（農產品加工及貯藏工程專業(yè)論文）菊粉酶高產菌株的生物學特性研究.pdf

摘要 本論文以菊粉酶的高產菌株a s p n i g e rm 8 9 、a s p n i g e rh 8 和突變菌株 a s p n i g e ruy - 2 為研究對象，對三株菌的主要生物學特性進行了研究。研究內容 包括菌株形態(tài)學研究、菌株所產酶系的研究和菊粉酶基因序列的研究。 在菌株形態(tài)學研究方面，對三株高產菊粉酶菌株在察氏培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、 p d a 培養(yǎng)基、同化亞硝酸鹽培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)；顯微鏡下的分生孢子頭、分生孢子 梗、足細胞、頂囊等個體形態(tài)；掃描電鏡下的分生孢子表面形態(tài)等方面做了較系統(tǒng)的 研究。根據資料可將菌株a s p n i g e rm 8 9 和a s p n i g e rh 8 鑒定為黑曲霉群泡盛酒 曲霉種( a s p e r g i l l u sa w a m o r i ) ，誘變菌株爿印n i g e r uy 一2 可鑒定到黑曲霉群臭曲 霉種( a s p e r g i l l u s ，0 e t i d e s ) 。誘變使菌落形態(tài)發(fā)生了很大的變化。并且通過此方 面的研究建立起一套簡便有效的用于霉菌形態(tài)鑒定當中樣品的處理方法。 對菌株所產酶系的研究方面，分別測了菊粉酶、蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、纖維 素酶的產生曲線。此三株菌株除高產菊粉酶外，均產生不同水平的蛋白酶、淀粉酶、 果膠酶、纖維素酶，其中菊粉酶的產酶水平較高，產其他酶系的活力相對較低。誘變 菌株除菊粉酶活力大幅度提高以夕 ，淀粉酶和果膠酶也有明顯提高。對于同一菌株來 說酶系中不同酶的產酶高峰不同，酶量高峰出現(xiàn)的早晚不同。其酶活力高峰隨發(fā)酵時 間依次是蛋白酶、淀粉酶、菊粉酶和果膠酶，纖維素酶因不同菌株有一定差異。 針對6 e n b a n k 所報道的四種來源于黑曲霉菌株的菊粉酶序列，分別設計引物，以 本研究菌株基因組d n a 為模版，進行p c r 擴增，并進行了核苷酸序列的測序。測序結 果與原序列進行了同源性比較分析，同源性并不高，可以推測本研究菌株所產菊粉酶 基因序列與所報道的有所不同。 關鍵詞：黑曲霉：菊粉酶：生物學特性；形態(tài)學；酶系；分子生物學 s t u d yo nb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fs t r a i n sw i t hh i g hi n u l i n a s e “ a c t i v i t y a u t h o r ：z h a n g ，r u i l i n g t u t o r ：j i a ，y i n g m i n m a j o r ：f o o dm i c r o b i o l o g y a b s t t a c t a s p e r g i l l u sn i g e rm 8 9 ，a s p n i g e rh 8a n da s p e r g i l l u sn i g e ru 丫一2 a r ea l l i n u l i n a s eh i g h y i e l d i n gs t r a i n s ，w h o s em a j o rb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sh a v eb e e ns t u d i e d i nt h i sp a p e r t h er e s e a r c hc o n t e n ti n c l u d e st h es t u d i e so nm o r p h o l o g y ，m a j o re n z y m e s y s t e m so ft h es t r a i n sa n dt h ep r e l i m i n a r ys t u d yo fi n u l i n a s eg e n e s f o rr e s e a r c h i n gt h em o r p h o l o g i e so ft h es t r a i n s ih a dt u r n e dt h es t r a i n sr e s p e c t i v e l y i nc z a p e k 、m e a 、p d aa n dc u l t u r em e d i at h a tc o u l da s s i m i l a t en i t r o u sa c i ds a l tt oo b s e r v e t h ec h a r a c t e r so ft h em o r p h o l o g i e so ft h ec o l o n i e s a tt h es a m et i m et h eo b s e r v a t i o no ft h e m i c r o s c o p i c a lf e a t u r eo ft h ei n d i v i d u a ls t r a i na n d t h eo b s e r v a t i o no ft h ec o n i d i u mo ft h e s t r a i nb yt h es c a n n i n ge l e c t r o n i cm i c r o s c o p ea r ed o n e a c c o r d i n gt ot h ei n f o r m a t i o nw e d i v i d ea s p n i g e rm 8 9a n da s p n i g e rh 8i n t oa s p e r g i l l u sg e n u s ，a s p e r g i l l u sn i g e r s e c t i o n a s p e r g i l l u sa w a m o r is p e c i e s t h em u t a n t s t r a i na s p n i g e r i a 丫一2c a nb e d i v i d e di n t o a s p e r g i l l u sg e n u s ，a s p e r g i l l u sn i g e rs e c t i o na s p e r g i l l u s f o e t i d e ss p e c i e s t h em u t a n tm a k e st h em o r p h o l o g yo ft h ec o l o n yc h a n g e dg r e a t l y as e to fe a s ya n d h i g h e f f i c i e n tm e t h o d su s e dt oi d e n t i f yt h em o r p h o l o g i e so ft h em o u l dw e r es e tu pt h r o u g ht h o s e s t u d i e s o nt h er e s e a r c ho fe n z y m es y s t e mp r o d u c e db yt h es t r a i n s ，w eh a dm e a s u r e dt h e g r o w i n gc u r v e so ft h ei n u l i n a s e 、p r o t e a s e 、a m y l a s e 、a m y l a s e 、 a n dc e l l u l o s ee n z y m e e x c e p t i n gt h eh i g hy i e l d i n gi n u l i n a s e ，t h i st h r e es t r a i n sa l s oh a v ed i f f e r e n tl e v e l si n p r o t e a s e 、a m y l a s e 、p e c t i n a s e 、a n d c e l l u l o s ee n z y m e a m o n gt h e s e ，t h ep r o d u c t i o no ft h e i n u l i n a s ei sh i g h e rt h a nt h eo t h e r s b e s i d e st h ei n u l i n a s ea c t i v i t yo fm u t a n ts t r a i na s p n i g e r uy - 2r a i s e ds u b s t a n t i a l l y a m y l a s ea n dp e c t i n a s ea l s oh a v eb e e no b v i o u s l yr a i s e d f o r d i f f e r e n te n z y m eo ft h es a m es t r a i n ，t h et i m ei sd i f f e r e n c et h a tr e a c h e st h eh i g h e s te n z y m e a c t i v i t y f o l l o w e dt of e r m e n tt i m e ，p r o t e a s e ，a m y l a s e ，i n u l i n a s ea n dp e c t i n a s er e a c h e st h e h i g h e s te n z y m ea c t i v i t y c e l l u l o s ee n z y m eh a sc e r t a i nd i s c r e p a n c yb e c a u s eo fd i f f e r e n t s t r a i n s a c c o r d i n gt ot h ef o u rk i n d so fs e q u e n c ef r o ma s p e r g i l i u sn i g e rs t r a i n sr e p o s e db y g e n b a n k ，p r i m e ra r ed e s i g n e dr e s p e c t i v e l y ，g e n o m i cd n a o ft h e s et h r e es t r a i n sa r e t a k e na sm o u l d t h e np c ri sc a r r i e do u ta n dn u c l e u ss e q u e n c ei st ob em e a s u r e dn e x t t h e r e s u l to fm e a s u r e m e n ta n do r i g i n a ls e q u e n c e 黜a n a l y z e d w h i c hp r o v e dt h a tn u c l e o t i d e s e q u e n c ei d e n t i f i e sa r en o th i g h i ti sp o s s i b l et od r a wac o n c l u s i o nt h a tg e n es e q u e n c eo f i n u l i n a s ef r o ma s p e r g i l l u sn i g e ri sd i f f e r e n tf r o mt h a tr e p o r t e d k e y w o r d ：a s p e r g i l l u sn i g e r ；i p u l i n a s e ；b i o l o g i c a lp r o p e r t y ；m o r p h o l o g y e n z y m es y s t e m ：m o l e c u l a rb i o l o g y 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得 的研究成果。據我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包 含其他人已經發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得洹j t 壅些太堂或其它 教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的 任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 學位論文作者簽名：j 鬈嘶玲 簽字日期： c j 即4 年f 月書日 關于論文使用授權的說明 本學位論文作者完全了解泣j 盔些太堂有關保留及使用學位論文的規(guī)定，有 權保留并向國家有關部門( 機構) 送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查( 借) 閱。本人授權洹j s 壅些太堂可以將論文的全部或部分內容編入有關數據庫進行 檢索，可以采用影印、縮印或掃描等方法加以保存或編成學位論文。 ( 保密的學位論文在解密后應遵守此協(xié)議) 學位論文作者簽名： 易哳於 簽字日期：o z r o , t 年月瑪日 導師簽名 圜 簽字日期： 一一厶年月矗e t | 菊粉酶高產菌株的生物學特性研究 1 1 本研究的意義和目的 1引言 菊粉酶( i n u l i n a s e ，e c 3 2 1 ) 是一類水解菊粉b 一2 ，1 - 果糖苷鍵的酶”。1 。菊粉酶按其對底物 的作用方式分為兩類：一類是b - d 呋喃果糖苷水解酶( b - d f r u c t a nf r u c t a n o h y d r c l a s s e ， e x o i n u l i n a s e ，e c3 2 1 8 0 ) 。為外切酶，它作用于菊粉鏈的非還原末端，逐一釋放果糖，產物為果 糖及少量葡萄糖，用于制各高純度果糖。另一類是2 ，1 - b - d 果聚糖水解酶( 2 ，! 一b - d f r u c t a n f r u c t a n o h y d r o l a s s e ，e n d o i n l i n a s e ，e c 3 2 1 7 ) ，屬內切酶，它隨機地切斷菊粉內部的某個b - 2 ，1 糖苷 鍵，生成低聚果糖及少量果糖，用于制備低聚果糖。 制備果糖可通過酸法和酶法生產得到。酸水解法需在高溫條件下進行，一方面色素重，無機 離子含量高，副產物多，分離精制難，去除它們不但增加成本，且污染環(huán)境；另一方面生產的果 糖褐變嚴重，改變果糖應有的風味因此具有一定的局限性。酶法生產是在溫和條件下進行。目 前工業(yè)化生產果糖糖漿是采用玉米淀粉為原料，通過。一淀粉酶和糖化酶的作用，將淀粉水解為葡 萄糖，又通過葡萄糖異構酶將葡萄糖異構轉化為果糖，生成含4 2 一4 5 果糖的果葡糖漿。并且 如果想提高果糖的含量就需要增加許多純化步驟，如通過離子交換柱法去除葡萄糖和剩余的蔗 糖。此工藝過程復雜，轉化率低，成本高。難以滿足市場的需要。而利用菊粉酶一步法水解菊粉 生產果糖產品，不僅工藝簡單，而且果糖含量可提高到9 0 9 5 v “1 ，由于其果糖含量高，亦可 稱為“超高果葡糖漿”( u h f g s ) ( u l t r ah i g hf r u o t o s eg l u c o s es y r u p s ) 。菊粉酶是一步法生產高果 糖漿的唯一重要酶種。此法是果糖生產的理想途徑，具有巨大的工業(yè)化生產潛力。 工業(yè)上低聚果糖的生產通常采用兩種方法：一種是由蔗糖經b 一果糖轉移酶( 1 3 - f r u c t o s y l t m n s f c r a s e ) 或轉化酶( i n v e n a s e ) 的轉果糖基反應而生成的蔗果糖類，其產品中副產物葡萄 糖和蔗糖多，反應不易控制。而另一種力法由內切型菊粉酶水解菊粉生成低聚果糖時。產物僅為 低聚果糖和少量果糖，純度高，成本低，降解率通?？蛇_7 0 左右“4 。 因此利用菊粉酶是制備果糖或果糖糖漿制品極具發(fā)展?jié)摿Φ挠行緩健?果糖熱量低，甜度高( 是蔗糖的1 5 2 倍) ，代謝不依賴胰島素，可以很好地克服葡萄糖、 蔗糖所帶來的影響礦物質元素吸收，引起兒童齲齒，中老年人糖尿病，高血壓，肥胖癥等副作用 ”】。因此，果糖是理想的食品用糖。低聚果糖( f r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e s ，f o s ) 是一種功能性糖，其聚 臺度一般為2 7 。低聚果糖是雙歧桿菌的增殖因子，具有調節(jié)胃腸功能，提高免疫力，改善脂質 代謝，降低血脂和膽固醇促進微量元素鐵、鈣的吸收利用，有利于維生素的吸收，能量低，攝 入后不易致肥胖等多種生理功能。是一種純天然、高效能、無公害的綠色食品和飼料添加劑。開 發(fā)低聚果糖產品具有廣闊的市場前景”。在注重營養(yǎng)保健的今天，果糖及其果糖糖漿制品的開發(fā) 是食品：i ：業(yè)發(fā)展的需要。 菊粉，又稱菊糖i n u l i n ，是由d 呋喃果糖分子通過0 2 ，1 果糖苷鍵相連而成的多聚果糖，其 還原端接一個葡萄糖殘基，以a 1 , 2 鍵與之相連，呈直鏈結構。一般長約2 5 3 5 個果糖單位，分 子最約5 0 0 0 d a 。其鏈長及分子量大小隨植物種類，氣候條件，收獲季節(jié)及作物成熟度有關1 。 河北農業(yè)大學碩士學位論文 菊粉微溶于4 。c 冷水中，易溶于8 0 。c 熱水。與碘不呈顏色反應，無還原性，有旋光性，在水中為 左旋fa 】。2 0 柏。菊粉具有許多生理功能，特別是能選擇性促進雙歧桿菌、乳酸苗和醋酸桿菌的生 長，調節(jié)腸道內微生物區(qū)系的組成；并且還是一種膳食纖維復合物。菊粉是一種貯存性的多糖類 物質，廣泛存在于菊芋( h e l i a n t h u st u b e r o s u s ) 、菊苣( c i c h o r i u me n d i v i a ) 、大麗花( p a h l i ap i n n a t a ) 、 牛蒡( a r c t i t ! ml a p p d ) 等多種植物中”2 ”j ，其中以菊芋晟具代表性。 菊芋( h e l i a n m “jt u b e r o s u s ) ，俗名洋姜。菊科，向日葵屬，多年生草本植物”“。在菊芋 的塊莖中含有人體所需的各種必需氨基酸，并含有較多的多糖，其中菊糖的含量尤為顯著，能達 到干重的7 0 8 0 1 1 6 - 1 7 。人們在對鮮菊芋進行測定時，結果表明，鮮菊芋塊莖中含水7 9 8 ，碳 水化合物1 6 ，6 蛋白質1 o ，粗纖維o 6 ，其中碳水化合物的7 8 為菊糖，除此而外，每1 0 0 9 鮮菊芋塊莖含c a ：4 9 m g 、p ：1 1 9 m g 、f e ：8 4 m g ；含v r n ：0 1 3 m g 、v b 2 ：0 0 6 m g 、v p ：0 6 m g 、 v c ：6 m g 等n 8 】。而且菊芋這種植物分布廣，在我國南北各地均有栽培：適應性強，耐貧瘠，耐寒， 耐早；種植簡易，一次播種多次收獲；產量高，價格低廉，是一種寶貴的半野生資源，是制各果 糖產品的良好原料，具有極大的開發(fā)利用價值。 因此，利用菊粉酶水解菊芋浸汁生產果糖產品，深入開展菊粉酶研究，開辟對人體具有保健 作用的果糖產品生產的新途徑，不僅具有重大的經濟價值，并且給食品工業(yè)的發(fā)展，改善人們的 飲食結構，提高食品的營養(yǎng)品質帶來革命性進步。 菊粉酶主要產生于菊科植物及部分微生物當中。來源于菊科植物組織的菊粉酶底物專一性 強，僅作用于菊粉m 】；微生物菊粉酶普遍底物專一性較差，大部分都能水解有b 一2 ，1 呋喃果糖健 的菊粉，蔗糖和棉籽糖，屬反應專一性。從菊芋( j e r u s a l e ma r t i c h o k e ) 塊根、菊苣( c h i c o r y i n t y b u s ) 根或大麗花( d a h l i s p i n n a t a ) 等植物的根中都能提取到菊粉酶。但從植物中得到的菊粉 酶畢竟數量有限，不能形成生產規(guī)模，并且其作用范圍和穩(wěn)定性也不如微生物來源的酶類。而微 生物代謝旺盛，生長繁殖速度快，所以從微生物中挖掘菊粉酶的來源更有現(xiàn)實意義。利用微生物 所產的菊粉酶產量高，周期短，來源豐富，成本低廉。因此，對于微生物菊粉酶的進一步研究具 有重要的生產意義?？梢哉f微生物是菊粉酶工業(yè)化應用的唯一來源。因此國內外對菊粉酶的研究 主要集中在微生物資源上，其中霉菌和酵母菌是微生物中研究的熱點。從總體上看大多數微生物 產生的菊粉酶包括三部分，存在于細胞內的胞內酶、固定存在于細胞壁的細胞壁酶和分泌到細胞 外的胞外酶，不同菌種菊粉酶在細胞上的分布不一樣。研究表明，酵母菌所產菊粉酶的含量中胞 內酶高于胞外酶 2 1 - 2 2 ，而由霉菌所產生的菊粉酶以胞外酶為主。胞外酶的分離提取更容易。所 產酶的最適溫度，熱穩(wěn)定性很高，而且適宜偏酸性的環(huán)境，對于其在提高果糖產品的工業(yè)化應用 效率以及生產上防污染十分有利。 由于菊粉酶在食品工業(yè)中的巨大應用潛力，歐洲、日本等國家已經做了大量的t 作。包括菌 株篩選“，產酶條件誘變育種，酶的分離純化“】及酶學性質，酶的固定化“等方面，另外關 于菊粉酶分子生物學方面的研究也有相關報道。國內關于菊粉酶的研究始于9 0 年代。目前關于 菊粉酶的生產化應用絕大多數仍停留在實驗寶階段，并且中試結果的報道也不多。阻礙其工業(yè)化 生，“的主要原因是由于產酶菌株產酶量低，產酶成本高”“1 。將菌株應用于工業(yè)化生產最大的要 求就是使微生物的產酶量大大提高，并且能夠最大限度的外泌。而要解決此問題，進行菌株培育 以及構建基因工程菌株是探索提高菊粉酶表達量的重要方法。而對菌株的深入研究，有關信息的 全面掌握是更好地達到此目的的首要步驟。 菊粉酶高產菌株的生物學特性研究 霉菌當中的黑曲霉f a s p e r g i t l u sn 晡e r j 是自然界中普遍存在的一類真菌。由于其具有多種活性 強大的酶系，已被廣泛的應用于工業(yè)生產。黑曲霉是美國f d a ( f o o da n dd r u ga d m i n i s t r a t i o no f u s a ，食品與藥品管理局 美 ) 批準為用于食品工業(yè)的安全菌種之一，具有g r a s ( g e n e r a l l y r e c o g n i z e da ss a f e ) 資格。因此由黑曲霉所產的酶類也便具有了安全性好，應用范圍廣的優(yōu)點。 目前，國內外學者對很多食品用酶類的研究集中在黑曲霉來源上。研究較多的主要有蛋白酶”+ 圳 果膠酶”1 、淀粉水解酶1 3 3 - 3 a j 、纖維素酶1 3 5 3 等等。由于黑曲霉在制曲過程中產生豐富的淀粉酶、果 膠酶、纖維素酶等常被用于谷物原料的分解。1 9 5 3 年起，我國的酒精工業(yè)開始采用黑曲霉制曲， 使淀粉利用率由米曲霉的7 0 增加到8 0 以上。國內酶法生產葡萄糖所選用的高活性糖化酶生產 菌種也都是黑曲霉的突變株。另外，目前國內外飼料工業(yè)中為了提高飼料的利t l = j 率，越來越廣泛 地使用酶添加劑，其原因是，人們對動物食品的需求不斷增長，但是生產飼料的原料卻越來越貧 乏，同時，使用刺激生長的藥物或化學試劑，其效果有一定的局限，而且還受到消費觀念和各國 立法的限制。而添加酶制劑，不僅可開發(fā)利用低等原料、擴大飼料生產的原料來源，而且還可提 高飼料的消化率、消除飼料中的反營養(yǎng)因子、促進動物對營養(yǎng)物的充分利用。飼料用酶主要是由 蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、果膠酶等多種水解酶構成的復合酶。飼料酶制劑生產的關鍵是要有 產酶活性高的菌種，目前多采用霉菌作為飼料酶生產菌。其中黑曲霉不僅可以發(fā)酵生產多種水解 酶，大大降低成本，而且具有高度的安全性只要選用的原料符合飼料的衛(wèi)生要求，即可直接作 為飼料掭加劑。另外，在世界需求量不斷增長的檸檬酸行業(yè)中，黑曲霉所起的作用更是毋庸置疑 的。可見研究黑曲霉在工業(yè)生產中有著重大的實際意義。 黑哇掃霉多數情況下是作為群的概念而出現(xiàn)。黑曲霉群下種的劃分，存在著形態(tài)以及生物學特 性的分布多樣性。本研究室多年工作獲得了高產菊粉酶的黑曲霉菌株a s p n i g e r m 8 9 和黑曲霉 a s pn i g e r h 8 。并且對野生菌株黑曲霉a s p n i g e r m 8 9 進行了四輪紫外線誘變和兩輪“c oy 射線誘 變選育，得到了菊粉酶高產菌株a s p ，n 蛹e r uy - 2 。在前期的一 作中發(fā)現(xiàn)三株菌在營養(yǎng)條件、產酶 條件、酶活性大小等方面存在著顯著差異“”j 。研究它們之間生物學特性的異同，是探討整個黑 曲霉群生物學特性的窗口。對本實驗室獲得的菌株進行系統(tǒng)的研究具有重要的理論與實踐意義。 可以進一步研究目前尚不完備的黑曲霉群中種的分類鑒定：可以發(fā)掘具有重要現(xiàn)實意義的生產復 合酶系的菌種；可以探討各種酶類在黑曲霉的發(fā)酵生產中的彼此關系，相互影響；可以探討菌種 誘變后，菊粉酶大量表達的誘變機理：可以進一步以已知菌株為基礎，開展菊粉酶高產菌株的培 育，可以通過研究高產菌株的菊粉酶基因構成，建立p c r 技術，為進一步利用現(xiàn)代生物技術， 培育菊粉酶高產菌株提供理論依據，為菊粉酶能大量表達，高產酶活奠定基礎。 1 2 該研究的國內外進展 1 2 1 微生物菊粉酶的來源 菊粉酶多來源于菊科植物和微生物，對于微生物來源的菊粉酶自1 9 1 4 年k l u y v e r 證實了 k l u y v e r o m y c e s f r a g i l i s 能利用菊粉，1 9 2 4 年p r i n g s h e i m 首次報道了a s p e r g i l l u sn i g e r 能產菊粉酶 以來腳，國內外學者對微生物菊粉酶的研究逐漸深入，尤其近1 5 年，取得了一定的避展。據不 完全統(tǒng)計，產菊粉酶的絲狀真菌有1 7 個屬4 0 余種，酵母菌有l(wèi) o 個屬2 0 余種，細菌有1 2 個屬 河北農業(yè)大學碩士學位論文 1 0 余種。研究表明菊粉酶在微生物中的分布主要集中在酵母和霉菌上，細菌、防線菌報道的較少。 曾報道過的有節(jié)桿菌( a t h r o b a c t e rs p ) 3 ”，假單孢菌( p s e u d o m o n a ss p ) 蚓，枯草芽孢桿g g 自( b a c i l l u s j u b t i l i s ) t 3 9 - 4 1 】，鏈霉菌( 嘩f 彬1 4 2 和棱狀芽孢桿菌( c l o s t r i d i u mh e r t m o s u c c i n o g e n e s ) ”等。酵 母菌中研究最多的有脆壁克魯維酵母( k 1 u y v e r o m y c e sf r a g i l i s ) “，馬克斯克魯維酵母 阢m 口r x i a h “j ) t 4 6 ，釀酒酵母( s a c c h a r o m y c e sm a r x i a n u s ) 4 7 l ，假絲酵母( c a n d i d a ) ”“德巴利酵 母屬( d e b 口r 。m y c e s ) 等。霉菌有黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) f 2 。卯“1 0 4 1 無花果曲霉( a f i c u u m ) l 5 5 1 5 6 ，青霉( p e n i c i l l i u ms p ) f 2 】口”，尖鏈孢霉( f u s a r i u mo x y s p o r u m ) 網、木霉( t r i c h o d e r m a ) 5 9 1 等。下表為主要的微生物所產菊粉酶及其酶學性質。 表1 主要的徽生物所產菊糟酶及其酶學性質 t a b l e1m i c r o o r g a ni s m si n u li n a s ep r o d u ci n ga n di n u ll n a s ee n z y m o l o g y a s p e r g i l i u sn i g e r m 8 9 外切e x o ei ，e i i ，e i i i ，e i v p i e h i ay 1 0 9 b a c i u u sj “b t i l l s a s p e r g i l l u sn i g e r 正m a r x i a n u sc b $ 6 5 5 6 p e n i c i u i u ms pt n 一8 8 a s p e r g i l l u sn i g e r l 2 a s p e r g i u u sn i g e r 3 1 9 a s p f i c u u m 所產 n o v o z y m2 3 0 c o m m e r c j 鰣l n u l i n a s e 外切e x o 內切e n d o 外切e x o 內切e n d o 外切e x o 內切e n d o 內切e n d o 外切e x o 的五種外切c x o 三種內切c n d o k l u y v e r o m y c e s f r a g i l i s 外切e x o 州9 8 0 1 1 0 26 9 79 6 1 2 3 6 5 e i4 05 5 6 06 0 其余45 5 5 4 5 6 0 1 2 2 黑曲霉產菊粉酶的發(fā)酵條件優(yōu)化及誘變育種 黑曲霉被許多國內外學者作為菊粉酶生產菌株的研究對象。在黑曲霉產菊粉酶的研究當中， 為了提高菊粉酶菌株的產酶能力，進行了大量的研究工作。一方砸優(yōu)化培養(yǎng)條件。通過對培養(yǎng)條 件中各種碳源、氨源，溫度、p h 值以及金屬離子、微量元素的最佳種類與配比的研究，使菌株 4 礬 扣 6 6 孫 2 以 鉑 靳 斛 5 3 o 4 4 5 5 4 8 拍 礬 挖 舛m 弘 踮 蛇 舛 0 l o 5 o 9 o 0 0 0 2 o 叭騶阻醅 勰w 斛 菊粉酶高產菌株的生物學特性研究 產酶條件達到最佳，生產出高活力的菊粉酶。碳源研究中發(fā)現(xiàn)，多數菊粉酶菌株產酶活力與菊粉 的誘導作用有關，通常情況以菊粉作為碳源比其他碳源能夠產生更多的菊粉酶，表現(xiàn)出一定的底 物可誘導性，但d e r y c k e 研究的黑曲霉在產菊粉酶時與菊粉的存在與否無關，它的最佳碳源是麥 芽糖j 。麥芽糖、棉予糖、果糖可被多數黑曲霉菌株作為碳源，有的黑曲霉不能夠利用乳糖作為 碳源產菊粉酶”“。另外實驗表明，采用菊芋、菊苣提取液為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，比以菊糖為碳源 的培養(yǎng)基，其產酶活性要高出幾倍。本實驗室培養(yǎng)的黑曲霉uy 2 以菊芋汁為碳源的培養(yǎng)基中產 酶活力是以菊糖為碳源的5 0 4 倍。其原因可能為抽提液中除含菊粉外，還含有一部分能有效誘導 菊粉酶合成的寡聚果糖和少量有利于菌體生長的果糖和葡萄糖。菊芋抽提液中含有菊糖中缺少的 生長因子生長因子有利于菌體生長產酶。氮源研究方面發(fā)現(xiàn)，通常添加無機氮源比添加有機氮 源效果好”“。金屬離子有時對于酶活的提高有著相當的作用。k i m 和k a m u r a 研究發(fā)現(xiàn)o o lt o o l k c i 、0 0 1t o o lm g s 0 4 、00 0 1m o lf e s 0 4 對黑霉菌1 2 的菊粉酶的產生有促進作用，提高產量分別 為3 2 、2 6 、和1 2 1 。本研究室選育的a s p e r g i l l u sn 垃打uy 2 在加入1 1 5 m m o l l 的b a “時， 酶活力能夠提高1 56 。最佳的產酶條件對于黑曲霉群中不同的菌種是不同的。 然而盡管培養(yǎng)條件得到了優(yōu)化，但篩選出的野生菌株往往酶活很低且許多菌株合成菊粉酶的 能力受到分解代謝物的抑制，因此需對野生菌株誘變，以篩選出酶活高的菌株。p o o m a 等人對黑 曲霉經過誘變得到黑曲霉突變株，經產酶條件優(yōu)化后酶活可達1 2 0 u m l t ”4 “。黎明蘭等通過誘變 選育獲得黑曲霉v n 一1 9 4 9 3 ，在最適發(fā)酵條件下酶活穩(wěn)定在6 0 6 4 u m l 6 8 o羅英等對菊粉酶產 生菌a s 一4 進行了激光復合誘變獲得了突變株a s p e r g i l l u sn i g e r a l 1 5 4 酶活達到1 4 6 3 u m l ，比原 始菌株提高了3 7 5 倍1 6 。印度的v i s w a n t h a n 和k u l k a r n l 用紫外光照射一株黑曲酶野生菌株獲得 了a s p e r g i l l u s n i g e r t e l g h b 1 最高菊粉酶活力為3 7 7 u m l ，比原始菌株提高了3 倍”。n a k a m u r a 等人對an i g e r 進行6 0 c o 誘變。突變茁比野生菌酶活提高了4 倍”。本研究室通過對野生菌 m 8 9 分生孢子四輪紫外誘變和兩輪y 射線誘變獲得了一菊粉酶高產菌株a t ，i g e r u 7 2 酶活產力達 1 8 0 u m l ，是出發(fā)菌株產酶活力的3 4 5 倍”“?？梢娡ㄟ^誘變育種，可以大大提高產酶活力，但仍 然很大程度上難以達到生產的需要。并且到目前為止，關于誘變處理后除菊粉酶大量表達外對菌 株別的生物學特性的影響以及其中的誘變機理研究甚少，并且對于菊粉酶菌株誘變后其形態(tài)特征 及酶學性質的研究尚不多見。 1 2 3 黑曲霉菊粉酶基因的分子生物學特點 隨著9 0 年代生物技術的飛速發(fā)展，人們開始了對菊粉酶分子生物學方面的研究。以期通過 d n a 重組技術提高酶的表達水平及活性，通過構建工程菌株使菊粉酶在受體細胞中得到大量表 達，從而大幅度提高酶的產量。自1 9 9 1 年l a l o u x 首先構建了菊粉酶的基因文庫“從k l u y v e r o m y c e s ，r m r x i a n u s 中克隆出外切菊粉酶基因i n u l 以來，國內外學者開始了對菊粉酶分子生物學方面的研 究。對于黑曲霉所產的菊粉酶基因的研究也相繼出現(xiàn)。1 9 9 8 年o h t a ，k 【馴l 7 3 等人報道了a s p e r g i l l u s n i g e r l 2 中有兩種內切酶基因i n u a 和i n l r b ，勞且在g e n b a n k 中成功注冊。i n u a 口4 1 基因的壘長 為5 0 5 3 b p ，i n u b “”基因的全長是3 4 2 9 b p ，o r f 均為1 5 5 1 b p ，均編碼5 1 6 個氨基酸，前2 3 個為 信號肽。閱讀框中的同源性達到9 8 ，序列中有8 個氨基酸不同。g + c 分別為5 4 ，5 43 。閱 讀框以外的序列同源性達到9 2 。2 0 0 1 年s i j i n g ，j 等人，報道了a s p e r g i i i u sn i g e r 中的內切菊粉酶 5 河北農業(yè)大學碩士學位論文 e n d o i n u t i n a s e 的克隆與在畢赤酵母中的成功表達?；蛉L1 6 4 0 b p 。2 0 0 1 年w a n g ，y j 等人報道 黑曲霉a f i o 所產的菊粉酶基因全長1 5 5 1 u p 7 6 1 。2 0 0 2 年王建華等人研究的黑曲霉9 8 9 1 內切菊 粉酶基因獲得了克隆并且在畢赤酵母中成功表達m 1 ?；蛉L1 5 7 7 b p 。盡管都是從黑曲霉菌株 中獲得的菊粉酶基因克隆，但顯示出了不同菌株之間基因水平上的多樣性。 1 2 4 黑曲霉在菌物界中的分類地位” 在現(xiàn)代生物分類學中，苗物是一個界，稱菌物界( f u n g i ) ，并和植物界、動物界鼎足而立。 分類單元( t a x o n 或c a t e g o r y ) ，也稱分類單位、分類階元或分類群。和其他生物分類一樣，菌 物分類單元主要是界、門、綱、目、科、屬、種，種是分類的基本單位。在種下還有亞種、變種、 變型等等。菌物的分類單元都有相應的拉_ ：r 詞，在屬以上的分類單元還有一定的拉丁詞尾。以下是 菌物的型以上的分類階元的中名、英名、拉丁名及拉丁名稱的詞尾： 界k i n g d o m ，拉r e g n u m ：菌物界( f u n g i 或m y c e t e a e ) 亞界s u b k i n g d o m ，拉s u b r e g n u m ：非必需分類階元( 以下簡稱非必需) 門d i v i s i o n 或p h y l u m ，拉d i v i d i o 或p h u l u m ：詞尾一m y c o t a 或- m y c o 曲y t a 亞門s u b d i v i s i o n ，拉s u b d i v i s i o ：詞尾一m y c o t i n a 綱c l a s s ，拉cl a s s i s ：詞尾一m y c e t e s 亞綱s u b c l a s s ，拉s u b c t a s s i s ：非必需，詞尾一m y c e t i d a e 目o r d e r ，拉o r d o ：詞尾a l e s 亞目s u b o r d e r 拉s u b o r d o ：非- 必需，詞尾- i n e a e 科f a m i l y ，拉f a m i l i a ：詞尾，a c e a e 亞科s u b f a m i l y ，拉s u b f a m i l i a ：- t e - 必需，詞尾一o i d e a e 族t r i b e ，拉t r i b u s ：詞尾一e a e 亞族s u b t r i b e ，拉s u b t r i b u s ：t # - 必需，詞尾i n a e 屬g e n u s ，拉g e n u s 亞屬s u b g e n u s 拉s u b g e n u s 組s e c t i o n 拉s e c d o 亞組s u b s e c t i o n ，拉s u b s e c t i o ：非必需 種s p e c i e s ，拉s p e c i e s 亞種s u b s p e c i e s ，拉s u b s p e c i e s ：j b 必需 變種v a r i e t y ，拉v a r i e t a s 亞變種s u b v a r i e t y ，拉s y b v a r i t a s ：非必需 型f o r m , 拉f o r m a ：t 必需 黑曲霉通常情況是以群的概念出現(xiàn)。黑曲霉屬于菌物界回l n g i ) ，真菌f q f e u m y c o p h y t a ) ，半知 菌綱( f u n g il m p e f f e c t i i ) ，叢梗孢目( m o n i l i a l e s ) ，叢梗孢科( m o n i l i a c e a e ) ，曲霉屬( a s p e r g i l l u s g e n u s ) 黑曲霉群或稱黑曲霉組( a s p e r g i u u sn i g e r ) 。根據坂口和飯冢的黑曲霉群檢索表中將黑 曲霉群分為碳黑曲霉( a s p e r g i l l u sc a r b o n a r i u s ) 、日本曲霉( a s p e r g i l l u sj a p o n i c u s ) 、黑曲霉 ( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 、宇佐美曲霉( a s p e r g i l l u su s a m i i ) 、齋藤曲霉( a s p e r g i l l u ss a i t o i ) 、乾氏 6 菊粉酶高產菌株的生物學特性研究 曲霉( a s p e r g i l l u si n u i i ) 、或叫琉球曲霉( a s p e r g i l l u sl u c h u e n s i s ) 、金黃曲霉( a 5 p e r g i l l u sa u r e u s ) 、 泡盛酒曲霉( a s p e r g i l l u sa w a m o r i ) 等。但瑞恩認為宇佐美曲霉、乾氏曲霉可能是泡盛酒曲霉的 異名。金黃曲霉是臭曲霉( a s p e r g i l l u s f o e d d e s ) 的異名。此外，尚有肉桂色曲霉，河內氏曲霉形 態(tài)上與黑曲霉極為相似，只是分生孢子顏色極淡，做肉桂色或淺褐色，瑞恩認為是黑曲霉的突變 種。而m a r e na k l i c h 在描述曲霉種時也提到了許多學者在對種之間的劃分時存在爭議。有人將 泡盛酒曲霉認為是黑曲霉的異名，有人認為是黑曲霉的變種。并且對于泡盛酒曲霉與臭曲霉的劃 分也發(fā)生沖突。而m a r e na k l i c h 通過對菌種分生孢子的掃描電鏡觀察，認為他們屬于不同的種。 黑曲霉群以下種的劃分，至今沒有太一致的意見。 1 2 5 黑曲霉的產酶酶系 黑曲霉能夠產生多種胞外水解酶?，F(xiàn)已成為工業(yè)應用常見的菌種之一?，F(xiàn)主要的商品酶制劑 如淀粉酶、過氧化氫酶、纖維素酶、半乳糖苷酶、葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖苷 酶、半纖維素酶、橙皮苷酶、脂肪酶、柚苷酶、果膠酶、蛋白酶、單寧酶等都是來源于黑曲霉。 在美國f d a 批準的安全菌種之中以黑曲霉所產的酶類最多。我國酶制劑工業(yè)生產用菌種中，主 要的黑曲霉有黑曲霉u v l l 突變株、c p 8 5 2 1 1 和3 3 5 0 ，他們分別用于糖化酶、果膠酶、和酸性蛋 白酶的生產”“。黑曲霉酶類在工業(yè)上具有重要的作用。 黑曲霉所生產的酸性蛋白酶已在醫(yī)藥、食品制革等工業(yè)中廣泛應用。根據黑曲霉在產酸一眭蛋 白時對氮源的需要量，有人將黑曲霉分為兩類，一類需要低c n ，添加無機氮對產酶有利，屬于 這一類的有齋藤曲霉、宇佐曲霉等，另一類黑色曲霉要求較高的c n ，例如泡盛灑曲霉、日本曲 霉，這一類往往酶活性較低。p “ 糖化酶作為淀粉糖化劑被廣泛的應用到谷氨酸、檸檬酸、酒精等的發(fā)酵工業(yè)生產上。黑曲霉 生產的糖化酶具有更強的糖化力。黑曲