學部分( 電解池、探頭、基底、參比 電極、輔助電極和雙恒電位儀) 和用來精確控制、操作探頭和基底位置的壓電驅(qū) 動器，以及用來控制操作、獲取和分析數(shù)據(jù)的計算機三部分組成。微電極探頭固 定在可三維調(diào)節(jié)的微控制器上，可以精確控制其在基底電極上的位置。基底固定 在電解池的底部，可以是各種材料的導體電極，也可以是生物物質(zhì)或細胞等絕緣 基底。雙恒電位儀用來控制探頭和基底的電位。 圖1 - 2s e c m 裝置圖【4 8 1 f i g 1 - 2b l o c kd i a g r a mo ft h es e c ma p p a r a t u s 4 8 1 s e c m 與其它電化學技術相比具有以下兩個優(yōu)點：( 1 ) 能夠用于反應機理 的研究和探測界面現(xiàn)象。( 2 ) 分辨率高( 在亞微米和納米級范圍內(nèi)) 和傳質(zhì)速 度快，由此可以在穩(wěn)態(tài)條件下研究快速反應過程。它已被應用于許多領域，既可 以作為電化學技術，也可以作為描繪圖像的儀器和作為微加工的工具。這些功能 均通過不同的工作模式來完成( 見圖1 3 ) 。 6 碩士學位論文第一章緒論 - ro _ _ - ( d ) 離子轉(zhuǎn)移反饋模式( e ) 平衡擾動模式 ( c ) 穿透模式 一 二止l 圖1 - 3s e c m 六種常用工作模式示意圖 f i g 1 - 3s i xo p e r a t i n gm o d e so fs e c m 其中，我們主要采用了s e c m 的電流反饋模式( 圖1 3 a 和圖1 - 4 ) ，它是 s e c m 應用最廣泛的主要進行定量分析的工作模式。 在反饋模式( 如圖1 4 ) 下，微電極作為掃描電化學顯微鏡的探頭，電荷在 探頭和對電極之間流動，研究的樣品作為基底，溶液中含有氧化還原電對。 圖1 4s e c m 的反饋模式示意圖，( a ) 探針遠離基底，o 向電極的擴散形成穩(wěn)態(tài)電流。， 電極反應為o + h e 寸矗；( b ) 探針接近導體基底，o 在基底重新生成，發(fā)生正反饋，使 i r 。 ( 正反饋) ；( c ) 探針接近絕緣基底，o 向電極的擴散受到阻礙，使 。，這種現(xiàn)象稱為 “正反饋 ( 圖1 4 b ) ；反之，將探針移至絕緣基底上方，即擴散到基底的還 原劑r 與基底不發(fā)生氧化還原作用，無法重新獲得。而使o 向探針表面的擴散 無法得到及時補充，o 不斷消耗，將隨探頭靠近基底而減小，即i r n 2 ) 時，根據(jù)折射定律，五s m 麗o , = 詈，若入射角。l 大于臨界角o c s m 以 ，l l 9 碩士學位論文 第一章緒論 ( p ：a r c s m 壘) ，即s i n 鼠 s i n o ：，會有s l ，此時沒有折射光，光c n 2 i n 0 2。 線全部返回棱鏡中，發(fā)生了全反射( 如圖1 - 6 b ) 。 在全反射情況下，電場在金屬和棱鏡的界面處并不立即消失，而是以消逝波 的形式沿垂直于界面方向向金屬中呈指數(shù)衰減。消逝波沿x 軸向( 與界面平行) 傳播的波矢量分量后，為： 顫= ( n o c o c ) s i n o 公式( 1 4 ) 式中，n o 為棱鏡的折射率，彩為入射光波在真空中的角頻率，p 為入射角，c 為 入射光在真空中的速度。 同時，消逝波與金屬薄膜中的自由電子相互作用，激發(fā)出沿金屬導體表面?zhèn)?播的表面等離子體子體波( s u r f a c ep l a s m o nw a v e ，s p w ) 一種在金屬表面 振蕩的電磁波，其沿x 軸方向與表面平行的固有波矢為： 2 詈( 羔) 1 ，2 公式( 1 - 5 ) 式中，緲為入射光波在真空中的角頻率，c 為入射光在真空中的速度，、乞分 別為金屬和介質(zhì)的介電常數(shù)。 頻率為由消逝波引發(fā)的s p w 的頻率與消逝波的頻率相同，當入射光的角度 或者波長發(fā)生適當?shù)母淖?，消逝波在x 軸的波矢分量也與s p w 沿x 軸方向的固 有傳播波矢滿足： k x = k s p 公式( 1 6 ) 消逝波與s p w 發(fā)生共振，入射光的大部分能量被s p w 吸收，使得反射光能 量急劇下降，從而出現(xiàn)共振吸收峰。由于發(fā)生了入射光的能量吸收，這種全反射 形式也被稱為衰減全反射( a t t e n u a t e dt o t a lr e f l e c t i o n ，a 1 限) 。由公式1 - 4 可知， s p w 的忌。與金屬折射率及光疏媒質(zhì)折射率有關。理論計算表明【5 0 1 ，當光疏媒質(zhì) 折射率發(fā)生極細微的變化時，將會相應的改變共振吸收峰的位置。s p r 傳感技術 就是利用上述原理對金屬表面的被分析物進行檢測的。 s p r 具有兩個基本模型( 見圖1 7 ) 堋。模型和k r e t s c h m a n n 模型，而 本實驗采用k r e t s c h m a n n 模型。在k r e t s c h m a n n 模型( 圖1 7 b ) 中，將幾十納米 1 0 碩士學位論文 第一章緒論 厚的金屬膜直接覆蓋在棱鏡底部，待測物質(zhì)在金屬膜下面，消逝渡透過金屬薄膜， 在金屬介質(zhì)界面處發(fā)生表面等離激元共振現(xiàn)象。在這種模型中，由于消逝波必 須透過金屬膜才能產(chǎn)生s p r 現(xiàn)象，因此金屬膜的厚度對測定結(jié)果會有很大的影 響。若厚度超過消逝波的有效深度，則消逝波在金屬膜內(nèi)會有很大衰減，無法達 到金屬價質(zhì)界面。若金屬膜過薄，則不能達到最佳共振效果。 睦鏡f 。 舟磺址 盒h 層o ( a ) o t t o 轆塹 圖1 7 兩種s p r 模型示毒圖 f i g l s p r m o d e ls c h e m e s 實驗前還需調(diào)節(jié)檢測器的位置，使反射光吸收最大的部分( 即“黑線”) 落 在單元a 和b 的中間，此時( a b ) 的信號值為零，檢測器對黑線的位移極為敏感。 當金膜表面的厚度或折射事發(fā)生了變化，s p r 共振角偏移，黑線將離開平衡位置 相應地，( a b ) ( a 十b ) 的信號值隨時問的變化被記錄下來，生成s p r 圖，如圖1 - 8 所示。 - 匝 圖i - 8 “黑絨”的產(chǎn)生與s p r 感應囝 f i 9 1 - 8s p r i n f l u c a e e e h a r t 芎， 碩士學位論文第一章緒論 3 1 聯(lián)用技術的基本原理 固i - 9s e c m s p r 聯(lián)用技術研究m t 金屬結(jié)合的實驗裝置示意圖0 2 1 ，s e c m ( m o d e l c h l 9 0 0 ) 通過控制壓電控制器束移動探針，自制的s p r 議器用干收集s p r 信號，s p r 信號通過由 l a b v i e w 程序控制的敏據(jù)收集裝置記錄，s e c m 和s p r 杖器可由同一臺計算機控制，探針生 成氧化刺( 0 ) 對膜上具有氧化還原性質(zhì)部分進行氧化作用從而產(chǎn)生膜的局部厚度變化， 插圖：( a ) 探針上生成了氧化荊0 ；( b ) 氧化荊。以擴散控制速率生成時擴散帶圖示， 值得注意的是被激光光斑照射到的區(qū)域比擐針的尺寸大很多，并且在分子取向改變的同時， s p r 共振角的位置( 黑線處) 已經(jīng)從( a ) 變化到( b ) f i g1 4s e c m s p rc o m b i n a t i o nf o rs t u d i e so fi n t e t a c f i o n b e t w e e nm ta n dm e t a l l i cl o d “ s e c m ( m o d e lc h l9 0 0 ) h pi s c o n t r o l l e db yp i e z oc o n t r o l l e r , s p rs i g n a li sc o l l e c t e db y h o m e - m a d es p ra p p a r a t u si n g e t ：s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o n so f t h e d i f f e s i o nz 鶴a t t h e m o m f m t t w h e noi sg e n e r a t e da tt h et i p ( 曲a n da tt h et i m ew h e n0i sp r o d u c e da tt h ed i f h t s i o n - e o n t r o l l e d k ( b ) ，n o t i c e t h a t t h ea r 嘲i l l u m i n a t e db y t h e l a s 盯s p o t i s m u c hg r e a l e r t h a n t h e t i ps i z ea n d t h e p o s i t i o n o f t h e s p r d i p ( d a r k l i n 砷h a sc h a n g e d f r o m ( 時t o ( 吣u p o n t h e m o l e c u l a r o r i 釉t a t i o n c h a n g e 以圖l 一9s e c m s p r 聯(lián)用技術的實驗裝置圖所示為例，s e c m 探針和電解池 直接放置在s p r 基底上方1 1 2 i 。我們應用s e c m 的電流反饋模式，采用i 電極體 系，其中，金超微電極探針( u m et i p ，半徑為) 作為工作電極，a g a g c l 和 鉑絲分別作為參比電極和對電極。實驗中，利用s e c m 的反饋模式將探針和基 底間距逼近為d ，在電解池中注入含電化學活性物種r ( 還原態(tài)物質(zhì)，可被氧化) 的溶液，使探針電極和基底均處于溶液之中。當探針上所加電位足夠正以使r 碩士學位論文 第一章緒論 氧化為o ，再利用探針生成的氧化態(tài)物種。與基底物質(zhì)a 發(fā)生作用，即采用間 接誘導方式使基底物質(zhì)產(chǎn)生構(gòu)象變化a ，從而引起局部膜厚變化，s p r 共振角 位移發(fā)生改變。s e c m 探針與s p r 基底上發(fā)生反應如下： s e c m 探針：r n e - 專o s p r 基底：o + a j a 反應( 1 2 ) 反應( 1 - 3 ) 反應( 1 3 ) 中，a 為組裝在s p r 基底上的物質(zhì)，a 為a 的氧化產(chǎn)物。 1 2 金屬硫蛋白 金屬硫蛋f j ( m e t a l l o t h i o n e i n ，m t ) 廣泛存在于人和動物的實質(zhì)性臟器中。由 于m t 與金屬離子有很強大的螯合力，它具有重要的生物學功能，主要涉及：( 1 ) 體內(nèi)必需金屬元素的儲運、代謝和精細調(diào)節(jié)，使機體達到最佳生理狀態(tài)；( 2 ) 通 過與重金屬離子配位結(jié)合成無毒或低毒絡合物，從而消除汞、鉛、鎘、砷等重金 屬的體內(nèi)毒害作用；( 3 ) m t 能通過巰基和自由基結(jié)合來清除體內(nèi)的自由基，并對 自由基損傷有修復作用，抗生物氧化，防止機體衰老，并因其抗x 射線及u v 能力大于一般細胞而具有減輕電離輻射對細胞的損傷的作用；( 4 ) 調(diào)控金屬酶或 轉(zhuǎn)錄因子的活性，抗應激反應，增強機體對各種不良狀態(tài)的適應能力；( 5 ) 參與 調(diào)控細胞分化和信號傳導；( 6 ) 調(diào)控細胞代謝，防止細胞癌變?？梢?，研究m t 的金屬結(jié)合有著重要的現(xiàn)實意義。 1 2 1金屬硫蛋白的定義和結(jié)構(gòu) 金屬硫蛋白( m e t a l l o t h i o n e i n ，m t ) 是細胞內(nèi)一類富含巰基、性質(zhì)獨特、可 誘導的低分子量非酶金屬蛋白質(zhì)或多肽，m t s 的化學名為金屬硫組氨酸三甲基 內(nèi)鹽，它具有以下特征【5 3 】： a ) 低分子量，大多數(shù)約為6 0 0 0 7 0 0 0 道爾頓，含有6 0 - 6 3 個氨基酸殘基， 脫去金屬后即為硫蛋白( t h i o n e i n ，a p o m t ) ，相對分子質(zhì)量6 0 0 0d a ) b ) 特征氨基酸組成( 含有高達2 3 3 3 的半胱氨酸殘基、沒有二硫鍵、不 含芳香族氨基酸和組氨酸) ； c ) 獨特的氨基酸序列結(jié)構(gòu)( 半胱氨酸殘基在氨基酸一級序列中的分布極為 保守性，分布有特征性，如：c y s x - c y s ，其中x 代表除半胱氨酸外的 其它一個或多個氨基酸) ； 1 3 碩士學位論文第一章緒論 以圖1 1 0 兔肝m t 2 的一級結(jié)構(gòu)為例： 圖1 1 0 兔肝m t 2 a 的氨基酸序列5 1 】 f i g 1 1 0p r i m a r ya m i n oa c i ds e q u e n c eo f r a b b i tl i v e rm t - 2 a t 5 1 1 d ) 金屬硫醇鹽的光譜特征，所有半胱氨酸殘基均以還原態(tài)存在，通過巰鍵 與金屬離子結(jié)合，因此具有金屬巰基化合物的光譜學特性，如z n m t 的最大吸收值在2 2 0n l t l ，c d m t 在2 5 0n i n ，而c u - m t 則在2 7 0n i l l ； e ) 金屬硫醇鹽族結(jié)構(gòu)，每個m t 可結(jié)合7 個二價金屬離子，如c d 2 + 、z n 2 + 、 h 礦，或1 1 1 8 個一價金屬離子，如c u + 、a 礦。 根據(jù)結(jié)構(gòu)和來源的不同，金屬硫蛋白可以被分為以下三類【5 2 】： 第1 類：所有脊椎動物的金屬硫蛋白和具有明顯相關結(jié)構(gòu)的其它門類動物的 金屬硫蛋白； 第1 i 類：一級序列與哺乳動物金屬硫蛋白無關或關系很遠的金屬硫蛋白類 型，如海膽，玉米，酵母和一些原核生物( 藻類) 中的金屬硫蛋白； 第1 u 類：植物中的金屬硫蛋白，實際是一些典型的含有 r 谷胱甘肽單位的 多肽，是較短的非轉(zhuǎn)錄合成的金屬硫肽。 所有第1 類和第1 i 類m t 均為單鏈，哺乳動物m t 含有6 1 6 2 個氨基酸殘基， 一些非哺乳動物和真菌中的m t 的肽鏈則很短，如粗糙胞霉菌m t 中僅有2 5 個 氨基酸殘基；第1 i i 類m t 通常是由不同長度的兩條或更多的肽鏈組成的寡聚體 結(jié)構(gòu)。 哺乳類m t 包含6 1 6 2 個氨基酸殘基，2 0 個半胱氨酸【5 3 】。在無脊椎動物和 真菌中發(fā)現(xiàn)更短的肽鏈，如p r i n z 和w c s e r 發(fā)現(xiàn)釀酒酵母x 一2 1 8 0 1 a a 菌株中的 c u m t 含5 3 個殘基，1 2 個半胱氨酸【1 0 6 。最短的多肽鏈存在于粗糙脈孢菌m t 中，該m t 含2 5 個殘基，7 個半胱氨酸。而某些高等植物m t 是由兩條或更多 條長度不等的多肽鏈構(gòu)成的低聚物。 1 4 碩士學位論文第一章緒論 圖1 - 1 1m t 的三級結(jié)構(gòu)【5 3 1 f i g 1 i1t h et e r t i a r ys l r u c t u r eo fm t - 2 a i s 3 經(jīng)核磁共振、x 射線等技術研究發(fā)現(xiàn)，雖然不同m t 中氨基酸順序不同，但 空間結(jié)構(gòu)卻相似，即m t 整個分子呈啞鈴形，由a 和d 兩個大小相近的球形結(jié)構(gòu) 域組成，即氨基端的1 2 9 殘基形成b 結(jié)構(gòu)域，羧基端的3 1 - 6 1 殘基形成q 結(jié) 構(gòu)域，兩個結(jié)構(gòu)域通過第3 0 ，3 1 位的l y s 殘基( 鉸鏈區(qū)) 相連，m t 鉸鏈區(qū)的存在 使2 個結(jié)構(gòu)域存在較大的柔性和可變性，從而使m t 中的金屬離子與溶液中的金 屬離子易于交換，除此之外，兩個結(jié)構(gòu)域中的金屬也可